一种近红外光聚合可注射水凝胶的制备与应用的制作方法

本发明涉及药品领域，具体涉及一种近红外光聚合可原位注射水凝胶的制备以及在肿瘤治疗方面的应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类生命和健康的主要疾病，其发病率仍在逐年上升。目前，恶性肿瘤多采用手术与化疗相结合的综合治疗为主,其中化疗是必须使用的治疗手段，因其药力强大、可快速杀伤或杀死肿瘤细胞，在临床治疗中发挥着重要作用，但是由于化疗药物血液循环时间短并且没有特定的生物分布,因此会引起严重的系统毒性。恶性肿瘤由于其内部的高渗透压,化疗药物很难到达实体瘤中心,造成全区域的肿瘤凋亡。总的说来，传统化疗药物不能满足肿瘤治疗的需求。为了达到更好的化疗效果，许多研究聚焦于化疗药的原位治疗，其被认为具有高效且低毒性的优点。在原位治疗中，包载在水凝胶中的药物可以缓慢释放，一次治疗可以维持较长的药效。

光响应聚合型水凝胶是一类利用光(如紫外光、可见光、红外线等)作为能量源来诱导单分子或前体的反应。与ph、温度和氧化还原等内源性刺激相比，光作为能量源诱导具有以下优点:(1)光源清洁，与人体非物理接触；(2)时间和空间同时可控，改变迅速。光源能够被精确调控，达到可控释放，减少给药剂量和毒副作用。目前，研究最多的是紫外光和近红外光，但是紫外光对人体伤害较大。近红外光对生物体的伤害较小，并且可以穿透深层组织几十厘米。因此，近红外光诱导光聚合是体内形成水凝胶的理想方法。

金纳米棒在紫外-可见-近红外(uv-vis-nir)波段具有独特的可调节表面等离子体共振(spr)光学特性、其良好的稳定性、低生物毒性、亮丽的色彩和在催化、信息存储、生物医学等领域广阔的应用前景受到相关研究领域的广泛关注。

通过羧甲基化改性壳聚糖形成的羧甲基壳聚糖(carboxymethylchitosan,cmcs),具有良好的水溶性、生物相容性和可降解性。将甲基丙烯酸连接到羧甲基壳聚糖分子中制备高分子材料,可以生成能在中性水溶液中溶解的壳聚糖衍生物。向这一衍生物水溶液中加入凝结剂后,可以形成没有细胞毒性的凝胶,因此,甲基丙烯酸酰羧甲基壳聚糖能够用来制备可以注射的生物材料,进行组织再生和修复，在生物医药等领域具有广阔应用前景。

技术实现要素：

基于以上现有技术的不足，本发明所解决的技术问题在于提供一种近红外光聚合可注射载药水凝胶，制备及其应用。一种近红外光聚合可注射载药水凝胶，其特征在于：当aunrs吸收光时，它们通过表面等离子体共振产生热量，利用由aunr提供的这种加热，使带有巯基的物质与光引发剂vazo44发生作用，产生硫自由基。然后合成引入双键的甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖作为可自由基交联的大分子单体，从而通过近红外光以触发硫醇-双键反应，从而得到近红外光聚合水凝胶。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种近红外光聚合可注射水凝胶的制备方法，包含如下步骤：

1)金纳米棒的制备：

将十六烷基溴化铵溶液与氯金酸溶液混合后立即加入硼氢化钠溶液中，剧烈搅拌，得金纳米种子溶液；将氯金酸溶液、硝酸银溶液，混匀后，加入抗坏血酸溶液、金纳米种子溶液，混合均匀后离心去除多余的十六烷基溴化铵溶液，得金纳米棒溶液；

2)金纳米棒的修饰：

将碳酸钾水溶液、单甲氧基聚乙二醇水溶液加入步骤1)制得的金纳米棒溶液混匀，在室温下放置24小时后，离心取沉淀物，冷冻干燥，得到mpeg-sh修饰的金纳米棒；

3)甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖的制备：

将羧甲基壳聚糖溶解于水中,冰浴条件下,加入甲基丙烯酸酐,ph保持8-11，冰浴搅拌反应后无水乙醇沉降反应液，离心得到沉淀，将沉淀洗涤、真空干燥，即得macmcs；

4)macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶的制备：

将macmcs溶液，4arm-pegsh溶液，mpeg-sh修饰的金纳米棒和偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐溶液混合制备前体溶液；接着，将前体溶液转移到模具中，然后用808nm连续波激光器照射前体溶液，即得所述的近红外光聚合可注射水凝胶。

作为上述技术方案的优选，本发明提供的近红外光聚合可注射水凝胶的制备方法进一步包括下列技术特征的部分或全部：

作为上述技术方案的改进，所述步骤1)中，十六烷基溴化铵溶液的浓度为0.15-0.3mol/l；氯金酸溶液的浓度为5×10^-4mol/l；硼氢化钠溶液的浓度为0.010-0.25mol/l；氯金酸溶液的浓度为1×10^-3mol/l；硝酸银溶液的浓度为0.001-0.004mol/l；抗坏血酸溶液的浓度为0.08mol/l；所述十六烷基溴化铵溶液、氯金酸溶液和硼氢化钠溶液的体积比为5ml：5ml：0.6ml；所述十六烷基溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液、抗坏血酸溶液和金纳米种子溶液的体积比为5ml:5ml：0.15ml：70μl：20μl。

作为上述技术方案的改进，所述步骤1)中，离心转速为12000r/min。

作为上述技术方案的改进，步骤2)中所述碳酸钾水溶液、单甲氧基聚乙二醇水溶液和金纳米棒溶液的体积比为1:0.1～0.4:1；所述碳酸钾水溶液的浓度为2×10^-3mol/l；单甲氧基聚乙二醇水溶液的浓度为1×10^-3mol/l；金纳米棒溶液的浓度为1×10^-9mol/l。

作为上述技术方案的改进，步骤3)中用0.1mol/l氢氧化钠水溶液调节ph值。

作为上述技术方案的改进，所述步骤3)中，是将2g羧甲基壳聚糖溶解于150ml水中，所述水与甲基丙烯酸酐的体积比为150ml：1～2.5ml。

作为上述技术方案的改进，所述步骤3)中，洗涤是使用乙醇洗涤至少三次；所述的真空干燥温度为40℃。

作为上述技术方案的改进，所述步骤4)中，macmcs溶液的质量百分浓度为10％，4arm-pegsh溶液的质量百分浓度为10％，mpeg-sh修饰的金纳米棒和偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐溶液的质量百分浓度为1.2％；所述macmcs溶液，4arm-pegsh溶液，mpeg-sh修饰的金纳米棒和偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐溶液的体积比为3:1:0.1～0.4:1。

作为上述技术方案的改进，所述步骤4)中，所得的近红外光聚合可注射水凝胶的凝胶孔径范围为0.5-10mm。

一种如上所述任意方法制备所得的近红外光聚合可注射水凝胶的应用，其特征在于：所述步骤4)中，macmcs溶液，4arm-pegsh溶液，mpeg-sh修饰的金纳米棒和偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐溶液混合制备前体溶液；,然后向所述的前提溶液中加入所需载药量的抗肿瘤药，搅拌均匀后得到所需载药水凝胶制剂，接着，将载药水凝胶制剂转移到模具中，然后用808nm连续波激光器照射载药水凝胶制剂，即得负载抗肿瘤药的近红外光聚合可注射水凝胶。

作为上述技术方案的改进，所述抗肿瘤药为阿霉素dox，每毫升凝胶所需的dox的量为0.2-0.5mg。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：

(1)光热-化疗的联合治疗

本发明将具有光热治疗作用的金纳米棒与水凝胶有效结合，将水凝胶前体溶液注射进体内，随后进行光聚合，实现了肿瘤热疗-化疗联合治疗，提高治疗效果；

(2)本发明提供的原位注射型载药水凝胶，给药途径简单，并且实现了药物的缓释；

(3)本发明提供的光聚合型水凝胶由近红外光照射聚合所得，近红外光人体伤害较小，穿透力较强；

(4)本发明提供的制备方法，方法简单，原料易得，实施条件温和，环境污染少；

(5)本发明提供的近红外光聚合水凝胶在合适条件下可实现快速凝胶化，缩短实验时间；

(5)本发明提供的近红外光聚合水凝胶，具有良好的生物相容性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下结合优选实施例，详细说明如下。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。

图1为本发明中macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶的形成示意图；其中，其中图1a为macmcs的合成示意图，图1b为近红外光聚合水凝胶的形成示意图；

图2为本发明实施例1中金纳米棒紫外吸收图；

图3为本发明实施例1中金纳米棒透射电镜图；

图4为本发明实施例1中peg修饰后的金纳米棒的紫外吸收图；

图5为本发明实施例1中羧甲基壳聚糖、macmcs红外光谱对比图；

图6为本发明实施例1中macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶的不同引发剂浓度条件下的凝胶时间影响图；

图7为本发明实施例1中macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶的红外光谱图；

图8为本发明实施例1中macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶孔隙率图；

图9为本发明实施例1中macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶溶胀性图；

图10为本发明实施例1中macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶体外释放曲线；

图11为本发明实施例1中macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶的扫描电镜形貌图。

具体实施方式

下面详细说明本发明的具体实施方式，其作为本说明书的一部分，通过实施例来说明本发明的原理，本发明的其他方面、特征及其优点通过该详细说明将会变得一目了然。

实施例1

1)金纳米棒的制备：

取5ml，0.0005m氯金酸溶液以及5ml，0.2m的十六烷基溴化铵溶液混合后，快速加入0.60ml，0.020m的硼氢化钠溶液中，剧烈搅拌2min，25℃下静置2h(不能超过3h)既制备得金纳米种子溶液。然后在5ml，0.20m的十六烷基溴化铵溶液中依次加入5.0ml，0.001m的氯金酸溶液、0.15ml，0.0020m硝酸银溶液混合后，加入70μl，0.08m抗坏血酸溶液以及20μl种子溶液后，即获得金纳米棒；

2)金纳米棒的修饰：

为提高金纳米棒的稳定性和细胞相容性。将2mm碳酸钾和1mmarm-pegsh水溶液以1：0.1：1的体积比加入到1mm的金纳米棒溶液中。在室温下放置24小时后，将溶液以12000rpm离心15分钟。收集沉淀并重悬于ddi水中。重复以12000rpm离心15分钟，并将沉淀重悬于pbs(ph7.4)中。即得peg修饰的金纳米棒。

3)甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖的制备：

将2g羧甲基壳聚糖充分溶解于150ml蒸馈水中,冰浴条件下,逐滴加入2.5ml甲基丙烯酸酐,ph在8的环境下,保持冰浴,搅拌反应24h。无水乙醇沉降,过滤后,沉淀物再用无水乙醇洗涤3次。真空干燥至恒重后,-20℃冰箱保存。

4)macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶的制备：

在pbs(ph7.4)中分别制备8％macs，10％peg4sh，peg包覆的金纳米棒(gnr-peg，1nm)和1.2％vazo044的单独溶液，各单独溶液体积比为3:1:0.1:1。然后，通过混合制备的溶液并在冰上来制备前体溶液。接着，将20μl的前体溶液转移到直径为4mm且深度为1mm的模具中。然后用808nm连续波激光器照射前体溶液。照射后，将ddi水加入到含有溶液中以研究凝胶形成。当发现不溶部分时，认为凝胶已形成。

5)macmcs/4arm-pegsh@dox近红外光聚合载药水凝胶的制备

以阿霉素dox为模型药物，采用物理混合法，将0.2gdox加入到上述制备的单独溶液中，混匀后得到所需载药水凝胶制剂。根据上述照射方法，制备macmcs/4arm-pegsh@dox近红外光聚合载药水凝胶。

图1a表示甲基丙烯酸酰羧甲基壳聚糖的合成示意图，这表示，羧甲基壳聚糖水溶液与甲基丙烯酸酐在0℃下反应24小时得到甲基丙烯酸酰羧甲基壳聚糖。

图1b表示在808nm的近红外光照射下，前面合成的甲基丙烯酸酰，mpeg-sh修饰过的金纳米棒，4arm-pegsh和vaz044的混合液得到的近红外光聚合水凝胶的形成示意图。

图2表示从金纳米棒紫外光谱中可以看出其横向吸收峰在520nm左右，最大吸收波长为791nm,而且在808nm处有较强的吸收。

图3表示金纳米棒的透射电镜图，此图表明已定向生成了棒状的金纳米粒。

图4表示用mpeg-sh修饰过的金纳米棒的紫外吸收图，从图中可以看出，在对比图2，其线性范围有扩大，在808nm处的吸收有加强。

图5表示macmcs与cmcs的红外对比图，从红外光谱图中可以看出3300cm^-1为羟基和氨基的伸缩振动吸收峰，cmcs中2890cm-1为c-h伸缩振动吸收峰。macmcs在1655cm^-1和1537cm-1处有两个明显的吸收峰，1655cm-1处为酰胺羰基伸缩振动和碳碳双键伸缩振吸收峰，1537cm-1为nh弯曲振动和c-n伸缩振动耦合产生的酰胺ⅱ带。由此可以说明ma成功与cmcs发生了酰胺化反应。

图6为macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶的不同引发剂浓度条件下的凝胶时间影响图，从图中可以看出引发剂浓度不同，凝胶化时间是不一样的，在引发剂浓度为0.3％-1.2％间，凝胶化时间是随引发剂浓度的增大而减少的，在1.2％凝胶化时间达到最短，而在引发剂浓度为1.2％-1.5％间，随着引发剂浓度的增大，凝胶化时间是增大的。引发剂浓度对凝胶化时间是有影响的。

图7为macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶的红外光谱图，从图中可以看出,对比图五macmcs在1655cm^-1和1537cm^-1处的吸收峰相比，凝胶在这两处的吸收峰明显增强,说明聚合成功。

图8为macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶孔隙率图，孔隙率的大小直接反应了孔径的大小以及孔的密度，合适的孔隙率可以更好的载药以及进行缓释。从图中可以看出随着引发剂浓度的增大，水凝胶的孔隙率逐渐增加。说明增加引发剂浓度可以有效的增加水凝胶的孔隙密度。

图9为macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶在pbs中当引发剂浓度为1.5％时的溶胀动力学曲线，从此趋势图的总体趋势中可以看出，水凝胶的平衡溶胀度随时间的变化逐渐增大，而且在300分钟后逐渐趋于平衡。

图10macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶体外释放曲线。从图中可以看出当水凝胶的载药量在50g/ml时，药物在pbs释放初期，dox的释放速率较快，12个小时后，dox的释放速率趋于平缓，在72小时时，dox的累积释放量已快要达到了80％，说明其具有良好的缓释效果

图11为macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶的扫描电镜图，此图可以观察到此水凝胶的形貌，从图中可以看出，此水凝胶的内部结构为连续多孔的网络结构，孔洞排列较规则，孔径为微米级，此结构为水凝胶提供了较大的比表面积，更利于溶剂的吸收和药物的扩散。

实施例2

1)金纳米棒的制备：

取5ml，0.0005m氯金酸溶液以及5ml，0.15m的十六烷基溴化铵溶液混合后，快速加入0.60ml，0.010m的硼氢化钠溶液中，剧烈搅拌2min，25℃下静置2h(不能超过3h)既制备得金纳米种子溶液。然后在5ml，0.15m的十六烷基溴化铵溶液中依次加入5.0ml，0.001m的氯金酸溶液、0.15ml，0.0010m硝酸银溶液混合后，加入70μl，0.08m抗坏血酸溶液以及20μl种子溶液后，即获得金纳米棒；

2)金纳米棒的修饰：

为提高金纳米棒的稳定性和细胞相容性。将2mm碳酸钾和1mmarm-pegsh水溶液以1：0.2：1的体积比加入到金纳米棒溶液中。在室温下放置24小时后，将溶液以12000rpm离心15分钟。收集沉淀并重悬于ddi水中。重复以12000rpm离心15分钟，并将沉淀重悬于pbs(ph7.4)中。即得peg修饰的金纳米棒。

3)甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖的制备：

将2g羧甲基壳聚糖充分溶解于150ml蒸馈水中,冰浴条件下,逐滴加入2.5ml甲基丙烯酸酐,ph在9的环境下,保持冰浴,搅拌反应24h。无水乙醇沉降,过滤后,沉淀物再用无水乙醇洗涤3次。真空干燥至恒重后,-20℃冰箱保存。

4)macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶的制备：

在pbs(ph7.4)中分别制备8％macms，10％peg4sh，peg包覆的金纳米棒(gnr-peg，1nm)和1.2％vazo44的单独溶液，各单独溶液体积比为3:1:0.2:1。然后，通过混合制备的溶液并在冰上来制备前体溶液。接着，将20μl的前体溶液转移到直径为4mm且深度为1mm的模具中。然后用808nm连续波激光器照射前体溶液。照射后，将ddi水加入到含有溶液中以研究凝胶形成。当发现不溶部分时，认为凝胶已形成。

5)macmcs/4arm-pegsh@dox近红外光聚合载药水凝胶的制备

以阿霉素dox为模型药物，采用物理混合法，将0.3gdox加入到上述制备的单独溶液中，混匀后得到所需载药水凝胶制剂。根据上述照射方法，制备macmcs/4arm-pegsh@dox近红外光聚合载药水凝胶。

实施例3

1)金纳米棒的制备：

取5ml，0.0005m氯金酸溶液以及5ml，0.25m的十六烷基溴化铵溶液混合后，快速加入0.60ml，0.020m的硼氢化钠溶液中，剧烈搅拌2min，25℃下静置2h(不能超过3h)既制备得金纳米种子溶液。然后在5ml，0.25m的十六烷基溴化铵溶液中依次加入5.0ml，0.001m的氯金酸溶液、0.15ml，0.0030m硝酸银溶液混合后，加入70μl，0.08m抗坏血酸溶液以及20μl种子溶液后，即获得金纳米棒；

2)金纳米棒的修饰：

为提高金纳米棒的稳定性和细胞相容性。将2mm碳酸钾和1mmarm-pegsh水溶液以1：0.3：1的体积比加入到1mm的金纳米棒溶液中。在室温下放置24小时后，将溶液以12000rpm离心15分钟。收集沉淀并重悬于ddi水中。重复以12000rpm离心15分钟，并将沉淀重悬于pbs(ph7.4)中。即得peg修饰的金纳米棒。

2)甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖的制备：

将2g羧甲基壳聚糖充分溶解于150ml蒸馈水中,冰浴条件下,逐滴加入2.5ml甲基丙烯酸酐,ph在10的环境下,保持冰浴,搅拌反应24h。无水乙醇沉降,过滤后,沉淀物再用无水乙醇洗涤3次。真空干燥至恒重后,-20℃冰箱保存。4)macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶的制备：

在pbs(ph7.4)中分别制备8％macs，10％peg4sh，peg包覆的金纳米棒(gnr-peg，1nm)和1.2％vazo44的单独溶液，各单独溶液体积比为4:1:0.3:1。然后，通过混合制备的溶液并在冰上来制备前体溶液。接着，将20μl的前体溶液转移到直径为4mm且深度为1mm的模具中。然后用808nm连续波激光器照射前体溶液。照射后，将ddi水加入到含有溶液中以研究凝胶形成。当发现不溶部分时，认为凝胶已形成。

5)macmcs/4arm-pegsh@dox近红外光聚合载药水凝胶的制备

以阿霉素dox为模型药物，采用物理混合法，将0.4gdox加入到上述制备的单独溶液中，混匀后得到所需载药水凝胶制剂。根据上述照射方法，制备macmcs/4arm-pegsh@dox近红外光聚合载药水凝胶。

实施例4

1)金纳米棒的制备：

取5ml，0.0005m氯金酸溶液以及5ml，0.30m的十六烷基溴化铵溶液混合后，快速加入0.60ml，0.025m的硼氢化钠溶液中，剧烈搅拌2min，25℃下静置2h(不能超过3h)既制备得金纳米种子溶液。然后在5ml，0.30m的十六烷基溴化铵溶液中依次加入5.0ml，0.001m的氯金酸溶液、0.15ml，0.0040m硝酸银溶液混合后，加入70μl，0.08m抗坏血酸溶液以及20μl种子溶液后，即获得金纳米棒；

2)金纳米棒的修饰：

为提高金纳米棒的稳定性和细胞相容性。将2mm碳酸钾和1mmarm-pegsh水溶液以1：0.4：1的体积比加入到1mm的金纳米棒溶液中。在室温下放置24小时后，将溶液以12000rpm离心15分钟。收集沉淀并重悬于ddi水中。重复以12000rpm离心15分钟，并将沉淀重悬于pbs(ph7.4)中。即得peg修饰的金纳米棒。

3)甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖的制备：

将2g羧甲基壳聚糖充分溶解于150ml蒸馈水中,冰浴条件下,逐滴加入2.5ml甲基丙烯酸酐,ph在11的环境下,保持冰浴,搅拌反应24h。无水乙醇沉降,过滤后,沉淀物再用无水乙醇洗涤3次。真空干燥至恒重后,-20℃冰箱保存。4)macmcs/4arm-pegsh近红外光聚合水凝胶的制备：

在pbs(ph7.4)中分别制备8％macs，10％peg4sh，peg包覆的金纳米棒(gnr-peg，1nm)和1.2％vazo44的单独溶液，各单独溶液体积比为3:1:0.4:1。然后，通过混合制备的溶液并在冰上来制备前体溶液。接着，将20μl的前体溶液转移到直径为4mm且深度为1mm的模具中。然后用808nm连续波激光器照射前体溶液。照射后，将ddi水加入到含有溶液中以研究凝胶形成。当发现不溶部分时，认为凝胶已形成。

5)macmcs/4arm-pegsh@dox近红外光聚合载药水凝胶的制备

以阿霉素dox为模型药物，采用物理混合法，将0.5gdox加入到上述制备的单独溶液中，混匀后得到所需载药水凝胶制剂。根据上述照射方法，制备macmcs/4arm-pegsh@dox近红外光聚合载药水凝胶。

本发明所列举的各原料，以及本发明各原料的上下限、区间取值，以及工艺参数(如温度、时间等)的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。

以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。