对羟基肉桂酸乙酯的用途的制作方法

本发明涉及对羟基肉桂酸乙酯应用技术领域，具体涉及对羟基肉桂酸乙酯在医疗领域的新用途。

背景技术：

醛糖还原酶属于醛酮还原酶超家族，是烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(nadph)为辅酶催化醛类或酮类物质还原为相应的醇的单体多肽。普遍存在于神经、血红细胞、晶状体、视网膜等动物体组织器官中，是多元醇通路的关键限速酶。nadph与氧化应激关系密切，在糖尿病并发症和多种氧化应激性疾病的发生发展中发挥重要作用。目前抑制醛糖还原酶的药物主要分天然药物提取物和化学合成药物两类。由于作用不够明显或副作用严重，没有一种醛糖还原酶抑制剂可以在世界范围内使用。因此将醛糖还原酶作为一个药物靶点，筛选具有抑制醛糖还原酶活性的天然药物是研究热点。

对羟基肉桂酸是一种酚酸，主要以酯化或游离酸形式存在于各种果实中，如枣、梨、和甜樱桃等，其具有抗氧化，抗炎和抗微生物等活性。目前，已有利用对羟基肉桂酸的上述活性，开发了多种对羟基肉桂酸的保健产品，但关于对羟基肉桂酸乙酯作为预防和/或治疗糖尿病并发症的药物的开发还没有相关文献报道。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一，即提供对羟基肉桂酸乙酯在医药领域的新用途，以充分发挥对羟基肉桂酸乙酯在医药领域中的价值。

为此，本发明的一个目的在于提出对羟基肉桂酸乙酯的用途。

为达到上述目的，本发明第一方面实施例提出了对羟基肉桂酸乙酯的用途，其以对羟基肉桂酸乙酯作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备醛糖还原酶抑制剂。

根据本发明的对羟基肉桂酸乙酯，在研究其生物活性过程中，发现对羟基肉桂酸乙酯对醛糖还原酶具有明显的抑制作用，醛糖还原酶是多元醇通路的关键限速酶，而糖尿病并发症与糖代谢的多元醇通路有关，醛糖还原酶活性的增高是导致糖尿病慢性并发症的主要原因之一。通过抑制该酶活性可有效改善糖尿病并发症，以发现有效的预防和/或治疗糖尿病并发症的天然药物。

另外，根据本发明上述实施例提出的对羟基肉桂酸乙酯的用途，还可以具有如下附加的技术特征：

所述对羟基肉桂酸乙酯对醛糖还原酶具有抑制作用。

所述对羟基肉桂酸乙酯是从茶花粉中分离纯化而制得的。

本发明第二方面实施例提出了对羟基肉桂酸乙酯的用途，其以对羟基肉桂酸乙酯作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗糖尿病并发症的药物。本发明的对羟基肉桂酸乙酯可制成任何给药方式的医药制品，为各种医药制剂形成。医药品制剂包括溶液剂、糖浆剂、注射剂、乳剂、胶囊剂和软膏皮肤外用剂等。该医药制品中添加有赋形剂、稳定剂、湿润剂、稀释剂、吸收促进剂、ph调节剂和表面活性剂中的至少一种。

本发明第三方面实施例提出了对羟基肉桂酸乙酯的用途，其以对羟基肉桂酸乙酯作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗糖尿病并发症的保健食品。该保健食品中添加有保存剂、赋形剂、稳定剂、湿润剂、吸收促进剂、ph调节剂和表面活性剂中的至少一种。

附图说明

图1为根据本发明实施例的对羟基肉桂酸乙酯对醛糖还原酶的抑制作用示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例和附图说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

本发明提供对羟基肉桂酸乙酯的用途，其主要解决的是现有的抑制醛糖还原酶的药物作用不够明显或副作用严重；为了解决上述问题，本发明提供一种对羟基肉桂酸乙酯的新用途，在研究对羟基肉桂酸乙酯的生物活性过程中，发现对羟基肉桂酸乙酯对醛糖还原酶具有明显的抑制作用，醛糖还原酶是多元醇通路的关键限速酶，而糖尿病并发症与糖代谢的多元醇通路有关，醛糖还原酶活性的增高是导致糖尿病慢性并发症的主要原因之一。通过抑制该酶活性可有效改善糖尿病并发症，以发现有效的预防和/或治疗糖尿病并发症的天然药物。

为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。

实施例一对羟基肉桂酸乙酯的制备

本发明的对羟基肉桂酸乙酯是从茶花粉中分离纯化而制得的，具体包括以下步骤：

s11、提取

准确称取1000g经高速万能粉碎机粉碎后，过筛(40目)后的茶花粉，按料液比1g:10ml的比例添加80％乙醇，于50℃水浴条件下浸提6h，共提取3次，抽滤获得上清液，合并上清液，并于50℃下减压浓缩成浸膏，获得粗提物，4℃冷藏备用。

s12、萃取

将步骤s1获得的粗提物按料液比1g:10ml加入蒸馏水,搅拌溶解,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,均萃取3次,而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩,获得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相。

s13、大孔吸附树脂层析

取步骤s2中的乙酸乙酯相，按料液比1g:10ml加入蒸馏水复溶，振荡，4000r/min离心12min，取上清液加入hp-20型大孔树脂，然后将大孔树脂置于37℃下150r/min的摇床中吸附16h，吸附后的大孔树脂装柱，依次用浓度为0％、10％、30％的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱体积均为5个柱体积，然后收集各洗脱组分，得大孔树脂30％乙醇洗脱相，4℃冷藏备用。

s14、酸解

取步骤s3获得的大孔树脂30％乙醇洗脱相,按料液比0.1g:50ml的比例加入无水乙醇,而后再加入等体积4m的盐酸,于90℃水浴中酸水解90min,酸水解后，将酸解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干，获得大孔树脂30％乙醇洗脱相酸解物。

s15、hsccc制备分离

配置正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶液体系，按照正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水的体积比为4:6:4:6的比例量取各溶剂于分液漏斗中，充分震荡，静置分层，分别收集上相和下相溶液，超声脱气30min，以上相作为hsccc的固定相，下相作为hsccc的流动相；从头到尾进行洗脱，首先将上相溶液(固定相)以30ml/min的流速泵满色谱柱，稳定后，将转速调至850rpm，将下相溶液(流动相)以3ml/min的流速泵入色谱柱中；两相达平衡后(主机螺旋管内流动相与固定相达到动力学平衡，即检测器端口只有流动相被置换出时)由进样阀进入样品溶液，样品溶液为30％乙醇洗脱相酸解物,同时通过紫外检测器检测流出物，紫外检测波长设置为280nm，根据峰行收集各组分。

s16、组分鉴定

将步骤s5收集到的组分按顺序编号，以对羟基肉桂酸乙酯标准品作为对照，利用高效液相色谱、核磁共振、质谱的方法进行鉴定，即可确定某一编号对应的组分为对羟基肉桂酸乙酯。

实施例二对羟基肉桂酸乙酯对醛糖还原酶活性的抑制率的测定

s21、试剂的准备：

磷酸盐缓冲液(pbs)的配制：

准确称量3.31g的na2hpo4·12h2o，加蒸馏水溶解，转移至250ml容量瓶中定容得a液；另取6.36g的nah2po4·2h2o，加蒸馏水溶解，转移至250ml容量瓶中定容得b液；接着，分别移取a、b两溶液至250ml容量瓶定容，使用ph计进行校准使磷酸盐缓冲液ph＝6.2。

醛糖还原酶液的配制：

取100u的醛糖还原酶加入1ml的pbs，即醛糖还原酶的酶活为100u/ml。取10μl的100u/ml醛糖还原酶液，加入990μl的pbs，即醛糖还原酶浓度为10u/ml；取200μl的10u/ml醛糖还原酶液，加入800μ的pbs，即醛糖还原酶浓度为2u/ml。醛糖还原酶液应现配现用。

辅酶nadph的配置：

准确称量4.2mg的nadph，加入50ml的pbs，配成0.1mmol/l的nadph溶液，于-20℃条件下保存备用。

底物dl-甘油醛的配制：

准确称量1.8mg的dl-甘油醛，加入2ml的pbs，配成10mmol/l的dl-甘油醛溶液，于-4℃条件下避光保存备用。

s22、对羟基肉桂酸乙酯对醛糖还原酶的抑制率的测定

用微量移液器分别按表一计量准确移取1、2、3、4四组样液，加入96孔板中，然后96孔板置于37℃恒温10min后，各孔加入22μl的10mmol/l的dl-甘油醛，37℃下恒温反应5min后，于340nm下测定吸光度，测得吸光度a1、a2、a3、a4值；其中，a1值：样液+酶的吸光值；a2值：样液+pbs的吸光值；a3值：溶剂+酶的吸光值；a4值：溶剂+pbs的吸光值。溶剂为甲醇，以槲皮素作为阳性对照，每组实验均测定三次平行。

然后按下面的公式计算抑制率：抑制率(％)＝[1-(a1-a2)/(a3-a4)]×100％

表一各组分的加样量

按上述的方法测定样品对醛糖还原酶的抑制率，然后以样品浓度对醛糖还原酶酶的抑制率作图并进行拟合，得到样品的浓度效应曲线，读取计算ic50值。醛糖还原酶抑制率50％所对应的样品浓度即为样品抑制醛糖还原酶的ic50值。

通过测定，我们得到如图1所示的结果，纵坐标表示抑制率，横坐标表示对羟基肉桂酸乙酯的质量浓度。从图1中可以看出，对羟基肉桂酸乙酯对醛糖还原酶有一定的抑制作用，且随着对羟基肉桂酸乙酯浓度的增大，抑制率也随之增大。阳性对照槲皮素对醛糖还原酶的抑制活性极强，其ic50值为0.62μg/ml，其是一种常见的醛糖还原酶抑制剂。当对羟基肉桂酸乙酯浓度为0.70μg/ml时，它对醛糖还原酶的抑制率达到80％。通过回归曲线计算得对羟基肉桂酸乙酯对醛糖还原酶的ic50值为：0.36μg/ml。可见，对羟基肉桂酸乙酯对醛糖还原酶有较好的抑制作用，而本发明所述的测定方法能够准确的测出对羟基肉桂酸乙酯对醛糖还原酶的抑制率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。