本发明属于化合物应用领域，具体涉及到牛磺熊去氧胆酸的全新用途。
背景技术：
急性肾损伤(acutekidneyiniury，aki)是一种常见的肾脏疾病，其特点是肾脏功能快速下降甚至丧失。aki的病理特征是肾小管上皮细胞的损伤和死亡。在损伤发生后，存活的肾小管细胞经历去分化，增殖，以取代受损的肾小管上皮细胞并恢复肾小管的完整性。
过去aki被认为是一种完全可逆的疾病。然而，最近大量流行病学和动物实验研究表明，在严重aki的情况下，肾小管上皮修复不完全或发生适应不良的修复，使aki转归为ckd(chronickidneydisease，ckd)。所以aki是慢性肾脏病发生和发展的重要危险因素。
ckd是各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍(肾脏损害病史大于3个月)，包括肾小球滤过率正常和不正常的病理损伤、血液或尿液成分异常，及影像学检查异常，或不明原因肾小球滤过率下降(＜60ml/min·1.73m2)超过3个月。其主要病理特点是肾小管萎缩，肾小管间质纤维化和慢性炎症。打断aki转归为ckd是降低aki对患者伤害的一个有利途径，这就需要一种良好的aki形成后的处理办法。然而，aki目前的防治主要为生物标志物预警来尽早识别并纠正可逆病因，以及采用维持体液平衡，营养支持，防止并发症及肾脏替代治疗的对症支持治疗方案；现有的这些生物标志物预警准确性不高，实用性并不强，导致aki诊出率低，漏诊率高；目前仍无特异治疗方法，导致aki死亡率高。
目前，仍缺乏有效防治aki向ckd转化的药物；发现能有效治疗aki，阻止aki向ckd进展的药物具有重要的意义。
牛磺熊去氧胆酸((tauroursodeoxycholicacid，tudca)的化学名为2-[[(3α，5β，7β)-3，7-二羟基-24-氧代胆甾烷-24-基]氨基]乙烷磺酸二水合物，临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等。此外，现有技术还报道了tudca在神经保护药物、避免脊髓损伤后的二次伤害、治疗神经退行性疾病(例如肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病和/或色素性视网膜炎)等方面的用途。但是，并没有关于tudca在阻止aki向ckd转变中的药物用途的报道。
技术实现要素：
本发明提供了一种tudca在制备治疗aki的药物的全新用途。
一种tudca的应用，将其用于制备治疗急性肾损伤的药物。
本发明创新地发现，在急性肾损伤已经形成后，施用tudca，可以恢复急性肾损伤后受损的部分肾功能；改善急性肾损伤后肾小管萎缩、对侧肾代偿性肥大、肾间质纤维化、肾脏慢性炎症和小管细胞死亡。动物模型研究证实，tudca可有效缓解急性肾损伤形成后的进一步恶化至ckd。
现有技术公开了一些在aki形成前施用一些药物用于预防aki形成的方法，这些方法对于一些可预测的aki是有效的，例如移植，心血管手术和肾毒性药物等引起的aki。但对于其他不可预测的aki，例如创伤(包括缺血再灌注损伤)，败血症，心力衰竭和过敏性休克等引起的aki，这些预防方法存在较多不确定性，临床适用性以及实用性差。不同于现有的aki预防方法，本发明处理对象为aki已经形成的对象。本发明创新地发现tudca在aki形成后可有效缓解其进一步的损伤，还可修复受损肾的部分功能，具有临床实用价值。
作为优选，所述的应用，将其用于制备治疗肾前性和/或肾性急性肾损伤的药物。
研究发现，tudca可有效缓解肾前性和/或肾性急性肾损伤已经形成后的肾损伤。
本发明人发现，在所述的急性肾损伤形成后施用本发明所述的tudca的有效性。本发明中，可采用现有方法以及指标来指证急性肾损伤是否形成，从而确定施用本发明所述的tudca的时机。例如，在以下症状下施用所述的tudca：(1)缺血侧肾重/体重的比值明显上升，肉眼见肾脏肿大，苍白，切面皮质苍白，髓质呈暗红色。(2)对侧肾重/体重的比值尚无明显变化，表明对侧肾脏尚未发生代偿性肥大；(3)血清肌酐显著上升，表明出现肾功能损伤；(4)he染色显示肾小管细胞大量损伤和坏死等。
优选地，所述的急性肾损伤指肾功能在2天内突然减退，表现为血清肌酐(serumcreatinine)绝对值升高＞0.3mg/dll；或7天内血清肌酐增至≥1.5倍基础值。本发明所述的应用，将所述的tudca用于制备治疗2天内血清肌酐(serumcreatinine)绝对值升高＞0.3mg/dl或7天内血清肌酐增至≥1.5倍基础值药物。所述的基础值为患者入院后首次测的肌酐值。
作为优选，所述的应用，所述的急性肾损伤表征为尿量＜0.5ml/(kg·h)，持续时间＞6小时。也即是，将所述的应用于制备治疗尿量＜0.5ml/(kg·h)，持续时间＞6小时的急性肾损伤的药物。
作为优选，所述的应用，将其用于制备治疗急性肾损伤向慢性肾脏病转换的药物。通过本发明的应用，可显著改善由aki转归至ckd的途径，有助于显著降低aki患者的损伤，改善aki患者的预后。
本发明人研究发现，tudca在缓解aki向ckd转换中的有益功效。通过动物实验研究发现，tudca能有效地缓解aki向ckd进展。
所述的应用，将其和药学上可接受的辅料复合，制得所述的药物。
所述的应用，所述的药物以tudca计，施药量为0.2～0.4克/千克/天。
本发明还提供了一种tudca药学上可接受盐的应用，将其用于制备治疗急性肾损伤的药物。所述的tudca药学上可接受盐的应用和tudca的应用方法类似。
例如，所述的tudca药学上可接受盐的应用，将其用于治疗2天内血清肌酐绝对值升高＞0.3mg/dl或7天内血清肌酐增至≥1.5倍基础值的急性肾损伤的药物；和/或，将其用于治疗尿量＜0.5ml/(kg·h)，持续时间＞6小时的急性肾损伤的药物。
优选的tudca药学上可接受盐的应用，将其用于制备治疗急性肾损伤向慢性肾脏病转换的药物。
所述的tudca药学上可接受盐为tudca的碱金属盐、铵盐中的至少一种。
本发明还提供了一种治疗急性肾损伤的药物，至少包含tudca及其药学上可接受盐；还选择性包含药学上可接受的辅料。所述的药物的剂型可为胶囊、注射等剂型。
本发明还提供了一种治疗急性肾损伤向慢性肾脏病转换的药物，至少包含tudca及其药学上可接受盐；还选择性包含药学上可接受的辅料。所述的药物的剂型可为胶囊、注射等剂型。
有益效果
这些结果表明，tudca治疗恢复了急性肾损伤后受损的部分肾功能；改善了急性肾损伤后肾小管萎缩、对侧肾代偿性肥大、肾间质纤维化、肾脏慢性炎症和小管细胞死亡。表明tudca能延缓aki向ckd转换。
附图说明：
图1实施例1展示了急性肾损伤向慢性肾脏病转换的过程。
图2为实施例2的急性肾损伤后肾功能障碍，tudca能恢复部分肾功能的测试结果图；
图3为实施例3的急性肾损伤后肾小管萎缩、对侧肾代偿性肥大，tudca能改善肾小管萎缩和对侧肾代偿性肥大的测试结果图；
图4为实施例4的急性肾损伤后肾间质纤维化，tudca能改善肾间质纤维化的测试结果图；
图5为实施例5的急性肾损伤后肾间质炎症，tudca能改善肾间质炎症的测试结果图；
图6为实施例6的急性肾损伤后肾小管细胞死亡，tudca能改善肾小管细胞死亡的测试结果图。
具体实施方案：
实验设计：
1，c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)购买自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。我们以单侧缺血再灌注(unilateralrenalischemia-reperfusion，uir)对侧不切除诱导从aki到ckd转换的动物模型。具体操作如下：进行假手术(sham)或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。在2或7或14天时处死小鼠。收集肾脏组织用于生化和组织学分析。
2，c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)购买自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。进行假手术或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。由于对侧肾的代偿作用无法直接测量出肾功能真实水平，所以在单侧缺血再灌注后的第1，6或13天进行右肾切除术，然后在1天后，即在2或7或14天时处死小鼠。收集血液测量血清肌酐以指示左肾的功能。
3，c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)购买自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。进行假手术或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从单侧缺血再灌注的第3天开始给予tudca250毫克/千克/天或等量的生理盐水(normalsaline，ns)。在单侧缺血再灌注后的第13天进行右肾切除术，然后在1天后，即在14天时处死小鼠。收集血液测量血清肌酐以指示左肾的功能。
4，c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)购买自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。进行假手术或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从单侧缺血再灌注的第3天开始给予tudca250毫克/千克/天或等量的ns。在14天时处死小鼠。收集肾脏组织用于生化和组织学分析。
实施例1
对c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)进行假手术或30分钟左肾单侧局部缺血，然后再灌注。在2或7或14天时，收集肾脏组织用于生物化学和组织学分析(a，b，d，e，f，g，h，i)。在uir后的第1，6或13天进行右肾切除术，然后在1天后，即在2或7或14天时处死小鼠。收集血液测量血清肌酐以指示左肾的功能(c)。(检测uir2d的目的是为了说明2天时aki已经形成，这样在第3天加药就属于治疗aki而不是预防或者干预aki形成。uir7d和uir14d均代表ckd)
测试结果见图1：单侧肾缺血再灌注(unilateralrenalischemiareperfusion，uir)模拟人体内肾脏从急性肾损伤进展为慢性肾脏病。
(a)缺血侧肾脏重量/体重(mg/g)：当单侧缺血再灌注2天(uir2d)时，此时与假手术组(sham)相比，缺血侧肾重/体重的比值明显上升，***p＜0.001，代表缺血侧肾脏发生了水肿。当单侧缺血再灌注7天(uir7d)时，与sham组相比，缺血侧肾重/体重的比值无明显变化。当单侧缺血再灌注14天(uir14d)时，与sham组相比，缺血侧肾重/体重的比值明显下降，**p＜0.01，代表缺血侧肾脏发生了萎缩。
(b)对侧肾脏重量/体重(mg/g)：当uir2d时，与sham组相比，对侧肾重/体重的比值无明显变化。但当uir7d和uir14d时，与sham组相比，对侧肾重/体重的比值均明显上升，***p＜0.001，代表对侧肾脏发生代偿性肥大。
(c)血清肌酐(mg/dl)：在三个时间点中，手术组血清肌酐的浓度均显著高于对照组小鼠，***p＜0.001，表明uir导致肾功能持续障碍。
(d)肾组织石蜡切片苏木素-伊红(he)染色：当uir2d时，肾小管细胞大量损伤和坏死，小管扩张伴大量管型形成。当uir7d和uir14d时，部分肾小管脱落，剩余的肾小管结构紊乱，大多数肾小管发生萎缩，表现为肾小管和肾间质间隙明显扩张伴小管腔内大量坏死碎片。此外，uir14d时，肾小球明显萎缩。
(e)肾小管萎缩的病理评分。萎缩小管的百分比评分标准：0无损伤；1，＜25％；2，25-50％；3，50-75％；4，＞75％。定量分析显示uir后肾小管萎缩进行性加重。
(f)胶原蛋白1(collagen1)，α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)和波形蛋白(vimentin)的免疫印迹分析。
(g)collagen1，α-sma和vimentin的免疫印迹的定量分析：与假手术组相比，缺血组细胞外基质组分标记物(collagen1)和肌成纤维细胞活化标记物(α-sma和vimentin)的表达明显增加。
(h)肾组织石蜡切片masson三色染色：sham组无明显胶原沉积；当uir7d时，蓝色的i，iii和iv型胶原纤维主要分布在皮髓交界处；当uir14d时，胶原纤维已从皮髓交界处扩散到肾皮质。
(i)masson三色染色的定量分析：肾间质纤维化进行性加重。
数据表示为平均值±标准误。n＝4。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；ns，无明显差异。
实施例2
对c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)进行30分钟的左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从单侧缺血再灌注(unilateralrenalischemiareperfusion，uir)的第3天开始腹腔注射给予tudca250毫克/千克/天或等量的生理盐水(ns)。在uir后的第13天进行右肾切除术，然后在1天后(即在第14天)处死小鼠，收集血液测量血清肌酐以指示左肾的功能。
测试结果见图2：体内实验证明了tudca改善了缺血性急性肾损伤后肾功能障碍。
血清肌酐(mg/dl)：与对照组(sham+ns)相比，手术组血清肌酐的浓度显著高于对照组，***p＜0.001，表明uir导致了肾功能受损。在uir14天时，与注射ns组相比，注射tudca组血清肌酐值浓度显著下降，**p＜0.01，表明tudca能恢复急性肾损伤后部分肾功能障碍。
血清肌酐具体数值如下：
sham+ns组″0.5588±0.03954″，uir+ns组″3.437±0.2449″
uir+ns组″3.437±0.2449″，uir+tudca组″2.287±0.07283″
数据表示为平均值±标准误。n＝4。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；ns，无明显差异。
实施例3
对c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)进行30分钟的左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从uir的第3天开始腹腔注射给予tudca250毫克/千克/天或等量的ns。第14天时收集肾组织。
测试结果见图3：体内实验证明了tudca改善了急性肾损伤后肾小管萎缩和对侧肾代偿性肥大。
(a)肾组织石蜡切片he染色：与对照组相比，uir14天时，部分肾小管脱落，剩余的肾小管结构紊乱，大多数肾小管发生萎缩，表现为肾小管和肾间质间隙明显扩张伴小管腔内大量坏死碎片。当uir14天时，与注射ns组相比，注射tudca组萎缩小管显著减少。
(b)肾小管萎缩的病理评分：萎缩小管的百分比评分标准：0无损伤；1，＜25％；2，25-50％；3，50-75％；4，＞75％。定量分析显示：与对照组相比，uir后肾小管发生明显萎缩，***p＜0.001。当uir14天时，与注射ns组相比，注射tudca组萎缩小管百分比显著减少，**p＜0.01。
肾小管萎缩评分具体数值如下：
sham+ns组″0.0001±0.0001″，uir+ns组″3.400±0.2211″
uir+ns组″3.400±0.2211″，uir+tudca组″2.400±0.1633″
(c)对侧肾脏重量/体重(mg/g)：与对照组相比，uir14天时，对侧肾重/体重的比值明显上升，***p＜0.001，跟对侧肾脏发生代偿性肥大有关。当uir14天时，与注射ns组相比，注射tudca组对侧肾重/体重的比值显著下降，*p＜0.05，表明tudca可以减轻对侧肾代偿性肥大。
对侧肾脏重量/体重具体数值如下：
sham+ns组″6.169±0.1629″，uir+ns组″8.325±0.2056″
uir+ns组″8.325±0.2056″，uir+tudca组″7.276±0.2481″
数据表示为平均值±标准误。n＝4。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；ns，无明显差异。
实施例4
对c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)进行30分钟的左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从uir的第3天开始腹腔注射给予tudca250毫克/千克/天或等量的ns。第14天时收集肾组织。
测试结果见图4：体内实验证明了tudca改善了急性肾损伤后肾间质纤维化。
(a)肾组织石蜡切片masson三色染色。
(b)masson三色染色的定量分析：与对照组相比，uir14天时，胶原沉积百分比显著上升，**p＜0.01。表明uir导致肾间质纤维化。当uir14天时，与注射ns组相比，注射tudca显著减轻胶原沉积百分比，*p＜0.05，表明tudca可以减轻肾间质纤维化。
masson三色染色的定量分析的具体数值如下：
sham+ns组″1.001±0.5966″，uir+ns组″20.26±3.255″
uir+ns组″20.26±3.255″，uir+tudca组″9.524±1.919″
(c)纤维连接蛋白1(fibronectin1)，胶原蛋白1(collagen1)，α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)，波形蛋白(vimentin)的免疫印迹图像。
(d)fibronectin1，collagen1，α-sma和vimentin的免疫印迹的定量分析：与对照组相比，细胞外基质组分标记物(fibronectin1和collagen1)和肌成纤维细胞活化标记物(α-sma和vimentin)的表达显著上升。当uir14天时，与注射ns组相比，注射tudca组细胞外基质组分标记物(fibronectin1和collagen1)和肌成纤维细胞活化标记物(α-sma和vimentin)的表达明显降低。
fibronectin1定量分析的具体数值如下：
sham+ns组″1.000±0.0000009537″，uir+ns组″10.81±1.858″
uir+ns组″10.81±1.858″，uir+tudca组″2.862±0.6561″
collagen1定量分析的具体数值如下：
sham+ns组″1.000±0.0000005860″，uir+ns组″2.808±0.5764″
uir+ns组″2.808±0.5764″，uir+tudca组″1.193±0.1194″
α-sma定量分析的具体数值如下：
sham+ns组″1.000±0.00000003441″，uir+ns组″5.177±0.3866″
uir+ns组″5.177±0.3866″，uir+tudca组″2.194±0.3356″
vimentin定量分析的具体数值如下：
sham+ns组″1.000±0.000001170″，uir+ns组″20.29±3.448″
uir+ns组″20.29±3.448″，uir+tudca组″5.279±1.489″
数据表示为平均值±标准误。n＝4。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；ns，无明显差异。
实施例5
对c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)进行30分钟的左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从uir的第3天开始腹腔注射给予tudca250毫克/千克/天或等量的ns。第14天时收集肾组织。
测试结果见图5：体内实验证明了tudca改善了急性肾损伤后肾间质炎症。
(a)显示巨噬细胞的f4/80免疫组织化学染色。箭头指示了一部分典型的巨噬细胞。
(b)巨噬细胞免疫组织化学染色的定量分析：与对照组相比，uir组肾间质中出现大量巨噬细胞浸润，***p＜0.001。当uir14天时，与注射ns组相比，注射tudca显著减轻急性肾损伤后肾间质巨噬细胞浸润，**p＜0.01。
巨噬细胞定量分析的具体数值如下：
sham+ns组″5.200±1.744″，uir+ns组″523.4±93.68″
uir+ns组″523.4±93.68″，uir+tudca组″187.0±15.85″
(c)单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)和actb(起内部对照作用)的实时定量pcr分析：与对照组相比，uir组mcp-1的表达显著上升，***p＜0.001。在uir14天时，与注射ns组相比，注射tudca显著的降低了小鼠肾组织中mcp-1的表达，***p＜0.001。
mcp-1的具体数值如下：
sham+ns组″1.754±0.5406″，uir+ns组″281.9±7.342″
uir+ns组″281.9±7.342″，uir+tudca组″13.86±2.323″
(d)肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和actb(起内部对照作用)的实时定量pcr分析：与对照组相比，uir组tnf-α的表达显著上升，***p＜0.001。在uir14天时，与注射ns组相比，注射tudca显著的降低了小鼠肾组织中tnf-α的表达，***p＜0.001。
tnf-α的具体数值如下：
sham+ns组″1.474±0.2382″，uir+ns组″27.61±1.213″
uir+ns组″27.61±1.213″，uir+tudca组″9.628±0.2201″
数据表示为平均值±标准误。n＝4。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；ns，无明显差异。
实施例6
对c57bl/6小鼠(雄性，8-10周龄)进行30分钟的左肾单侧局部缺血，然后再灌注。从uir的第3天开始腹腔注射给予tudca250毫克/千克/天或等量的ns。第14天时收集肾组织。
测试结果见图6：体内实验证明了tudca降低了急性肾损伤后肾小管细胞凋亡。
(a)tunel染色的代表性图像。
(b)tunel染色阳性细胞的定量分析：与对照组相比，uir组出现大量凋亡细胞，***p＜0.001。当uir14天时，与注射ns组相比，注射tudca显著降低了急性肾损伤后肾小管细胞凋亡，***p＜0.001。
tunel定量分析的具体数值如下：
sham+ns组″1.281±0.6015″，uir+ns组″71.33±7.703″
uir+ns组″71.33±7.703″，uir+tudca组″22.34±4.622″
(c)活化的半胱天冬酶12(caspase12)，活化的半胱天冬酶3(caspase3)和gapdh(起加载对照作用)的代表性免疫印迹图像。
(d)活化的半胱天冬酶12和活化的半胱天冬酶3的免疫印迹的定量分析：与对照组相比，uir组活化的caspase12(**p＜0.01)和活化的caspase3(***p＜0.001)显著增高，代表细胞凋亡增加。当uir14天时，与注射ns组相比，注射tudca显著降低了活化的caspase12(**p＜0.01)和活化的caspase3(***p＜0.001)，证明注射tudca显著减轻急性肾损伤后肾小管细胞凋亡
cleavedcaspase12定量分析的具体数值如下：
sham+ns组″1.000±0.000002742″，uir+ns组″24.61±4.748″
uir+ns组″24.61±4.748″，uir+tudca组″4.680±1.354″
cleavedcaspase3定量分析的具体数值如下：
sham+ns组″1.000±0.0000001788″，uir+ns组″45.69±5.337″
uir+ns组″45.69±5.337″，uir+tudca组″6.443±1.534″
数据表示为平均值±标准误。n＝4。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；ns，无明显差异。
研究结论
这些结果表明，tudca治疗恢复了急性肾损伤后受损的部分肾功能；改善了急性肾损伤后肾小管萎缩、对侧肾代偿性肥大、肾间质纤维化、肾脏慢性炎症和小管细胞死亡。表明tudca抑制aki向ckd的转换。