一种钩藤提取物在制备抗炎药物和美白、抗氧化护肤品中的应用的制作方法

本发明属于天然药物
技术领域：
，更具体地，涉及一种钩藤提取物在制备抗炎镇痛药物和美白、抗氧化护肤品中的应用。
背景技术：
：目前抗炎类药物主要分为两大类：甾体类和非甾体类。甾体类抗炎药主要是皮质激素类药物，此类药物虽然有较好的疗效，但是长期使用可引起水盐代谢、糖、脂肪、蛋白质代谢的严重紊乱。非甾体抗炎药是在风湿关节炎的治疗中占主要地位，但长期使用此类药物也会造成严重的毒副作用。如吲哚美辛，在治疗过程中常常会出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻及溃疡，有时还会出现胃出血和穿孔、头痛、眩晕等临床症状。抗炎类中药具有毒性较小，疗效确切和整体治疗的作用。钩藤uncariarhynchophylla(miq.)miq.exhavil始载于《本草原始》，来源于茜草科钩藤属，性凉，味甘，归肝、心包经，具有清热平肝、息风定惊的功效。该品种钩藤分布广泛，是国内药用钩藤的主要品种。钩藤中所含主要化学成分为生物碱类、三萜类、黄酮类、香豆素类、喹喏酸皂苷类、酚类及有机酸等。在我国民间有用钩藤钩茎、根入药治疗风湿关节疼痛和跌打损伤。钩藤主要的药效化学成分为生物碱类，现代钩藤研究主要集中在生物碱的提取工艺及其在心血管系统和神经系统等药效的研究。主要降压、镇静、抗惊厥、抗抑郁和对神经元的保护作用等，对阿尔兹海默症和帕金森综合征也有一定的治疗作用；但是几乎没有对钩藤及其提取物在抗炎、美白等活性方面的研究。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有钩藤应用的不足，提供钩藤生物碱提取物、钩藤叶提取物在制备抗炎药物中的应用。本发明的另一目的在于提供一种钩藤叶提取物在制备抗炎、美白和抗氧化护肤品中的应用。本发明充分利用了钩藤叶提取物中的抗炎活性和美白、抗氧化作用，钩藤生物碱提取物抗炎作用；开拓了钩藤活性成分的应用价值，极大扩大了钩藤的应用范围。本发明上述目的通过以下技术方案实现：一种钩藤叶提取物在制备抗炎药物中的应用。所述药物由钩藤提取物和药学上可接受的辅料制备而成。一种钩藤叶提取物在制备抗炎、美白和抗氧化护肤品中的应用。钩藤叶提取物具有显著的抗炎、美白和抗氧化，除自由基效果，可加入护肤产品中制备抗炎、美白和抗氧化产品。优选地，所述钩藤为钩藤u.rhynchophylla(miq.)miq.exhavil。本发明提供的钩藤叶提取物和钩藤生物碱提取物疗效确切、安全性高，可结合其他药用辅料，制得美白、抗炎类药物及其透皮吸收制剂包括药物、保健品和日化用品等形式。钩藤叶提取物相对于钩藤茎、钩、根或全株提取的生物碱提取物活性成分的差别为：钩藤叶提取物中钩藤生物碱成分亲水性较强，具有较大量的美白、抗氧化作用的非生物碱成分。钩藤生物碱在制备抗炎药物中的应用。优选地，所述钩藤叶提取物包括生物碱和非生物碱，所述生物碱包括18,19-dehydrocorynoxinicacid、异钩藤碱酸、卡丹宾、3β-异二氢卡丹宾、3α-异二氢卡丹宾、钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、喜果苷，所述非生物碱包括绿原酸、金丝桃苷、芦丁、表儿茶素。优选地，所述钩藤生物碱提取物为钩藤茎、钩、根或全草提取的生物碱，所述提取生物碱包括18,19-dehydrocorynoxinicacidb、异钩藤碱酸、卡丹宾、18,19-dehydrocorynoxinicacid、3β-异二氢卡丹宾、3α-异二氢卡丹宾、钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、喜果苷、缝籽嗪甲醚、毛钩藤碱、去氢毛钩藤碱。本发明的钩藤叶提取物由钩藤叶用水煎煮法或回流提取法、超声波辅助法中的一种或多种提取方法提取。优选地，所述钩藤叶提取物的提取方法为：将钩藤叶水提取；或水提取液醇沉处理；或水提取液过大孔树脂，收集乙醇水洗脱液。提取液浓缩干燥得钩藤叶提取物。优选的水提取液提取的料液比为1:5～20，水提取时间为0.5～1.5h，提取1～3次。优选地，所述水提取液醇沉处理方法是提取液浓缩并加乙醇至醇含量40～80％进行醇沉处理；水提液过大孔树脂处理是采用弱极性大孔吸附树脂过滤，收集10％～95％不同比例乙醇洗脱液，浓缩干燥得钩藤叶提取物。用水提取相对用乙醇提取具有色素少，前处理较为安全经济方便等效果，所述钩藤叶提取物的生物碱总含量为≥2％，非生物碱的总含量≥5％。钩藤生物碱的提取方法为：将钩藤茎、钩或全草打粉过筛，采用50～80％乙醇(内含0.1～1％盐酸)以料液比(m/v)1:5～20，每次回流15～30min；提取液浓缩并调至含醇量80％，调碱性放置过夜；上清液回收乙醇，浓缩液调ph至8～10，放置盐析生物碱粗品；乙醇溶解；过极性吸附柱柱，用50～70％乙醇洗脱、蒸干，既得生物碱提取物，钩藤生物碱的生物碱总含量≥10％。优选地，所述应用中钩藤叶提取物制备成透皮吸收制剂或口服制剂。优选地，所述应用中钩藤生物碱提取物制备成透皮吸收制剂或口服制剂。本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种钩藤叶提取物在制备抗炎药物和制备抗炎、美白和抗氧化护肤品中的应用，钩藤叶的抗炎主要成分为提取物的生物碱成分；钩藤叶的美白活性成分主要是提取物中绿原酸、金丝桃苷、芦丁、表儿茶素等非生物碱成分。通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀法和醋酸致小鼠毛细血管通透性变化炎症模型进行抗炎药效验证、通过酪氨酸酶抑制实验验证钩藤叶的美白效果，证明钩藤生物碱提取物具有较强的抗炎活性，疗效确切、安全性高，钩藤叶提取物具有显著的抗炎、美白和抗氧化，除自由基效果。附图说明图1为钩藤叶提取物hplc色谱图，其中x1：绿原酸，x2：未知，x3：表儿茶素，x4：18,19-dehydrocorynoxinicacid，x5：异钩藤碱酸，x6：未知，x7：卡丹宾，x8：3α-异二氢卡丹宾，x9：3β-异二氢卡丹宾，x11：芦丁，x12：金丝桃苷，x13：异去氢钩藤碱，x14：isomerofstrictosidine，x15：异钩藤碱，x16：去氢钩藤碱，x17：strictosidine，x18：钩藤碱，x19：育亨宾，x20：缝籽嗪甲醚，x21：去氢毛钩藤碱，x22：毛钩藤碱，x23：喜果苷。图2为钩藤生物碱提取物hplc图谱，其中x1～x3未知，x4：18,19-dehydrocorynoxinicacidb，x5：异钩藤酸，x6：卡丹宾，x7：18,19-dehydrocorynoxinicacid，x8：阿枯米精，x9：育亨宾，x10：3β-异二氢卡丹宾，x11:3α-异二氢卡丹宾，x12：喜果苷，x13：去氢钩藤碱，x14：异钩藤碱，x15：异去氢钩藤碱，x16：缝籽嗪甲醚，x17：钩藤碱，x18：去氢毛钩藤碱，x19：毛钩藤碱。图3为钩藤叶水提液及水提醇沉液对酪氨酸酶抑制率。具体实施方式以下结合说明书具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1小鼠腹腔毛细血管通透性试验1、实验设计取雄性昆明小鼠，随机分成11组，每组12只。其中实验组给予钩藤叶提取物，钩藤叶生物碱、钩藤叶非生物碱提取物，钩藤钩茎生物碱、非空白组给予同体积的生理盐水；阳性对照为吲哚美辛，剂量7.5mg·kg-1。附实验样品制备方法1.1钩藤叶提取物制备将钩藤叶200g粉末置于圆底烧瓶中，水提取液料液比为1:20，水提取时间为0.5hr.，回流提取2次，提取物浓缩；加入乙醇至含醇量50％-70％，放置过夜上清液回收乙醇，浓缩至含钩藤叶2.5-3.0g/ml，即得钩藤叶提取物。利用hplc-pad-it/tof结合对照品对钩藤叶提取物的液相色谱峰成分进行推断鉴别检测，检测结果如图1示。1.2钩藤叶提取物生物碱部位和非生物碱部位制备将水提醇沉法制备的钩藤叶提取物调至含酸醇量40％～70％，上d001型大孔阳离子交换树脂，分别用水、80％乙醇、80％含氨乙醇洗脱相应的柱体积倍数，将氨醇洗脱液减压浓缩、蒸干作为钩藤叶生物碱部位；将其他溶液合并减压浓缩、蒸干作为钩藤叶非生物碱部位。1.3钩藤生物碱提取物制备取适量钩藤茎粉末(24目筛)，采用70％含酸乙醇，以料液比(m/v)1:15，回流3次，每次20min，合并提取液，浓缩并调至含碱醇量80％放置过夜，上清液回收乙醇，放置盐析生物碱粗品，用乙醇溶解，过吸附柱，用50·～70％乙醇洗脱，蒸干洗脱液既得生物碱提取物。利用hplc-pad-it/tof结合对照品对钩藤生物碱提取物的液相色谱峰成分进行推断鉴别检测，检测结果如图2所示2、实验方法连续给药7天(阳性组最后两天给药)，0.2ml/10g，末次给药前12h禁食。末次给药60min后小鼠尾静脉注射0.5％的伊文思蓝，0.1ml/10g，5min后腹腔注射0.6％的醋酸溶液，0.2ml/只，30min后处死。用10ml生理盐水分多次洗出腹腔内伊文思蓝液，最后加生理盐水至10ml，3000r/min离心15min，取上清液，用生理盐水调零，在紫外-可见分光光度计测定590nm处吸光度(a)值。3、实验结果对醋酸致小鼠毛细血管通透性增加的抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(空白对照组平均a-给药组平均a)/空白对照组平均a×100％。所有药效实验数据用spss19.0软件处理，单因素方差分析进行均数间两两比较，p<0.05有统计学意义结果。实验结果见表1。表1小鼠腹腔毛细血管通透性试验结果*:p＜0.05,**:p＜0.01,***:p＜0.001vs空白组，**剂量(g/kg)项指的是灌胃药量：生药量/kg；但钩茎生物碱低、中、高浓度组是:生物碱总量/kg，其中生药为相应的钩藤叶、钩藤茎和气体的钩藤原株粉末。实施例2二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验1、实验设计取雄性昆明小鼠(雌性小鼠会产生较多的雌激素，雌激素具有一定的抗炎作用，不宜用于抗炎实验)，随机分成11组，每组12只。其中实验组给予钩藤叶提取物，钩藤叶生物碱、非生物碱提取物，钩藤钩茎生物碱、非生物碱提取物，空白组给予同体积的生理盐水，阳性对照为吲哚美辛，剂量7.5mg·kg-1。2、实验方法连续给药7天(阳性组最后两天给药)，0.2ml/10g，末次给药前12h禁食。末次给药60min后于小鼠右耳(两面)涂以二甲苯50μl，30min后处死，用内径为7mm的打孔器沿耳片同一部位打下圆耳片，在十万分之一电子天平上称重，右耳与左耳重量之差即为肿胀度。3、实验结果肿胀抑制率的计算公式为：肿胀抑制率(％)＝(模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度×100％。实验结果见表2，所有药效实验数据用spss19.0软件处理，单因素方差分析进行均数间两两比较，p<0.05有统计学意义。表2二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验*:p＜0.05,**:p＜0.01,***:p＜0.001vs空白组，**剂量(g/kg)项指的是灌胃药量是:生药量/kg；但钩茎生物碱低、中、高浓度组是:生物碱总量/kg，，其中生药为相应的钩藤叶、钩藤茎和气体的钩藤原株粉末。实施例3美白实验1.实验设计将钩藤叶200g粉末置于圆底烧瓶中，水提取液料液比为1:20，水提取时间为0.5hr.，回流提取2次，即得钩藤叶水提液(25mg/ml)，提取物浓缩，加入乙醇至含醇量50％-70％，放置过夜上清液回收乙醇，即得钩藤叶水提醇沉物15.15mg/ml(生药量/ml，相当于钩藤叶提取物4.91mg/ml)2、实验方法(1)配制pbs缓冲液(ph＝6.8，0.2mol/l)精密称取7.8gnah2po4·2h2o置于250ml容量瓶中，用去离子水溶解并定容得a溶液。精密称取17.91gna2hpo4·12h2o置于250ml容量瓶中，用去离子水溶解并定容得b溶液。取a溶液108ml，b溶液100ml，混合均匀，即得。(2)样品溶液的制备用pbs缓冲液将上述钩藤叶水提液、钩藤叶水提醇沉物分别稀释0、1.5、2、3、4、5倍，分别各6个待测液。(3)维生素c样品溶液制备分别精密称取维生素c15.50mg、13.50mg、1.15mg、0.95mg、0.75mg、0.55mg，用pbs缓冲液溶解并定容至10ml，即得。以l-多巴为酶促反应底物，向96孔酶标板中依次加入不同量的pbs缓冲液(ph＝6.8，0.2mol/l)，l-多巴(10mmol/l)，待测样品溶液，酪氨酸酶(250u/ml)，使其最终体积为200μl；其中，依次加入上述各溶液不同剂量见表3。然后置于37℃摇床中孵育10min，立刻测定其吸光度(490nm)。根据酪氨酸酶活性抑制率公式计算钩藤叶水提液、钩藤叶水提醇沉液和维生素c三样品的各测定液的酪氨酸酶抑制率。依钩藤叶水提液、钩藤叶水提醇沉液两样品的各测定液的浓度及酪氨酸酶抑制率画出两测定样品对酪氨酸酶抑制图，见图3。酪氨酸酶抑制率＝[(a-b)-(c-d)]/(a-b)注：公式中a是添加酪氨酸酶，不加酶抑制剂，添加底物时的吸光度；b是添加酪氨酸酶，不加酶抑制剂，不加底物时的吸光度；c是添加酪氨酸酶，加酶抑制剂，添加底物时的吸光度；d是添加酪氨酸酶，加酶抑制剂，不加底物时的吸光度。3、实验结果根据spss19.0软件计算维生素c和实验组的ic50值，因为ic50值越小，抑制酪氨酸酶越强，美白功效越好，故钩藤叶水提醇沉样品(ic50＝4.29mg/ml)略大于钩藤叶水提液样品(ic50＝3.01mg/ml)，说明经水提醇沉处理后，钩藤叶水提液中的美白有效成分主要转移到水提醇沉部位；与维生素c(ic50＝0.325mg/ml)相比，水提醇沉部位(ic50＝1.39mg/ml)酪氨酸酶抑制率约是维生素c的四分之一，说明有较好的美白效果。依钩藤叶水提液、钩藤叶水提醇沉液两样品的各测定液的浓度及酪氨酸酶抑制率画出两测定样品对酪氨酸酶抑制图，见图3。表3美白试验各试剂用量试剂a/μlb/μlc/μld/μl样品溶液002020l-多巴200200pbs缓冲液10512585105酪氨酸酶溶液75757575反应总体积200200200200上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12