红景天苷及其类似物在胰腺脱细胞支架动态灌注再种植胰岛中的用途的制作方法

本发明涉及一种胰腺组织工程领域，特别是涉及红景天苷及其类似物在三维动态灌注再种植胰岛构建功能性胰腺组织中的新用途，具体涉及红景天苷及其类似物在减轻胰岛提取中机械损伤和拮抗胰腺脱细胞支架动态灌注再种植过程中胰岛中心乏氧，改善胰岛功能发挥，构建具有长期稳定血糖调控功能的组织工程胰腺中的用途。

背景技术

糖尿病是以血糖升高为特征的严重危害人类健康的全球性疾病。其中1型糖尿病是由自身免疫性t细胞对β细胞攻击，造成胰岛素分泌量绝对缺乏的自身代谢性疾病，必须终身依赖外源性胰岛素的注射。胰岛或胰腺移植作为胰岛素依懒型糖尿病较理想的治疗方法，是目前再生医学研究领域的热点，然而供体组织来源短缺远不能满足庞大的患者群体的临床需求。

胰腺脱细胞支架具有仿真三维超微结构，且较大程度的保留原有ecm成分和活性因子，为再种植细胞功能发挥提供了理想微环境，是构建功能性胰腺组织理想的支架来源。胰岛是构建功能性胰腺组织的理想种子细胞，然而经胶原酶p提取破坏了胰岛微血管系统，同时在分离和移植过程中由炎症、机械损伤、低氧和局部缺血导致的氧化应激易引起胰岛损伤和功能障碍。因此，再种植胰岛抗缺血乏氧、抗炎是构建功能性胰腺组织急需解决的难题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种效果确切的红景天苷及其类似物在胰腺脱细胞支架动态灌注再种植胰岛中的用途。

本发明的技术解决方案是：

一种红景天苷及其类似物在制备胰腺脱细胞支架三维动态灌注再种植胰岛中拮抗胰岛机械损伤和中心乏氧、促进胰岛功能的制剂中的应用。

所述拮抗胰岛机械损伤和中心乏氧、促进胰岛功能是通过抑制ros-txnip轴介导的nlrp3炎症小体激活发挥。

红景天苷及其类似物，化学结构通式如下：

其中r1表示糖基供体，为葡萄糖、半乳糖、n-乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖等；r2表示苯环上的取代基-oh；x＝1-3；包括r1为d(+)葡萄糖，x＝2，羟基(-oh)连接在苯环4位的红景天苷。

所述红景天苷及其类似物为：苯环4-位为酚羟基、糖基供体为葡萄糖、半乳糖、n-乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖，具体名称如下：1-(4-羟基)苯甲基-β-d-吡喃葡萄糖苷、1-(4-羟基)苯甲基-β-d-吡喃半乳糖苷、2-(4-羟基)苯乙基-β-d-吡喃葡萄糖苷(红景天苷)、2-(4-羟基)苯乙基-β-d-吡喃半乳糖苷、3-(4-羟基)苯丙基-β-d-吡喃葡萄糖苷、3-(4-羟基)苯丙基-β-d-吡喃半乳糖苷、1-(4-羟基)苯甲基-2-乙酰氨基β-d-吡喃葡萄糖苷、2-(4-羟基)苯乙基-2-乙酰氨基-β-d-吡喃葡萄糖苷、3-(4-羟基)苯丙基-2-乙酰氨基-β-d-吡喃葡萄糖苷、1-(4-羟基)苯甲基-2-氨基-β-d-吡喃葡萄糖苷、2-(4-羟基)苯乙基-2-氨基-β-d-吡喃葡萄糖苷或3-(4-羟基)苯丙基-2-氨基-β-d-吡喃葡萄糖苷。

本发明景天苷及其类似物作为胰腺脱细胞支架三维动态灌注培养再种植胰岛过程中，作为条件培养基有效成分，拮抗胰岛机械损伤和中心乏氧，促进胰岛功能发挥。本发明效果确切。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1是胰岛大体的形状、染色示意图；其中(a)分离、纯化的胰岛大体形态图；(b)dtz鉴定染色图；(c-d)荧光染色图(胰岛素-红色，细胞核-蓝色)。

图2是分离提取的胰岛在不含(含)红景天苷时，live/dead细胞活性检测示意图；可以明显看到加入红景天苷后中心死细胞数显注减少。

图3是含有红景天苷的三维动态灌注再种植胰岛过程及机制模式图。

图4是（含）不含红景天苷灌注培养组nlrp3、il-1β、caspase-1基因相对表达情况示意图；其中：胰岛分离、培养3d作为对照组（1.0）；加入2.5μm红景天苷培养3d为实验组，*p＜0.05。

图5是(含)不含红景天苷灌注培养组txnip蛋白表达情况示意图；红景天苷组表达显著降低。

图6是（含）不含红景天苷灌注培养组ros含量检测示意图；其中：胰岛分离、培养3d作为对照组（100%）；加入2.5μm红景天苷培养3d为实验组，*p＜0.05。

具体实施方式

一种红景天苷及其类似物在制备胰腺脱细胞支架三维动态灌注再种植胰岛中拮抗胰岛机械损伤和中心乏氧、促进胰岛功能的制剂中的应用。

所述拮抗胰岛机械损伤和中心乏氧、促进胰岛功能是通过抑制ros-txnip轴介导的nlrp3炎症小体激活发挥。

所述红景天苷及其类似物为：苯环4-位为酚羟基、糖基供体为葡萄糖、半乳糖、n-乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖，具体名称如下：1-(4-羟基)苯甲基-β-d-吡喃葡萄糖苷、1-(4-羟基)苯甲基-β-d-吡喃半乳糖苷、2-(4-羟基)苯乙基-β-d-吡喃葡萄糖苷(红景天苷)、2-(4-羟基)苯乙基-β-d-吡喃半乳糖苷、3-(4-羟基)苯丙基-β-d-吡喃葡萄糖苷、3-(4-羟基)苯丙基-β-d-吡喃半乳糖苷、1-(4-羟基)苯甲基-2-乙酰氨基β-d-吡喃葡萄糖苷、2-(4-羟基)苯乙基-2-乙酰氨基-β-d-吡喃葡萄糖苷、3-(4-羟基)苯丙基-2-乙酰氨基-β-d-吡喃葡萄糖苷、1-(4-羟基)苯甲基-2-氨基-β-d-吡喃葡萄糖苷、2-(4-羟基)苯乙基-2-氨基-β-d-吡喃葡萄糖苷或3-(4-羟基)苯丙基-2-氨基-β-d-吡喃葡萄糖苷。

本发明所涉及的红景天苷及其类似物，纯度为99.0％以上，为发明申请人自行制备(相关制备方法及表征见于发明申请人所发表论文bioorgmedchem2011,19:5577-5584；chempharmbull2010,58:1627-1629；chempharmbull2010,59:1045-1047.)；或采用市售产品。

(1)胰岛的提取与鉴定

10％水合氯醛腹腔注射麻醉，经胆总管缓慢注入包含0.5mg/ml胶原酶p的hbss溶液，沿肠壁分离胰腺转移至50ml离心管中，37℃水浴静止消化约15min；剧烈振摇1min使呈细沙状分散，加入10倍体积的4℃预冷hbss液终止消化。过滤、离心、弃上清、收集沉淀；混悬于10ml25％的ficoll400溶液中，依次加入23％、20％和11％的ficoll400溶液，水平离心20min，收集20％～11％界面上的细胞层，hbss液洗涤离心，沉淀悬浮于六孔板中，用双硫腙(dithizone，dtz)对胰岛细胞进行特异性染色，显微镜下胰岛细胞为猩红色，非胰岛细胞不着色(附图1)，胰岛纯度为95％左右，活力为90％左右。

(2)胰腺脱细胞支架的制备与评价

sd大鼠(300-350g)腹腔注射水合氯醛麻醉，75％乙醇消毒，打开腹腔，采用22g留置针穿刺门静脉；离断并结扎胃左静脉、脾静脉、肠系膜上静脉的胰腺分支；仔细分离胰腺与胃、小肠、脾脏、结肠、网膜之间的连接，最后结扎并离断胰腺与十二指肠之间的连接；依次通过含有0.2g/ledta和25000u/l肝素钠的pbs缓冲液、1％tritonx-100/0.1％氨水、ddh2o灌注，10kgy钴60辐照灭菌；

4％多聚甲醛固定脱水，石蜡包埋切片，he染色观察；quant-ittmdsdna测定试剂盒(invitrogen)进行dna含量分析，琼脂糖凝胶电泳检测dna片段长度；sem观察超微结构；免疫荧光染色检测胶原i、iv、纤维连接蛋白、层粘连蛋白；sircol,blyscanandfastinassay试剂盒定量分析主要胞外基质成分。

成功获取组成相对稳定、结构完整、具有良好生物相容性及较低免疫原性的胰腺脱细胞支架。(具体理化性能及生物相容性评价见发明人已授权专利，用于胰腺脱细胞支架的试剂盒、支架的制备及再种植方法，zl201410590216.8)

(3)红景天苷处理及三维动态灌注培养

0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0μm红景天苷与胰岛共培养24h，经含有0.125％trypsin/edta的无钙ham’sf10培养基温和震荡收集裂解为单细胞，70μm膜过滤去除细胞碎片，离心重悬，台盼蓝染色评价红景天苷对胰岛的毒性，通过细胞活性检测试剂盒观察评价细胞状态(附图2)；trizol提取总rna，1μgrna经逆转录获得cdna，pcr扩增评价血红素加氧酶ho-1、bcl-2和凋亡抑制基因survivin表达情况，18srna为内参归一化处理；ripa裂解提取总蛋白，20μg蛋白上样经10％sds-page分离，pvdf转膜，2％bsa封闭，一抗p-erk1/2(1:1,500)、erk1/2(1:1,000)、p-akt(1:1,000)、akt(1:1,000)、β-actin(1:1,000)、ho-1(1:1,000)、nrf2(1:1,000)、laminb1(1:2,000)孵育，4℃过夜，igg二抗孵育2h。获得最佳浓度用于后续三维灌注培养实验。

三维动态反应器中加入最佳浓度的红景天苷灌注24h，将300个胰岛悬浮于2ml培养基，分三次经门静脉注入，静置2h，继续循环灌注1、3、5、7d，组织固定切片染色评价insulin表达并经cd31染色评价胰岛体外血管重建情况；rt-pcr检测ins1和ins2表达。

红景天苷处理及未处理的胰岛再种植组织匀浆、加入含有1％蛋白酶抑制剂的ripa裂解细胞，bca蛋白试剂盒检测总蛋白含量，20-30μg蛋白上样、电泳、pvdf转膜，abcam一抗caspase-1、β-actin、il-1β、il-18、nlrp3、txnip、hmgb1、hif-1α、nf-κb4℃孵育过夜，pbst漂洗，hrp结合二抗室温孵育2h，根据说明书要求检测化学发光，通过imagej软件处理获得蛋白相对表达情况；经rt-pcr检测caspase-1、β-actin、il-1β、il-18、nlrp3、txnip、hmgb1、hif-1α、nf-κb表达情况。(附图3-5)

根据elisa检测试剂盒说明检测胰岛再种植24h、48h灌注培养液中il-1β、hmgb1浓度，并作归一化处理。dcfh-da探针检测组织匀浆中ros含量，525nm检测dcf相对荧光密度(附图6)。

上述实施例结果表明，红景天苷预保护后，由胰岛分离及中心乏氧导致的损伤可以得到明显改善(红色荧光表明死亡细胞)；txnip表达升高能够介导氧化应激、炎症反应而引起胰岛β功能下降、细胞凋亡及胰岛素抵抗，在加入红景天苷后，与对照组相比较ros含量、txnip、nlrp3相对表达呈正相关的显著降低，因此红景天苷可通过下降ros、炎症介质水平，改善再种植胰岛功能。红景天苷结构中含有的酚羟基在其发挥胰岛保护功能中具有重要作用，本专利所述红景天苷类似物因结构相似对再灌注胰岛功能发挥皆具有明显保护作用，且通过抑制ros-txnip轴介导的nlrp3炎症小体激活发挥。红景天苷及其类似物在胰腺脱细胞支架再种植胰岛，进而构建功能性组织工程胰腺中具有显著应用价值。