本发明涉及uk383367的新用途，具体地涉及uk383367在制备用于减轻肾纤维化相关病症的药物中的应用。
背景技术
随着社会经济发展和人们生活方式的改变，人类疾病谱正在发生变化，慢性肾脏病(ckd)已呈现流行特征。ckd具有患病率高、医疗费用巨大、易合并心血管疾病而导致病死率和致残率高等特点，目前已成为影响我国国民健康的主要疾病。
肾脏纤维化是多种慢性肾脏病(ckd)发展至终末期肾病(esrd)的共同病理途径，在病理上包括肾小球硬化、小管间质纤维化、炎症细胞浸润以及肾实质丢失(小管萎缩、毛细血管闭塞和足细胞丢失)。多项研究表明肾间质纤维化主要是肾脏固有肌成纤维细胞聚集及活化，产生大量细胞外基质(ecm)成分，包括纤维连接蛋白(fibronectin)以及胶原i和胶原iii。ckd发展到肾脏纤维化，一旦进入esrd，则必须依赖肾脏替代治疗，如血液透析、腹膜透析或肾移植来维持生命。因此，延缓或阻断肾脏纤维化是防治ckd进展的关键。
骨形态发生蛋白1(bonemorphogeneticprotein1，bmp1)，又称为前胶原蛋白酶(procollagencproteinase)。bmp1属于骨形态发生蛋白(bmp)的肽酶m12a家族，它诱导骨和软骨发育。与其他bmp不同，它不属于tgfβ超家族。最初发现它通过诱导骨和软骨发育而像其他bmp一样起作用，它属于可以切割前胶原i，ii和iii的c末端的金属蛋白酶类(matrixmetalloproteinases，mmps)，它具有类似astacin的蛋白酶结构域，参与细胞外基质(ecm)的形成。已有文献报道，在前胶原分子的c-末端，bmp1促裂解i型前胶原最终导致肝硬化和肝纤维化相关机制的胶原沉积。另外有文献报道，在慢性肾脏病大鼠模型中，bmp1-3(bmp1的剪接亚型)可通过增加ecm表达和沉积促进肾脏纤维化，给与bmp1-3的特异性多克隆抗体可减少肾脏纤维化，改善肾功能，延长大鼠生存期。
uk383367是bmp1的抑制剂，对mmps具有优异的选择性。
已有研究表明uk383367可以抑制胶原沉积，可以作为抗皮肤的瘢痕形成。目前，尚未有uk383367可以减轻慢性肾脏病的报道。
发明目的：本发明的发明目的在提出uk383367的新适应症，即在制备用于减轻肾纤维化相关病症的药物中的应用。
其中，所述的肾纤维化相关病症为慢性肾脏病、肾间质纤维化中的任意一种。
具体地，所述的肾间质纤维化为单侧输尿管结扎造成的肾间质纤维化。
其中，研究表明，uk383367抑制tgf-β1诱导的bmp1的高表达。
uk383367抑制tgf-β1引起的fn、vimentin、i型以及iii胶原蛋白的高表达。
uk383367抑制单侧输尿管结扎肾组织bmp1的高表达。
uk383367抑制单侧输尿管结扎肾组织细胞外基质沉积。
附图说明
图1为不同浓度uk383367对nrk49f细胞活力的影响；
图2为uk383367(图中简称uk)对tgf-β1诱导的bmp1表达及nrk49f细胞活化的影响，westernblot分别检测bmp1、fn1、vimentin以及collageni的表达；
图3为uuo两周后三组小鼠左侧肾脏行masson染色结果。
图4为pcr检测了uuo术一周后，三组小鼠肾组织中fn1、collageni、collageniii和tgf-β1的表达；
图5为westernblot检测了uuo术一周后，三组小鼠肾组织fn1和bmp1的表达；
具体实施方式
下面通过具体的实施例详细说明本发明。
本发明实施例中使用的方法简单介绍如下：
(1)单侧输尿管梗阻性(unilateralureteralobstruction，uuo)肾病模型：
选用c57/b6j雄性小鼠，以45mg/kg的戊巴比妥腹腔注射麻醉后，于无菌条件下开放腹腔，钝性分离左侧输尿管，于输尿管上1/3处和下1/3处分别结扎输尿管，然后逐层关闭腹腔。于术后7天处死小鼠，并留取sham组左侧和uuo组手术侧肾组织标本。
(2)肾组织masson染色
1)常规乙醇脱水；；
2)常规石蜡包埋，3μm切片；
3)二甲苯脱蜡水化：二甲苯(i)15min---二甲苯(ii)15min---100％乙醇5min---95％乙醇5min---80％乙醇5min---75％乙醇5min---蒸馏水洗5min；
4)组织切片用bouin’s液56度1h；然后用自来水冲洗10min，至黄色消退；
5)苏木素染细胞核15min-20min，水洗；
6)用1％盐酸乙醇分化数秒，水洗；
7)氨水返蓝数秒；自来水冲洗10min；
8)masson红染液30s，自来水洗数秒；
9)亮绿1-2min，自来水洗数秒(边水洗边镜下观察，直至红绿蓝三色分辨清晰即可)
10)95％乙醇1min，吹干；
11)二甲苯透明3min，3次
12)中性树脂封片，正置显微镜下观察肾脏病理结构改变，摄片。
(3)实时荧光定量pcr(real-timepcr)
组织和细胞样品处理：
组织和细胞总rna抽提采用trizol一步法。实验所用耗材均已去rna酶，配试剂用的水为高压后的depc水。
组织rna提取：冰上称取肾组织10-15mg，置2mlep管中，先加入700μltrizol，匀浆后再加入300μl，上下颠倒混匀后室温静置5min；加入氯仿200μl，混匀，室温静置5min，此时会出现分层；4℃，12,000g离心15min；将上层水相转入新的1.5mlep管(一般取400μl左右)，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，然后室温静置10min，4℃，12,000g离心10min；弃去上清，在沉淀加入1ml预冷的75％的乙醇，4℃，7,500g离心5min，为了提高rna的纯度，可选择再清洗一次；最后弃上清，倒置放在纸上，空气中干燥10min，加入20μldepc水。根据od260计算rna浓度，即刻逆转录或-80℃短期保存。
细胞总rna提取：处理好的细胞6孔培养板，按每孔1mltrizol加入，将细胞吹打下来，转至1.5mlep管中。接下来操作步骤同上。
使用梯度pcr仪，取500ng质量总rna进行逆转录，反应体系为10μl。按下列组份配制rt反应液(反应液配制在冰上进行)。
表1.逆转录反应体系
轻柔混匀离心后，放入梯度pcr仪内进行反转录反应，条件为：37℃15min，85℃5sec，4℃保持。反应后的cdna用depc水稀释20倍至200μl，用于后续实时荧光定量pcr反应。cdna短期4℃冰箱保存，长期-20℃储存。
采用罗氏sybrgreenpcr方法，反应体系为25μl，见表2。
表2.real-timepcr反应体系(25μl)
混匀，稍离心，在abiprism7500荧光定量pcr仪中进行pcr扩增，反应条件为：95℃，10min；然后95℃，15s和60℃，1min循环35次。采用参照基因δδct法计算目的基因mrna表达水平的相对量：各基因mrna的表达水平使用相对定量法计算。
(4)免疫印迹(westernblot)法：
组织和细胞蛋白样品制备：
将收集的细胞中加入4℃预冷的ripa蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂cocktail，使用浓度1:100)，组织加入裂解液后进行匀浆；然后冰上裂解静置15min；4℃，15,000×g离心30min，转移上清至新的ep管；用bca法测定蛋白浓度；将定量后蛋白成比例加入5×上样缓冲液，100℃变性10min后迅速转至冰上冷却，根据蛋白浓度按30-50μg分装，-80℃保存。
蛋白浓度测定：使用bca蛋白浓度测定试剂盒。先溶解蛋白标准品，取一定量蛋白标准品，用0.9％生理盐水稀释，使其终浓度为0.5mg/ml；再根据样品数量，配制bca工作液(按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b)，充分混匀；将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，不足20μl用生理盐水补足到20μl；加2μl体积样品到96孔板的样品孔中，生理盐水溶液补足至20μl；各孔加入200μlbca工作液，放在37℃孵箱孵育30min；用酶标仪595nm处检测吸光度，然后根据标准曲线计算出蛋白浓度。
免疫印迹操作过程：
凝胶制备：1)10％分离胶：双蒸水1.9ml，30％丙烯酰胺1.7ml，1.5mtris-hcl(ph8.8)1.3ml，10％sds0.05ml，10％ap0.05ml，temed0.002ml。2)15％分离胶：双蒸水1.1ml，30％丙烯酰胺2.5ml，1.5mtris-hcl(ph8.8)1.3ml，10％sds0.05ml，10％ap0.05ml，temed0.002ml。3)5％浓缩胶配方：双蒸水3.4ml，30％丙烯酰胺0.83ml，1.5mtris-hcl(ph6.8)0.63ml，10％sds0.05ml，10％ap0.05ml，temed0.005ml。
电泳：nlrp3蛋白上样量为30-50μg、caspase-1蛋白上样量为150-200μg；电泳时积层胶恒压60v1h，分离胶恒压150v1h，溴酚蓝指示剂至分离胶底部即电泳结束。
转膜：电泳结束后，卸下玻璃板，取下凝胶，置于转移缓冲液中10min；剪pvdf膜在甲醇中浸泡1-2min，然后转移至转移缓冲液中浸泡10min；制作三明治夹心(凝胶、膜、滤纸)，小心赶走气泡，装于转移电泳槽中，使pvdf膜朝向阳极，凝胶对着阴极。转膜为恒流300ma，1h。
封闭：转膜后用5％的脱脂牛奶封闭，置于摇床中，室温1h。
孵育一抗：将pvdf膜加入适当比例pbs稀释的一抗，置于摇床上，室温孵育1h，然后4℃过夜。
洗涤：第二天将膜取出，室温复温30min，pbst洗4次，每次10min。
孵育二抗：用pbs稀释辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，hrp)标记的二抗，摇床上室温孵育1h。
洗涤：用pbst洗5次，10min每次，将pvdf膜滴加ecl化学发光液，使用凝胶成像系统扫描，并定量分析条带的光密度值。
实施例1高浓度uk383367在nrk49f细胞中能够抑制细胞的活力。
应用大鼠成纤维细胞系(nrk49f)，铺到96孔板中在100μl培养基中培养。将细胞在co2培养箱中于37℃培养24小时。将10μl不同浓度(100nm、200nm、300nm、400nm、800nm、1000nm)的uk383367加入板中。将培养板在培养箱中孵育24小时。使用重复移液器向板的每个孔中加入10μlcck-8溶液。注意不要在孔中引入气泡，因为它们会干扰od读数。将培养板在培养箱中孵育1-4小时。使用酶标仪测量450nm处的吸光度。结果如图1所示。
结果分析：100nm、200nm的uk383367对nrk49f细胞活力影响不太，而随着uk383367剂量的增高，对细胞活力的抑制比较明显，呈一个剂量依赖性。所以我们选择100nm和200nm的浓度进行下面的实验。
实施例2uk383367能够抑制tgf-β1诱导的nrk49f细胞活化。
应用大鼠成纤维细胞系(nrk49f)，单独tgf-β1处理组中，利用tgf-β1(10ng/ml)处理24小时；uk383367处理组中，预先30min将uk383367以不同浓度(100、200nm)加入细胞，随后利用tgf-β1(10ng/ml)处理24小时。westernblot分别检测bmp1、fn1、vimentin以及collageni的表达，结果如图2所示。
结果分析：tgf-β1在nrk49f细胞中可以诱导bmp1、fn1、vimentin以及collageni表达水平增高，而uk383367可以明显抑制tgf-β1引起的bmp1、fn1、vimentin以及collageni的高表达。
实施例3uk383367抑制单侧输尿管结扎(uuo)小鼠肾组织肾间质纤维化
取体重20～22g的雄性c57/b6j小鼠，分为sham组、uuo组合以及uk383367治疗组。sham组和uuo组小鼠每日单次腹腔注射等体积生理盐水，uk383367治疗组腹腔注射5mg/kg，注射一天以后，行单侧输尿管结扎术(uuo)作为肾间质纤维化模型，手术后继续每日单次腹腔注射生理盐水或uk383367。术后7天将三组小鼠处死，并留取sham组左侧以及uuo组和uk383367治疗组uuo侧肾组织。分别在sham组左侧以及uuo组和uk383367治疗组uuo侧肾组织中行masson染色，结果如图3所示。
结果分析：染色的结果显示与sham组相比，uuo一周后，肾组织出现明显的间质纤维化，而uk383367治疗组小鼠肾间质纤维化较uuo组明显减轻。
实施例4pp242抑制单侧输尿管结扎(uuo)小鼠细胞外基质沉积
取体重20～22g的雄性c57/b6j小鼠，分为sham组、uuo组合以及uk383367治疗组。sham组和uuo组小鼠每日单次腹腔注射等体积生理盐水，uk383367治疗组腹腔注射5mg/kg，注射一天以后，行单侧输尿管结扎术(uuo)作为肾间质纤维化模型，手术后继续每日单次腹腔注射生理盐水或uk383367。术后7天将三组小鼠处死，并留取sham组左侧以及uuo组和uk383367治疗组uuo侧肾组织。利用pcr检测了uuo术一周后，三组小鼠肾组织中fn1、collageni、collageniii和tgf-β1的表达；westernblot检测了uuo术一周后，三组小鼠肾组织fn1和bmp1的表达，结果如图4和图5所示。
结果分析：uuo术后一周的肾组织中，fn1、collageni、collageniii和tgf-β1mrna水平的表达较sham组明显升高，表明有更多细胞外基质沉积；而uk383367可以显著抑制uuo引起的fn1、collageni、collageniii和tgf-β1的高表达，其差异有统计学意义(p<0.05)。uuo术后一周的肾组织中，fn1和bmp1蛋白水平的表达较sham组都明显升高；而uk383367可以显著抑制uuo引起的fn1以及bmp1的高表达，其差异有统计学意义(p<0.05)。