本发明涉及一种用于治疗缺血性心脏病的中药组合物及其制备方法和应用，特别涉及一种由葛根提取物和甘草提取物或者葛根素和甘草酸组成的中药组合物、其制备方法及其在治疗缺血性心脏病中的应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
缺血性心脏病是一种常见的导致心肌缺血、缺氧甚至坏死的慢性非传染性疾病，是由于冠状动脉循环改变引起冠状血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害。缺血性心脏病是心血管疾病患者死亡的重要原因，也是导致心力衰竭的首要因素。缺血性心脏病已成为20世纪西方发达国家的主要死因，严重威胁人类健康(barqueras等,arch.med.res.2015,46,328-338)。因此，对缺血性心脏病的有效治疗具有重要意义。临床实践中发现，常用于治疗心肌缺血的西药均适用于短期或急性期用药，且毒副作用大，不适合长期用药。相比较西药而言，由于中药的有效成分不易散失、副作用小、可因症、因病的不同随时加减，且治疗疾病范围较广。因此，中药口服制剂更适用于改善心肌供血的长期用药。
葛根素(puerarin)是从puerarialobata(willd.)ohwi野葛的干燥根中分离的的异黄酮类衍生物，化学名为8-β-d-吡喃葡萄糖-4',7-二羟基异黄酮。已有研究证实，葛根素具有扩张冠状动脉血管的作用，从而增加冠状动脉血流量、降低血管阻力及改善心肌代谢的作用，在临床上广泛用于缺血性心脑血管疾病的治疗。目前，用于临床用药的葛根素，主要以注射剂为主，虽然注射剂生物利用度较高，但不良反应也较多，主要包括发热、头晕及头痛、血管性水肿、过敏性休克等。通过分析近20年中药不良反应，葛根素注射液位列第18位(林吉等,世界科学技术—中医药现代化2005,7,48-53)。葛根素口服给药具有吸收快，并能显著减少注射剂造成不良反应的优点，同时具有但仍存在生物利用度低的不足，所以如何改善葛根素的生物利用度、提高药效，从而避免注射液造成的不良反应是现代中药新药研究的重要任务，也是中药标准化的重要评价指标。
甘草，在中医理论中最主要的应用为调和诸药。现代药理研究表明，当甘草和其他药物合用时也可以影响药物的吸收、分布、代谢和排泄(zhangw等,j.ethnopharmacol.2014,154,584-592；gulq等,foodchem.toxicol.2014,68,226-233)。甘草酸作为甘草的主要活性成分具有表面活性剂的性质，在配伍后不仅能起到增溶的作用，还能显著增强药效(sasakiy等,pharm.bull.1988,36,3491-3495)。
本发明基于将葛根素与甘草酸二种单体成分按不同比例组合，制成口服制剂，用于治疗缺血性心脏病，具有扩血管作用持久、药效稳定，提高单体葛根素口服生物利用度及不良反应少的特点，其良好的心肌保护作用，适用于抗缺血性心脏病的预防和治疗。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决现有单一化合物的葛根素在临床疗效和治疗范围的不足，及口服生物利用度差的问题，提供一种由葛根提取物和甘草提取物或者葛根素和甘草酸按不同比例配伍组成的新的中药组合物。葛根素与甘草酸的结构式如图1所示。该组合物与葛根素单一应用相比，具有协同增效作用，能显著地改善心肌缺血及保护心肌细胞耐缺血损伤。本发明所制备的组合物可用于制备缺血性心脏病的治疗药物。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的一种用于治疗缺血性心脏病的中药组合物，其由a)葛根提取物或者葛根素以及b)甘草提取物或者甘草酸组成。
其中，优选的，所述的葛根提取物按照以下方法制备得到：
(1)向容器中加入葛根中药原料重量20倍量蒸馏水，浸泡0.5-2小时，煎煮1-1.5小时，过滤得滤液ⅰ；
(2)向容器中的滤渣中再加入葛根中药原料重量20倍量蒸馏水，煎煮1-1.5小时，过滤得滤液ⅱ；
(3)向容器中的滤渣中再加入葛根中药原料重量20倍量蒸馏水，煎煮0.5-1.0小时，过滤得滤液ⅲ；
(4)合并步骤(1)-(3)中的滤液，减压浓缩，滤液浓缩为生药浓度为0.2g/ml的提取液；
(6)按照大孔树脂质量：生药质量＝1:10的量，称取d101型大孔树脂，称取d101型大孔树脂，预处理后上样。提取液以0.5bv·h-1流速缓慢通过d101型大孔树脂柱，吸附6h，用5bv的蒸馏水以2.0bv·h-1的流速冲洗，用molish反应进行检测，当反应呈阴性时，用5bv的30(v/v)％乙醇溶液进行洗脱，流速为0.5bv·h-1，收集30(v/v)％乙醇溶液洗脱部分减压浓缩后冷冻干燥，即得葛根提取物(bv：柱体积)。
其中，优选的，所得到的葛根提取物中葛根素纯度达到78％以上。
其中，优选的，所述的甘草提取物按照以下方法制备得到：
(1)向容器中加入甘草中药原料重量25倍的，含1(v/v)％氨水的60(v/v)％乙醇溶液，浸泡0.5-3小时，煎煮1-1.5小时，过滤得滤液ⅰ；
(2)向容器中的滤渣中再加入甘草中药原料重量8倍的，含1(v/v)％氨水的60(v/v)％乙醇溶液，煎煮1-1.5小时，过滤得滤液ⅱ；
(3)向容器的滤渣中再加入甘草中药原料重量8倍的，含1(v/v)％氨水的60(v/v)％乙醇溶液，煎煮0.5-1小时，过滤得滤液ⅲ；
(4)合并步骤(1)-(3)中滤液，减压浓缩，提取液用盐酸调节ph至1-2，过滤得粗品；
(5)将粗品用蒸馏水溶解为生药浓度为0.1g/ml的溶液，按照大孔树脂质量：生药质量＝1:10的量，称取d101型大孔树脂，预处理后上样；提取液以0.5bv·h-1流速缓慢通过d101型大孔树脂柱，吸附6h，用4-5bv的蒸馏水以2.0bv·h-1的流速冲洗，用molish反应进行检测，当反应呈阴性时，分别用3-4bv的30v/v％和50v/v％的乙醇溶液进行洗脱，流速为1bv·h-1，再用4-5bv的70(v/v)％乙醇溶液进行洗脱，流速为0.5bv·h-1洗脱液，收集70(v/v)％乙醇溶液洗脱部分减压浓缩后冷冻干燥，即得甘草提取物。
其中，优选的，所得到的甘草提取物中甘草酸纯度达到80％以上。
其中，优选的，所述的甘草为乌拉尔甘草、胀果甘草或光果甘草。
其中，优选的，该组合物中葛根提取物与甘草提取物的重量比例为1.09:1至2.72:1，优选为2.4:1或2.6:1；葛根素与甘草酸的重量比例为1:1至2.5:1，优选为2.0:1或2.2:1。
进一步的，本发明还提出了所述的用于治疗缺血性心脏病的中药组合物在制备治疗缺血性心脏病的药物中的用途。
其中，优选的，可按照中药常规制剂方法将所述的中药组合物制备成各种口服制剂。
其中，优选的，所述的口服制剂包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或丸剂。
实验证明：本发明的一种治疗缺血性心脏病的中药组合物能够显著缩小心肌梗死模型大鼠的心脏功能的检测指标的恢复，同时可以减少心肌细胞凋亡，缩小心肌梗死面积，对心肌缺血性疾病的预防和治疗具有潜在的开发价值。
附图说明
图1为葛根素(a)和甘草酸(b)的结构式。
图2为甘草提取物(a)和葛根提取物(b)的指纹图谱。
图3为中药组合物治疗心肌梗塞模型大鼠心肌缺血面积观察结果(a假手术组、b模型组、c葛根素组、d甘草酸组、e葛根素与甘草酸2:1合用组、f葛根素与甘草酸2.2:1合用组、g葛根提取物与甘草提取物2.4:1合用组、h葛根提取物与甘草提取物2.6:1合用组、i阳性药组)。
图4为中药组合物治疗心肌梗塞模型大鼠心肌组织masson染色结果(a假手术组、b模型组、c葛根素组、d甘草酸组、e葛根素与甘草酸2:1合用组、f葛根素与甘草酸2.2:1合用组、g葛根提取物与甘草提取物2.4:1合用组、h葛根提取物与甘草提取物2.6:1合用组、i阳性药组)。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、含有葛根提取物和甘草提取物的中药组合物的制备
葛根(经鉴定为野葛，产自湖北，购自闻诚医药销售有限公司)、甘草(经鉴定为乌拉尔甘草，产自甘肃，购自闻诚医药销售有限公司)；去离子水：经milli-q系统纯化(millipore,ma,usa)。
1.葛根提取物制备方法：
(1)向容器中加入葛根中药原料重量20倍量蒸馏水，浸泡1小时，煎煮1.5小时，过滤得滤液i；
(2)向容器中的滤渣中加入葛根中药原料重量20倍量蒸馏水，煎煮1小时，过滤得滤液ii；
(3)向容器中的滤渣中加入葛根中药原料重量20倍量蒸馏水，煎煮1小时，过滤得滤液iii；
(4)合并步骤(1)-(3)中的滤液，减压浓缩，滤液浓缩生药浓度为0.2g/ml的提取液；
(5)称取适量的d101型大孔树脂(大孔树脂质量：生药质量＝1:10)，预处理后上样。提取液以0.5bv·h-1流速缓慢通过d101型大孔树脂柱，吸附6h，用5bv的蒸馏水以2.0bv·h-1的流速冲洗，用molish反应进行检测，当反应呈阴性时，用5bv的30(v/v)％乙醇溶液进行洗脱，流速为0.5bv·h-1，收集30(v/v)％乙醇溶液洗脱部分减压浓缩后冷冻干燥，即得葛根素纯度达到78％的葛根提取物。
2.甘草提取物的制备：
(1)向容器中加入甘草中药原料重量25倍的60(v/v)％乙醇(含1v/v％氨水)，浸泡2小时，煎煮1.5小时，过滤得滤液i；
(2)向容器中的滤渣中再加入甘草中药原料重量8倍的60(v/v)％乙醇(含1v/v％氨水)，煎煮1小时，过滤得滤液ii；
(3)向容器中的滤渣中再加入甘草中药原料重量8倍的60(v/v)％乙醇(含1v/v％氨水)，煎煮1小时，过滤得滤液iii；
(4)合并步骤(1)-(3)中的滤液，减压浓缩，提取液用盐酸调节ph至1-2，过滤得粗品；
(5)将粗品用蒸馏水溶解为生药浓度为0.1g/ml的溶液。称取适量的d101型大孔树脂(大孔树脂质量：生药质量＝1:10)，预处理后上样。提取液以0.5bv·h-1流速缓慢通过d101型大孔树脂柱，吸附6h，用4-5bv的蒸馏水以2.0bv·h-1的流速冲洗，用molish反应进行检测，当反应呈阴性时，分别用3-4bv的30(v/v)％和50(v/v)％乙醇溶液进行洗脱，流速为1bv·h-1，再用4-5bv的70(v/v)％乙醇溶液进行洗脱，流速为0.5bv·h-1洗脱液，收集70(v/v)％乙醇溶液洗脱部分减压浓缩后冷冻干燥，即得甘草酸纯度达到85％的甘草提取物。
3、葛根提取物和甘草提取物指纹图谱检测
指纹图谱检测条件：
检测系统：agilent1260液相系统。色谱柱：sunfiretm-c18(4.6×150mm,3.5μm)(waters,ma,usa)；流速0.5ml/min；检测波长为270nm；柱温30℃；进样量5μl；梯度洗脱程序：0min,20％a；20min,30％a；26min,42％a；30min,52％a；38min,100％a；41min,100％a；42min,20％a；45min,20％a(a相为乙腈，b相为0.1％甲酸水)。
指纹图谱检测结果：
将葛根提取物的冻干粉末用去离子水配成0.02g/ml溶液，5μl进样，用agilent1260液相系统检测，结果如图2所示。图中可以看出葛根素是葛根提取物中含量最高的成分。
将甘草酸提取物的冻干粉末用70％甲醇配成0.02g/ml溶液，5μl进样，用agilent1260液相系统检测，结果如图2所示。图中可以看出甘草酸是甘草提取物中含量最高的成分。
4.中药组合物的制备：按照葛根提取物与甘草提取物的重量比例为1.09:1至2.72:1称取葛根提取物与甘草提取物，优选的葛根提取物与甘草提取物的重量比例为2.6:1或2.4:1，混合即得。
实施例2、含有葛根素和甘草酸的中药组合物的制备
葛根素(纯度98％)和甘草酸(纯度98％)购自南通飞宇生物科技有限公司。
将购买的葛根素和甘草酸按照以下比例混合：所述的葛根素与甘草酸的重量比例为1:1至2.5:1，优选的葛根素与甘草酸的重量比例为2.0:1或2.2:1。
实施例3、实施例1以及实施例2制备的中药组合物对心肌梗塞大鼠模型心脏功能的保护作用的应用
一、实验材料和方法
1.实验药物及试剂
含有葛根提取物和甘草提取物的中药组合物(实施例1制备)；含有葛根素和甘草酸的中药组合物(实施例2制备)；阳性药维拉帕米购自北京拜尔迪生物技术有限公司，经hplc/uv分析化合物纯度达到98％。戊巴比妥钠购自上海榕柏生物技术有限公司；脱毛膏购自美国nair公司。
2.实验方法：
(1)本研究使用清洁级级雄性sd大鼠，体重220±20g，由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。饮水供应充足，饲料和自来水自由摄取。室温保持在25℃，相对湿度为60±5％，12h黑暗-光照循环。
(2)动物分组及给药剂量：将sd雄性大鼠，随机分为9组，分别为假手术组、模型对照组、阳性药维拉帕米组、葛根素组、甘草酸组、葛根素和甘草酸2:1合用组、葛根素和甘草酸2.2:1合用组、葛根提取物和甘草提取物2.4:1合用组、葛根提取物和甘草提取物2.6:1合用组，各组10只。
(3)心肌梗塞动物模型的建立：采用采用结扎左冠状动脉前降支(lad)法建立大鼠心肌梗塞模型。用10％的水合氯醛3.3ml/kg，进行麻醉，常规消毒，行气管插管，接动物人工呼吸机，于左侧第四、五肋间打开胸腔，暴露心脏，于肺动脉圆锥与左心耳之间，左心耳根部下方2-3mm处穿线并结扎冠状动脉左前降支，关闭胸腔，缝合皮肤，局部应用青霉素以预防感染。术后观察心电图改变，剔除标准h导联心电图无st段或t波改变的大鼠。
(4)实验步骤：分别称取葛根素、甘草酸适量，加入0.3％cmc-na分别配成20、10mg/ml的溶液。称取葛根素和甘草酸适量，配成混合标准品溶液，其中葛根素和甘草酸浓度分别为20和10mg/ml。称取阳性药维拉帕米适量，加入0.3％cmc-na分别配成5mg/ml溶液。葛根提取物、甘草提取物浓度分别为25.64和9.8mg/ml。以上各组动物分别灌胃给药，假手术组、模型对照组大鼠给予10ml/kg/d蒸馏水。阳性药组给药剂量5mg/kg。葛根素组给药剂量为150mg/kg/d；甘草酸组剂量为75mg/kg/d；葛根素和甘草酸2:1合用组二者剂量分别为150、75mg/kg/d；葛根素和甘草酸2.2:1合用组二者剂量分别为150、68mg/kg/d；葛根提取物和甘草提取物2.4:1合用组二者剂量分别为192.3mg/kg/d、73.5mg/kg/d；葛根提取物和甘草提取物2.6:1合用组二者剂量分别为192.3mg/kg/d、67.9mg/kg/d。于第7d给药后1h建立大鼠心肌梗塞模型。
(5)造模成功后，给药14d，然后用脱毛膏给大鼠心脏周围脱毛，称重，2％戊巴比妥钠生理盐水溶液30mg/kgip麻醉大鼠，测心脏彩色多普勒超声，记录彩超情况。
二、实验结果
如表1所示，各组大鼠心肌梗死术后2周心动超声检查结果显示，心肌梗死模型组大鼠的左室收缩功能明显降低，葛根素组、葛根素和甘草酸2:1合用组、葛根素和甘草酸2.2:1合用组、阳性药组、葛根提取物和甘草提取物2.4:1合用组、葛根提取物和甘草提取物2.6:1合用组的大鼠lvef和fs与模型组比较均明显升高，其中葛根素和甘草酸2:1合用组、葛根提取物和甘草提取物2.4:1合用组、阳性药组大鼠的lvef和fs提高幅度尤为显著，与模型组比较有统计学意义(p<0.01)。说明葛根提取物(或葛根素)和甘草提取物(或甘草酸)配伍，能改善葛根素单独给药对模型大鼠的心功能的恢复。
表1.各组大鼠的给药2周后心脏功能检测。
注：与假手术组比较,**<0.01.与模型对照组比较,#<0.05,##<0.01.
实施例4、实施例1以及实施例2制备的中药组合物对心肌梗塞大鼠模型心肌细胞保护作用的应用
一、实验材料和方法
1、实验药物及试剂
含有葛根提取物和甘草提取物的中药组合物(实施例1制备)；含有葛根素和甘草酸的中药组合物(实施例2制备)；阳性药维拉帕米购自北京拜尔迪生物技术有限公司，经hplc/uv分析化合物纯度达到98％。he染色试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。
2.实验方法
(1)本研究使用清洁级级雄性sd大鼠，体重220±20g，由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。饮水供应充足，饲料和自来水自由摄取。室温保持在25℃，相对湿度为60±5％，12h黑暗-光照循环。
(2)动物分组及给药剂量：将sd雄性大鼠，随机分为9组，分别为假手术组、模型对照组、阳性药维拉帕米组、葛根素组、甘草酸组、葛根素和甘草酸2:1合用组、葛根素和甘草酸2.2:1合用组、葛根提取物和甘草提取物2.4:1合用组、葛根提取物和甘草提取物2.6:1合用组，各组10只。
(3)心肌梗塞动物模型的建立：采用采用结扎左冠状动脉前降支(lad)法建立大鼠心肌梗塞模型。用10％的水合氯醛3.3ml/kg，进行麻醉，常规消毒，行气管插管，接动物人工呼吸机，于左侧第四、五肋间打开胸腔，暴露心脏，于肺动脉圆锥与左心耳之间，左心耳根部下方2-3mm处穿线并结扎冠状动脉左前降支，关闭胸腔，缝合皮肤，局部应用青霉素以预防感染。术后观察心电图改变，剔除标准h导联心电图无st段或t波改变的大鼠。
(4)实验步骤：
分别称取葛根素、甘草酸适量，加入0.3％cmc-na分别配成20、10mg/ml的溶液。称取葛根素和甘草酸适量，配成混合标准品溶液，其中葛根素和甘草酸浓度分别为20和10mg/ml。称取阳性药维拉帕米适量，加入0.3％cmc-na分别配成5mg/ml溶液。葛根提取物、甘草提取物浓度分别为25.64和9.8mg/ml。以上各组动物分别灌胃给药，假手术组、模型对照组大鼠给予10ml/kg/d蒸馏水。阳性药组给药剂量5mg/kg。葛根素组给药剂量为150mg/kg/d；甘草酸组剂量为75mg/kg/d；葛根素和甘草酸2:1合用组二者剂量分别为150、75mg/kg/d；葛根素和甘草酸2.2:1合用组二者剂量分别为150、68mg/kg/d；葛根提取物和甘草提取物2.4:1合用组二者剂量分别为192.3mg/kg/d、73.5mg/kg/d；葛根提取物和甘草提取物2.6:1合用组二者剂量分别为192.3mg/kg/d、67.9mg/kg/d。于第7d给药后1h建立大鼠心肌梗塞模型。
(5)造模成功后，给药14d，取各组大鼠的心肌组织固定24h后，进行常规石蜡包埋、切片、h&e染色，光镜观察心肌病理形态学改变。心肌超微结构的观察：取约1×1×3mm3缺血心肌组织放入2％戊二醛磷酸缓冲液固定，常规制备超薄切片、染色，电镜观察心肌超微结构的变化。
二、实验结果
如图3所示，假手术组心肌细胞形态正常，胞浆纹理清晰。模型组部分心肌细胞水肿，轻度脂肪变性，部分心肌细胞肌浆凝聚、核固缩、间质出血。葛根素和甘草酸2:1合用组、葛根提取物和甘草提取物2.4:1合用组心肌细胞排列紧密、核大，多呈椭圆形深染，胞浆纹理清晰，无明显变性坏死。葛根素组、葛根素和甘草酸2.2:1合用组、葛根提取物和甘草提取物2.6:1合用组大部分心肌细胞形态正常，偶见轻度脂肪变性。表明药物合用组较葛根素单独给药组能明显改善心肌细胞的变性坏死，从而使心肌收缩力增强。
观察结果表明，葛根提取物和甘草提取物组成的中药组合物及葛根素和甘草酸组成的中药组合物对心肌梗塞大鼠模型心肌细胞缺血损伤具有良好的保护作用。
实施例5实施例1以及实施例2制备的中药组合物对心肌梗塞大鼠模型心肌纤维化的影响。
一、实验材料和方法
1、实验药物及试剂
含有葛根提取物和甘草提取物的中药组合物(实施例1制备)；含有葛根素和甘草酸的中药组合物(实施例2制备)；阳性药维拉帕米购自北京拜尔迪生物技术有限公司，经hplc/uv分析化合物纯度达到98％。masson三色染色液购自北京索莱宝生物科技有限公司。
2、实验方法
(1)本研究使用清洁级级雄性sd大鼠，体重220±20g，由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。饮水供应充足，饲料和自来水自由摄取。室温保持在25℃，相对湿度为60±5％，12h黑暗-光照循环。
(2)动物分组及给药剂量：将sd雄性大鼠，随机分为9组，分别为假手术组、模型对照组、阳性药维拉帕米组、葛根素组、甘草酸组、葛根素和甘草酸2:1合用组、葛根素和甘草酸2.2:1合用组、葛根提取物和甘草提取物2.4:1合用组、葛根提取物和甘草提取物2.6:1合用组，各组10只。
(3)心肌梗塞动物模型的建立：采用采用结扎左冠状动脉前降支(lad)法建立大鼠心肌梗塞模型。用10％的水合氯醛3.3ml/kg，进行麻醉，常规消毒，行气管插管，接动物人工呼吸机，于左侧第四、五肋间打开胸腔，暴露心脏，于肺动脉圆锥与左心耳之间，左心耳根部下方2-3mm处穿线并结扎冠状动脉左前降支，关闭胸腔，缝合皮肤，局部应用青霉素以预防感染。术后观察心电图改变，剔除标准h导联心电图无st段或t波改变的大鼠。
(4)实验步骤
分别称取葛根素、甘草酸适量，加入0.3％cmc-na分别配成20、10mg/ml的溶液。称取葛根素和甘草酸适量，配成混合标准品溶液，其中葛根素和甘草酸浓度分别为20和10mg/ml。称取阳性药维拉帕米适量，加入0.3％cmc-na分别配成5mg/ml溶液。葛根提取物、甘草提取物浓度分别为25.64和9.8mg/ml。以上各组动物分别灌胃给药，假手术组、模型对照组大鼠给予10ml/kg/d蒸馏水。阳性药组给药剂量5mg/kg。葛根素组给药剂量为150mg/kg/d；甘草酸组剂量为75mg/kg/d；葛根素和甘草酸2:1合用组二者剂量分别为150、75mg/kg/d；葛根素和甘草酸2.2:1合用组二者剂量分别为150、68mg/kg/d；葛根提取物和甘草提取物2.4:1合用组二者剂量分别为192.3mg/kg/d、73.5mg/kg/d；葛根提取物和甘草提取物2.6:1合用组二者剂量分别为192.3mg/kg/d、67.9mg/kg/d。于第7d给药后1h建立大鼠心肌梗塞模型。
(5)造模成功后，给药14d，心脏组织取出后，分离左心室，10％福尔马林(ph＝7.4)中孵育过夜。masson染色(accustainht15,sigmaaldrich,st.louis,mo)，镜下观察，计算间质纤维区域(image-proplusv4.0；meidacybernetics,bethesda,md,usa)，可看到胶原纤维呈蓝色，胞浆，纤维素呈红色，胞核呈暗蓝色。
二、实验结果
各组心肌组织masson染色，如图4、表2所示。假手术组未见明显病理学改变，心肌纤维有轻微的增生。与假手术组比较，模型组大鼠心肌胶原纤维明显增多，心肌纤维排列紊乱且间隙变窄，结缔组织增生严重，纤维瘢痕形成，心肌纤维化程度较重，心肌胶原cvf为(47.67±7.79)％(p<0.01)。与模型组比较，葛根素组、葛根素和甘草酸2:1合用组、葛根素和甘草酸2.2:1合用组、阳性药组、葛根提取物和甘草提取物2.4:1合用组、葛根提取物和甘草提取物2.6:1合用组的大鼠心肌纤维化程度均不同程度减轻，梗死区有少量心肌坏死和轻微炎性浸润，纤维结缔组织增生不明显。其中，甘草酸2:1合用组、葛根提取物和甘草提取物2.4:1合用组胶原沉积有所减轻最为明显(p<0.01)。
观察结果说明，葛根提取物和甘草提取物中药组合物及葛根素和甘草酸的中药组合物能有效降低心肌梗死大鼠模型心肌纤维化程度，具有抗心肌梗死大鼠心肌纤维化的作用。
表2.各组大鼠的给药2周后心肌组织中胶原cvf含量检测。
注：与假手术组比较,**<0.01.与模型对照组比较,#<0.05,##<0.01。