一种明胶海绵及其制备工艺的制作方法

本发明涉及一种海绵及其制备工艺，属于医药
技术领域：
，特别涉及一种具有优异的生物相容性的明胶海绵及其制备工艺。
背景技术：
国际上许多发达国家目前都在研究、开发、利用明胶。尤其对它的医用价值的研究、开发、利用给予重视，其中以美国处于领先地位。我国许多科研部门也在积极地将明胶用于人们的日常生活中。明胶依据生产原料、生产方式和产品质量、产品用途不同，分为食用明胶、药用明胶、工业明胶、照相明胶、以及皮胶、骨胶。主要应用于食用明胶、生物膜材料、医用纤维、组织修复与替代、工业明胶。现有明胶的生产方法主要有石灰乳法和盐酸法，尚未出现一种简单可大规模生产明胶并制成明胶海绵的制备工艺，也是本领域技术人员急需解决的技术难题。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种简单可大规模生产明胶并制成明胶海绵的制备工艺。该明胶海绵产品为以无菌状态供应并一次性使用的明胶止血海绵，适用于对毛细血管、静脉和动脉止血，以及弥漫性出血。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供一种明胶海绵的制备工艺，包括以下步骤：(1)明胶原材料进行前处理；(2)配灰、预浸灰、切碎、浸灰、退灰；(3)中和、水洗、熬胶、真空均质；(4)制备明胶海绵；(5)将明胶海绵进行内包装、灭菌、外包装。进一步地，步骤(1)中，所述前处理为：将不同种类、不同部位的皮料分开处理，切成10cm宽的条状；所述皮料选自干皮或鲜皮、牛皮或猪皮、黄牛皮或水牛皮、上剖皮或下剖皮、头皮、脚皮中的一种或多种。进一步地，步骤(2)中，所述配灰为：将生石灰先加水配成厚浆，1公斤石灰加水1.2-1.5公斤，存放12-18天左右，加水稀释，过滤掉粗颗粒，备用。进一步地，步骤(2)中，所述预浸灰为：用含约1％氧化钙的石灰水浸泡皮料2-3天。进一步地，步骤(2)中，所述切碎为：将皮料切成小于10cm3的块，切得大小应当相近。进一步地，步骤(2)中，所述浸灰为：用石灰水浸泡皮料；浸灰时，石灰水内氧化钙含量控制在2-4％。进一步地，步骤(2)中，所述退灰为：在不断搅拌下，每30分钟换水一次，共10-15次左右；以后每1小时换水一次；原料和水的比例每次应为1∶6左右；24-36小时完成退灰，ph为9.5左右。进一步地，步骤(3)中，所述中和为：先加水使皮料浸没在水中，开动搅拌，将已稀释一倍以上水的盐酸溶液慢慢加入水内，保持ph为3左右，中和开始时，每30分钟加酸一次，4小时后，每1小时加酸一次，约8小时加完全部酸，继续搅拌4-8小时。进一步地，步骤(3)中，所述水洗为：不停搅拌，每1小时换水一次，共换10次左右；水洗后皮料的ph值应符合5.5左右。进一步地，步骤(3)中，所述熬胶为：先放一定量的水至熬胶锅，加热至熬胶最低温度55℃，然后将水洗好的皮料倒入熬胶锅，再加水使皮料刚好浸没，缓慢升温至熬胶温度65-100℃，ph应控制在5.5左右。进一步地，步骤(3)中，所述真空均质为：明胶溶液放入真空均质机中，转数控制在70-80转/分，真空度设定在-0.9pa，真空至无气泡。进一步地，步骤(4)中，所述制备明胶海绵具体步骤为：将经均质后的明胶装入已灭菌的冻干盘中，然后将冻干盘装入冻干机干燥箱中；制品从室温冷冻到-40℃以下，保温不少于4小时，进入真空作业，真空状态下自然升温到5℃后加热升温至30-40℃，使制品成白色海绵片状。本发明提供一种明胶海绵，由如上所述的制备工艺制得。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明以无菌状态供应并一次性使用的明胶海绵，该产品能被降解吸收，组织学反应良好，能够更好地促进伤口愈合；(2)本发明的产品明胶海绵具有良好的理化性能和生物学性能，不释放出任何对患者产生副作用的物质，具有良好的生物相容性，体内外安全性实验无毒副作用；经试验，有效期长达两年；(3)本发明的产品明胶海绵适用于对毛细血管、静脉和动脉止血，以及弥漫性出血，可广泛使用于各种创伤及各类手术创面止血。附图说明图1的(a)和(b)分别为效果实验例2中明胶海绵扫描电镜剖面图和平面图。具体实施方式现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。本发明以无菌状态供应并一次性使用的可吸收性明胶止血海绵，该产品适用于对毛细血管、静脉和动脉止血，以及弥漫性出血，可广泛使用于各种创伤及各类手术创面止血。可吸收性明胶止血海绵是一种应用到出血创面，具有止血功效的医用材料。经包装灭菌后的产物应储存在相对湿度不超过65％、无腐蚀性气体、阴凉、干燥、通风良好的室内。实施例11.1原料皮料：干皮或鲜皮、牛皮或猪皮、黄牛皮或水牛皮、上剖皮或下剖皮、头皮、脚皮。不同种类的皮料要分开，不同部位的皮也要分开处理。去油：鲜猪皮上的油较多，用刀刮去。毛猪皮先用5％浓石灰水或0.5～1％的硫化钠溶液浸泡，将毛除去。大块的皮切成10cm宽的条状。1.2配灰生石灰先加水配成厚浆，1公斤石灰加水1.2-1.5公斤，存放15天左右，加水稀释，过滤掉粗颗粒，备用。配灰在配灰池中进行，按所需浓度加水和厚浆，在不断搅拌下，用泥浆泵将石灰水打入预浸灰池。1.3预浸灰预浸灰的作用是使初步膨胀，除去皮上的血污、脏物和臭味；另外由于皮和石灰作用使皮变得硬挺，切皮时较易切断。预浸灰在预浸池内进行，用含约1％氧化钙的石灰水浸泡皮料2天。1.4切碎切碎的目的是加快浸灰和熬胶的速度。用切皮机将皮料切成小于10cm3的块。切得大小应当相近，使浸灰效果一致。1.5浸灰用石灰水浸泡皮料。浸灰时，石灰水内氧化钙含量控制在2-4％(比重1.015-1.035)。气温高时采用低浓度，气温低时采用高浓度。浸灰时石灰水量是湿皮的4倍，ph控制在12-12.5，温度控制在10℃左右，最高不能超过20℃。浸灰达到终点后，将石灰水放掉。1.6退灰退灰的目的是去除皮料吸附的石灰和其他杂物(如溶解蛋白质等)。退灰在中和池内进行，在不断搅拌下，每30分钟换水一次，共10次左右。以后每1小时换水一次。原料和水的比例每次应为1∶6左右，一般24小时可完成退灰。退灰是否彻底，用酚酞试液检查，取一块皮，滴几滴酚酞指示剂于皮上面，当呈淡红色(ph为9.5左右)时，即说明退灰可结束，否则需继续退灰。1.7中和中和即用酸来去除皮中胶原和氧化钙结合的钙盐。先加水使皮料浸没在水中，开动搅拌，将已稀释一倍以上水的盐酸溶液慢慢加入水内，保持ph为3左右，中和开始时，每30分钟加酸一次，4小时后，每1小时加酸一次，约8小时可加完全部酸，继续搅拌4-8小时。1.8水洗水洗是用清水去除中和时多余的酸及生成的盐类。不停搅拌，每1小时换水一次，共换10次左右。水洗后皮料的ph值应符合熬胶时的要求，一般为5.5左右。1.9熬胶先放一定量的水至熬胶锅，加热至熬胶最低温度55℃，然后将水洗好的皮料倒入熬胶锅，注意投井下石松，不使成团。然后再加水使皮料刚好浸没，缓慢升温至熬胶温度65-100℃，ph应控制在5.5左右。鲜猪皮熬胶温度控制在55-100℃，鲜牛皮控制在75-100℃。1.10真空均质均质罐每批首次均质前，需经消毒处理后使用。将均质罐对罐内进行浸泡，浸泡后用纯化水冲洗罐内壁不少于3次，直至目测无残留物后，再用冰乙酸缓慢冲洗罐内壁及扇叶，冰乙酸附着时间不少于30分钟。用纯化水冲洗罐内壁不少于3次，直至罐内壁无酸味后，人工用洁净抹布擦洗罐内壁及扇叶，擦洗次数不少于3遍，然后用纯化水冲洗3遍，至冲洗水澄清透明，再用75％酒精冲洗罐内表面和罐中搅拌装置，自上而下连续冲洗3遍，再用纯化水冲洗6遍，罐内搅拌装置、每个叶片均要冲洗6遍，检验员应及时取样进行微生物限度检查。待检验合格后，将透析后ph值5.0-5.5范围内的胶原蛋白放入真空均质机中，转数控制在70-80转/分，真空度设定在-0.9pa，真空至无气泡。1.11灌装将明胶溶液装入已灭菌的冻干盘中，然后将冻干盘装入冻干机干燥箱中。1.12冻干制品从室温冷冻到-40℃以下，保温不少于4小时，进入真空作业，真空状态下自然升温到5℃后加热升温至30-40℃，使制品成白色海绵片状。1.13内包装从冻干机干燥箱中取出冻干制品，按要求的规格分切好，安装核对批号无误，将包装机台面用75％酒精擦拭消毒后，进行产品内包装。包装机在每次包装前都应核对设定的上加热、下加热、密封温度是否设定在上加热为80℃±5℃、热封在140℃±5℃。内包装在进行产品包装前应连续冲裁不少于20个空包装，经检查后再进行产品包装。核对复合膜袋打码是否准确、封口机温度设定在220℃，速度设定为6次/min，将完成一层内包装的产品装入复合膜袋内封口。1.14灭菌将内包好的产品加入周转箱按gb18280-2000idtiso11137:1995《医疗保健品灭菌确认和常规控制要求辐射灭菌》选择25kgy剂量。1.15外包装将经辐射灭菌并检验合格的产品连同说明书装入打好批号的中包装盒内并放入合格证，最后将中包装装入大包装箱内，大包装箱外盖好生产批号及灭菌日期等。效果实验例1生物相容性是生物医学材料极其重要的性能，为确保材料使用于人体后的安全性，依据gb/t16886.1—2001中对明胶制品的生物相容性试验项目要求，参照陈奇主编《中药药理实验方法》北京：人民卫生出版社，1994.46—108提供的试验方法，将本公司生产的明胶海绵，按1.25cm/ml的配比，用生理盐水浸泡24小时，取浸提溶液进行了急性毒性试验、刺激性试验、过敏性试验和溶血性试验、细胞毒性试验及用明胶海绵进行了皮下植入试验。2.1.无菌按照《中华人民共和国药典》2010版二部附录xih的规定进行检测，结果符合规定：产品经co-60射线灭菌后为无菌。2.2.细菌内毒素按照《中华人民共和国药典》2010年版二部附录xie方法进行检测，结果符合规定：细菌内毒素达到≤0.5eu/mg。2.3.全身急性毒性取浸提液按gb/t16886.11进行检测：试验方法：选用健康小白鼠20只，体重在17-23g，雌雄各平，随机分为实验组和对照组。取浸提液对实验组小白鼠进行腹腔注射，对照组注射生理盐水，上、下午各一次，注射剂量为0.3ml/10g体重，连续7天，观察其体征情况。试验结果：急性毒性试验中未见中毒反应，小白鼠全部成活，体重增加。实验组和对照组体重无明显差异。说明本试验所用明胶海绵不会引起急性中毒症状。2.4.细胞毒性取浸提液按gb/t16886.5中浸提液法进行检测，结果符合规定：细胞毒性试验是医用材料生物安全性评价中第一阶段的筛选试验。1983年，由mosman首次报道了一种快速评价细胞增殖和细胞毒性的比色分析法(mtt比色法)目前已被广泛应用于医用材料的生物相容性评价。试验方法：本实验采用mtt比色法检测胶原蛋白海绵的浸提液对成纤维细胞2、4、7天相对增殖率的影响，评价明胶海绵的细胞毒性。待测明胶海绵1cm2加入10ml细胞培养液，置37℃静置24小时取上清液作为100％浓度的材料浸提液；再用细胞培养液倍比稀释，制成50％材料浸提液备用。细胞相对增殖率测定及材料细胞毒性评价：用细胞培养液对数生长期的小鼠皮肤成纤维细胞(2-3代)配成浓度为6×104个/ml细胞悬浊液，每孔100μl，接种于96孔培养板，置37℃、5％co2培养箱中培养24小时；分别以50％、100％浓度的材料浸提液替换(200μl/孔)，以细胞培养液为空白对照，继续置37℃培养4小时后翻转出去2孔内液体，每孔加dmso150μl，震荡10min；酶联免疫仪测定每孔的吸光度值，各组8例取均值。测定波长为490nm，之后按公式r＝实验组od/对照组od×100％计算样品的细胞相对增殖率(rgr)并按下表1评价明胶海绵的细胞毒性分级。表1明胶海绵的细胞毒性分级试验结果：浓度50％、100％的明胶海绵浸提液，2天的细胞相对增殖率可高达99％以上，4天、7天相对增殖率随时间延长有所下降，但仍在80％以上，细胞毒性评分分为i级。细胞毒性达到≤1级。2.5.溶血按gb/t16886.4中直接接触法进行检测，溶血率应小于5％，结果符合规定：试验方法：取兔心脏血10-20ml，分离红细胞制成体积分数为2％rbc悬浊液备用。试验分为试品管、阴性对照管和阳性对照管，每组设4个平行管。试验管为各浓度浸提液对生理盐水的稀释液，阴性对照采用生理盐水，阳性对照采用蒸馏水。各管加入10ml相应样品，37℃水溶30min后，分别加0.2ml的rbc悬浊液，37℃水溶1h后静置过夜，离心后上清液在520cm处比色。试验结果：溶血性试验中实验组与生理盐水组的溶血率均小于5％，蒸馏水组的溶血率为100％。说明试验所用明胶海绵不引起溶血反应。2.6.皮肤致敏按gb/t16886.10中最大剂量法进行检测：试验方法：取健康豚鼠12只，隔日腹腔注射0.2ml浸提液，连续3次，其中6只于首次注射后连续14天由腹腔注射2ml浸提液；另外6只于首次注射后21天腹腔注射2ml浸提液。每次注射后观察15分钟，特别是末次注射后有无用抓搔鼻、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、体温改变、休克、死亡等反应。试验结果：过敏性试验中豚鼠腹腔注射后，全部豚鼠成活，实验组和对照组豚鼠的行为活动情况无明显差异。说明本试验所用明胶海绵不导致机体过敏反应。致敏率达到≤8％。2.7.皮内刺激取浸提液按gb/t16886.10进行检测，符合规定：试验方法：兔股四头肌注射试验：新西兰兔10只，右侧后肢股四头肌为试验区域，注射1-2ml浸提液，左侧对应部位同法注射等体积的生理盐水作对照，注射48小时、14天、21天分组处死试验兔，解剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉组织变化：(一)级，阴性反应，无刺激性，给药部位与对照部位无差异；(+)级，可疑反应，给药部位肌肉组织充血，直径在0.5cm左右；(++)级，轻度反应，给药部位肌肉组织充血，直径在1cm左右；(+++)级，重度反应，给药部位组织红肿，发紫，光泽消失，可见坏死点。同时组织送病理检查。试验结果：股四头肌注入浸提液与生理盐水48小时、14天、21天，各实验组肉眼观察组织均无明显反应；48小时组织病理检查见组织横纹肌间肿胀，但未见明显的炎症反应；第14天和第21天见横纹肌纤维肿胀程度逐渐减轻，未见明显的炎性反应，对照组与实验组反应程度相同。试验结果说明本实验所用明胶海绵对深部组织无刺激作用，不产生明显的组织反应。2.8.植入试验按照gb/t16886.6规定的试验方法进行试验：试验方法：雄性昆明小鼠28只，体重25-30g。无菌条件下，将明胶海绵用打孔器制成直径1cm的原片；小鼠麻醉后固定，背部正中消毒、去毛，剪开约0.7cm左右的纵行切口，将明胶海绵放入右侧皮下，肠线缝合2针后，正常饲养。术后3、5、7、9天分别任选7只处死后肉眼观察并取材进行常规组织学检查。试验结果：大体观察：术后3天，见明胶海绵与基底贴附较紧密，不易揭起，但可完整取出，基本无炎性反应，材料周围组织均无坏死、脓肿；术后5天，明胶海绵已降解变薄，表面被少许纤维膜包裹，去除表面包裹纤维膜，材料完整，表面光滑；术后7天，明胶海绵明显变薄、变小，材料微呈淡黄色，表面光滑；术后9天，材料已基本完全降解，少量残留部分已不易完整分离。组织形态学观察：术后3天，可见明胶海绵内有少许中性粒细胞、淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，明胶海绵网状结构清晰；术后9天，明胶海绵完全吸收，为纤维结缔组织所取代。各时间未见组织变性、坏死。肌肉植入7天后，炎症细胞反应程度≤iv级；植入15天后，炎症细胞反应程度≤iii级；植入30天后，炎症细胞反应程度≤ii级，且周围无异常反应6周后本产品被吸收。2.9.遗传毒性按照gb/t16886.3规定的试验方法进行试验，结果符合规定：无遗传毒性。2.10.降解酶解法，按gb/t16287-1996方法检验，产品中淀粉在37℃±2℃温度下，置于含有a-淀粉酶和糖化酶的生理盐水中72小时后，在a-淀粉酶和糖化酶作用下，转化为葡萄糖，其转化率等于降解率。经检验，产品皮下植入6周被降解吸收，组织学反应良好。产品不释放出任何对患者产生副作用的物质，符合gb/t16886.1给出的生物学评价指南。本发明提供的明胶海绵具有良好的生物相容性，体内外安全性实验无毒副作用。效果实验例2产品的理化性质及生物学效能的稳定性是判定产品有效期的重要标志。本产品参照国外同类产品及国家有关规定，将有效期暂定两年，同时对同一批次产品开展为期四年的实时追踪研究，研究内容如下：3.1.检测指标3.1.1.明胶海绵的物理性质检测3.1.1.1.明胶海绵的外观及表面结构(每年定期一次)：明胶海绵的外观通过在自然光下肉眼观察。表面结构通过扫描电镜(sem)观察，由扬州大学中心实验室完成。如图1的(a)和(b)所示。3.1.1.2.吸水能力(每半年定期进行一次)：取明胶海绵5片，电子天平精密称取每片质量。浸入20ml室温(25-30℃)水中，待吸足水分后，用镊子轻轻夹住一角，提出水面控干1min后，电子天平称重，得出每片吸水后质量。吸水能力按方法计算：吸水能力(倍)＝吸水后质量/样品质量3.1.1.3.单位体积质量(表观密度)(每半年定期进行一次)：取明胶海绵5片，精密测量每片的长度、宽度和高度，计算出样品体积；电子天平称取质量，计算每片海绵单位体积内的质量，取均值。3.1.2.明胶海绵的化学性质检测(每年定期进行一次)3.1.2.1.ph值测定取明胶海绵5片，每片撕开后浸泡在15ml蒸馏水中30min，按照《中华人民共和国药典》二部附录规定的方法测定。3.1.2.2.总蛋白与羟脯氨酸含量测定总蛋白含量测定采用上海荣盛生物技术有限公司的双缩脲法总蛋白含量测定试剂盒，标准蛋白采用sigma公司的明胶，准确称取后用稀醋酸溶解。明胶海绵样品用20ml稀醋酸溶解，取溶解液测定。计算方法：总蛋白含量＝总蛋白测定值/明胶海绵质量×100％羟脯氨酸含量测定采用氯胺-t法。采用南京建成生物工程研究所的羟脯氨酸测定试剂盒。明胶海绵样品准确称量后加入6nhcl封管，110℃水解，取水解液测定。计算方法：羟脯氨酸含量＝羟脯氨酸测定值/总蛋白测定值×100％3.1.3.明胶海绵生物性能检测3.1.3.1.肝脏止血及体内埋植试验(每一年定期进行一次检测)取新西兰大白兔15只，体重2-2.5kg，在同一肝叶切除肝脏1cm组织两处，形成渗血创面，分别用明胶海绵和明胶海绵(南京第三制药厂生产)敷压创面，记录止血时间；止血后在海绵的四个角与肝脏创面缝合，定期观察其吸收降解情况并进行病理检测。3.1.3.2.明胶海绵无菌检测(每年定期进行一次检测)检测结果：明胶海绵物理性质的检测结果如下表2所示：表2明胶海绵物理性质的检测结果明胶海绵化学性质的检测结果如下表3所示：表3明胶海绵化学性质的检测结果检测时间检测指标检测结果2014.12ph值测定5.28±0.282014.12总蛋白含量(％)86.4±4.342014.12羟脯氨酸含量(％)11.03±0.482015.12ph值测定5.31±0.262015.12总蛋白含量(％)87.3±4.232015.12羟脯氨酸含量(％)10.88±0.512016.12ph值测定5.21±0.462016.12总蛋白含量(％)86.7±4.322016.12羟脯氨酸含量(％)10.78±0.502017.12ph值测定5.24±0.302017.12总蛋白含量(％)88.64±4.132017.12羟脯氨酸含量(％)10.64±0.48明胶海绵生物性能的检测结果如下表4所示：表4明胶海绵生物性能的检测结果检测时间检测指标检测结果2014.12应无菌无菌2015.12应无菌无菌本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。当前第1页12