五味子乙素在制备预防或治疗肾脏纤维化药物中的用途的制作方法

本发明涉及医药领域，具体涉及五味子乙素的医药用途。

背景技术：

慢性肾脏疾病(ckd)定义为出现肾结构和/或功能的异常≥3个月，或肾小球滤过率出现不明原因降低且低于60ml/1.73m²，≥3个月。ckd是以肾功能逐渐丧失和不可逆的进展为特征,最终发展为终末期肾衰竭(esrf)。ckd是导致全球发病率和死亡率增加的一个重要原因，已经成为主要的世界性公共健康问题。慢性肾脏疾病可导致终末期肾脏疾病，以及增加与心血管疾病相关的发病率和死亡率。据相关研究报道，在未来20年，ckd的发病率预计不断增加。在世界卫生组织2013年的全球疾病负担研究中，大约有965，200人死于慢性肾脏病，死亡人数相比于1990年增长了134％，是引起死亡上涨最多的诱因之一，也是诱导心脑血管疾病发生的重要因素。

在世界范围内，超过1,400万的终末期肾脏病患者只能通过接受透析和肾脏移植来进行替代治疗，同时这个数字以每年8％的速度增长。由于糖尿病，高血压等疾病的急剧增加，使得ckd的发病风险随之增大，为卫生保健资源带来了巨大的压力。ckd是各种心血管疾病的强致病因素，ckd期的发生导致心血管发病率和死亡率增加。中国大陆的公共卫生保健统计显示，esrf已经成为中国成年人群的主要健康问题之一。在过去10年中，慢性肾脏疾病作为一个主要的公共卫生问题受到越来越多的关注。由于治疗方法的局限性和昂贵的医药费用，为患者及其家庭带来相当大的负担，对国家医疗保健预算和个体患者产生巨大影响。

肾脏纤维化与慢性肾脏疾病(ckd)的进展有着十分密切的关联，在ckd的致死原因中，纤维化疾病可以占总死因的45％。肾脏纤维化以肾小管间质性纤维化(tif)为主要特征，肾小管发生萎缩，肾小球出现硬化，肾脏的正常结构被破坏，从而导致终末期肾病的发生。最近的证据显示，损伤肾小管上皮细胞诱导成纤维细胞或肌成纤维细胞的积累和丰富的细胞外基质(ecm)通过上皮间质转变(emt)的沉积，最终导致tif和ckd的进展。其中，上皮间质转化(emt)发挥了重要的作用。肾脏纤维化的标志是成纤维细胞或肌成纤维细胞的激活和积累以及丰富的细胞外基质(ecm)的沉积。上皮间充质转化(emt)，及其包含的炎细胞浸润，细胞外基质增多等是肾损伤和肾脏纤维化发生的重要机制。

在现有的对于肾脏纤维化的治疗方案和治疗药物中，通过中药来治疗慢性肾脏纤维化越来越受重视，其中研究最多的为大黄、黄芪、丹参、川芎、三七等单药及当归黄芪合剂、化瘀解毒汤、肾益解毒汤等复方制剂。

五味子，俗称为北五味子，是重要的中国传统中药材。五味子是同名木兰科植物五味子schisandrachinensis(turcz.)baill的成熟果实经晒干后所得。五味子最早的记载可以追溯到我国古代药物学专著《神农本草经》中，味酸温，主益气，咳逆上气，劳伤羸瘦，补不足，强阴，益男子精(御览引云，一名会及，大观本，作黑字)，生山谷。味酸温。五味形又似肾，故为补肾之要药。藏者冬之令，属肾，故五味能补肾也。在中国传统中医实践治疗中，五味子的疗效已经得到验证，同时多年的药用经验和实验证据表明，五味子对人体以及实验动物和细胞的毒性几乎没有，特别适用于治疗生理机能已经出现不适的机体，不会造成更多的伤害。近些年来，越来越多的现代研究者把重点放在五味子更深入的研究上。

在以前的研究中，通常都是以合剂的形式研究中药治疗慢性肾脏纤维化的作用，而没有深入研究具体到某一种中药的某一种具体成分对肾脏纤维化的作用。

技术实现要素：

将五味子乙素分别给予tgf-β1诱导的hk-2细胞(人肾近端肾小管上皮细胞)和nrk-52e细胞(大鼠肾小管上皮细胞)以治疗纤维化，给予单侧输尿管梗阻模型(uuo模型)造模的小鼠肾脏以治疗纤维化，观察五味子乙素对于细胞形态，ecm胶原蛋白沉积量，以及emt的marker蛋白mrna的表达量的影响，发现五味子乙素具有以下药理作用：

对经tgf-β1处理的hk-2细胞形态产生明显的影响：与只用tgf-β1处理的细胞相比，经过五味子乙素预处理后再进行tgf-β1处理的细胞，细胞形态并没有纤维细胞样改变，并且细胞间连接紧密。

对经tgf-β1处理的hk-2细胞的ecm胶原沉积量有明显的影响：与只用tgf-β1处理的hk-2细胞和nrk-52e细胞相比，经过五味子乙素预处理再进行tgf-β1处理的hk-2和nrk-52e细胞的ecm胶原蛋白沉积量均有明显改善。

对经tgf-β1处理的hk-2和nrk-52e细胞emt相关蛋白的表达量有明显影响：与只用tgf-β1处理的hk-2和nrk-52e细胞相比，经过五味子乙素预处理再进行tgf-β1处理的hk-2和nrk-52e细胞的emt发展的程度有改善。

对uuo造模的小鼠肾脏近曲小管细胞有作用：相比于造模组，灌胃五味子乙素的小鼠肾脏肾小管萎缩和纤维化的程度明显减轻。

对uuo造模的小鼠肾脏近曲小管细胞有作用：相比于造模组，灌胃五味子乙素的小鼠肾脏emt相关蛋白表达量和间质胶原蛋白沉积明显下降。

药理实验结果表明，五味子乙素对于肾脏纤维化有保护作用。

五味子乙素能应用于制备预防或治疗肾脏纤维化的药物。

五味子乙素能应用于制备预防或治疗肾小管上皮细胞损伤引发的肾脏纤维化药物。

五味子乙素能应用于制备预防或治疗肾脏细胞外基质胶原沉积量过多引发的肾脏纤维化的药物。

五味子乙素能应用于制备预防或治疗肾脏上皮间质转变引发的肾脏纤维化药物。

五味子乙素能应用于制备预防或治疗输尿管梗阻引发的肾脏纤维化药物。

五味子乙素能应用于制备预防或治疗肾小管萎缩和纤维化引发的肾脏纤维化药物。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：

图1是实施例一的实验图片；

图2是实施例二的实验图片；

图3是实施例三的实验图片；

图4是实施例四的切片图片；

图5是实施例四的qpcr实验数据图片；

附图中control表示空白对照组；schb表示五味子乙素。

具体实施方式

下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1：

步骤一：用人乳头状瘤病毒(hpv)16的e6/e7基因把人肾近端肾小管上皮细胞系(hk-2细胞)转导使其永生化；

步骤二：将步骤一获得的hk-2细胞常规培养于含有体积分数为10％胎牛血清(fbs)，100iu/ml青霉素和100mg/ml链霉素的dmem/f12完全培养基中，放于37℃，体积分数为5％二氧化碳培养箱培养；

步骤三：将步骤二获得的hk-2细胞用质量分数0.25％胰酶消化后，以2×10⁵个/每孔的密度接种于6孔板，放于37℃，体积分数为5％二氧化碳培养箱隔夜培养，次日当细胞融合度至60％～70％后，设置三个实验组：

空白对照组：不添加tgf-β1、不添加五味子乙素；

实验处理组1：添加浓度为5ng/ml的tgf-β1、不添加五味子乙素；

实验处理组2：添加五味子乙素预处理2小时后，再添加浓度为5ng/ml的tgf-β1；

三个实验组均继续培养，培养到6h、24h、48h时，用显微镜拍照获取相应时间点的细胞形态图像；显微镜的放大倍数为100倍。

观察培养24h后，对hk-2细胞形态学的影响：

结果表明：如图1的a,b所示，空白对照组的细胞形态呈现鹅卵石状，典型的上皮细胞形态；如图1的c,d所示，实验处理组1的细胞形态发生明显变化，变化为成纤维细胞样形状，可通过存在细长的薄片状核和纺锤形状来识别；如图1的e,f所示，经过五味子乙素预处理后，虽然添加了tgf-β1，但细胞形态则并没有纤维细胞样改变，并且细胞间连接紧密。

实施例2：

天狼猩红染色测细胞外基质胶原蛋白沉积量：

(1)人肾近端肾小管上皮细胞系(hk-2细胞)培养方法同实施例一中的步骤一和步骤二，而后将hk-2细胞传代，再接种在96孔板中，5000个细胞每孔，过夜培养。待细胞融合度至60％～70％后，随之用无血清培养基替换，同步化处理24小时；

(2)用完全培养基配制浓度为5ng/ml的tgf-β1，备用；

配制浓度为0.5um、1um、5um、10um、25um、50um的五味子乙素，备用；

设置三个实验组：

空白对照组：不添加tgf-β1、不添加五味子乙素；

实验处理组1：添加浓度为5ng/ml的tgf-β1、不添加五味子乙素；

实验处理组2：往不同待测样中分别添加配制好的不同浓度的五味子乙素，预处理2小时后，轻柔吸出孔内无血清培养基，再分别添加浓度为5ng/ml的tgf-β1；

三个实验组均放于细胞培养箱中培育24小时；

(3)按每100μl培养液加入10μlcck-8试剂的比例往三个实验组的孔内加入cck-8试剂，放于37℃，体积分数为5％二氧化碳培养箱孵育2～3小时后，使用酶标仪在固定波长下(470nm)测量od值；

(4)将已测过od值的96孔板用冰的pbs轻柔的清洗三次，用4℃冰甲醇固定1小时，将其轻缓吸出后，再用pbs清洗三次，动作要轻；

(5)用体积分数为1％醋酸清洗两次，弃掉(动作要轻柔)，每孔加入100ul体积分数0.1％的天狼猩红染液，在摇床上室温放置2小时，100rpm；

(6)再次用体积分数为1％醋酸清洗三次，弃掉，每孔加入0.1m的naoh溶液，摇床放置30分钟，进行振荡溶解，室温即可(在空白孔中加入naoh溶液进行调零)；

(7)使用酶标仪进行od540nm的测值，进行数据分析。

对胶原沉积量的影响：

如图2所示，结果表明：随五味子乙素浓度的增加，细胞外基质胶原蛋白沉积量逐渐下降。有明显改善。二者趋势呈相关性变化。

实施例3：

人肾近端肾小管上皮细胞系(hk-2细胞)培养方法同实施例一中的步骤一、步骤二。

qpcr法测emt相关蛋白mrna表达量：

把上述培养方法得到的hk-2细胞用0.25％胰酶消化后，以2×10⁵个/每孔的密度接种于6孔板，放于37℃，体积分数为5％二氧化碳培养箱隔夜培养，次日当细胞融合度至60％～70％后，进行下列步骤：

总rna提取：

(1)把hk-2细胞以2×10⁵/每孔的密度接种于6孔板中，共设置四个实验组：

空白对照组：不添加tgf-β1、不添加五味子乙素；

实验处理组1：添加浓度为5ng/ml的tgf-β1、不添加五味子乙素；

实验处理组2：往本组待测样中添加浓度为5um的五味子乙素预处理2小时，后加入浓度为5ng/ml的tgf-β1；

实验处理组3：往本组待测样中添加浓度为25um的五味子乙素预处理2小时，后加入浓度为5ng/ml的tgf-β1。

四个实验组继续培养24小时；

(2)将6孔板中细胞培养基弃掉，用4℃pbs轻柔地冲洗三次，6孔板的每三个孔加入1mltrizol，在4℃冰箱静置10～30分钟，待细胞充分裂解之后，吹打混匀，收集至1.5ml的ep管中，保存于-80℃冰箱待用；

(3)待使用时，提前取出，室温静置至溶解，随后按1mltrizol中加入0.2ml的氯仿的比例往细胞裂解液中加入氯仿；

(4)猛烈晃动15秒左右，将混合液颠倒混匀，室温静置3分钟。随后12,000g,4℃离心15分钟；

(5)将总rna的上层水相吸至新的ep管中；

(6)往步骤(5)得到的上层水相中加入等体积异丙醇后颠倒混匀；

(7)室温静置10分钟。再次12,000×g,4℃离心10分钟，即可在管底见白色胶状rna沉淀；

(8)将上清丢弃后加入1ml体积分数为75％乙醇(使用depc水配制)，颠倒混匀；

(9)以7,500×g,4℃离心5分钟，弃上清后，再次以7,500×g,4℃离心1分钟，吸尽液体；

(10)加入1ml无水乙醇，-80℃保存即可。

cdna合成及qpcr荧光实时定量法测mrna的方法与takarabiotechnology公司的逆转录试剂盒、premixextaq^tm试剂盒说明书一致。

大鼠肾小管上皮细胞(nrk-52ecells)的试验方法步骤与hk-2细胞相同。

对emt相关蛋白的影响：

如图3的a表示，五味子乙素降低hk-2细胞中emt相关蛋白的表达。1型胶原蛋白，4型胶原蛋白以及snail1的表达均发生明显降低。

如图3的b所示，五味子乙素降低nrk-52e细胞中emt相关蛋白的表达。1型胶原蛋白以及slug1的表达均发生明显降低。

总结图3的a、b，实验数值表示为平均值±sd，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，均与空白对照组相比；

实施例4：

取km小鼠，体重40±5g，适应性饲养一周后，设置如下实验组：

空白对照组：灌胃橄榄油；

实验处理组1：灌胃橄榄油三天后进行uuo造模手术，此后三天依然灌胃橄榄油；

实验处理组2：按照50mg五味子乙素：1kgkm小鼠体重的比例，称取五味子乙素；然后用橄榄油悬浮五味子乙素，对km小鼠多次灌胃，平均每只km小鼠每次灌胃剂量约200ul，灌胃三天，然后进行uuo造模手术，术后按照术前灌胃方式继续灌胃三天；

实验处理组3：按照100mg五味子乙素：1kgkm小鼠体重的比例，称取五味子乙素；然后用橄榄油悬浮五味子乙素，对km小鼠多次灌胃，平均每只km小鼠每次灌胃剂量约200ul，灌胃三天，然后进行uuo造模手术，术后按照术前灌胃方式继续灌胃三天。

至第六天全部处死收集标本，进行qpcr实验及肾脏切片染色，具体试验方法如下：

小鼠灌胃：

1)提前摇晃ep管使其中的药物混匀，不带灌胃针吸取混悬液；

2)左手捉拿小鼠使其腹部朝上，右手持灌胃器(1ml注射器+12号灌胃针)；

3)操作时，先从小鼠口角将灌胃针插入口腔内，然后用灌胃针向后上方压迫小鼠头部，使口腔与食道成一条直线，再将灌胃管沿上颌壁轻轻推入食道；

4)当推进2～3cm可稍感有阻力，表明到达膈肌(此时12号灌胃针可以几乎全部进入小鼠口腔中)，此时即可推进注射器进行灌胃。

5)若注射器推注困难应抽出重插，若误入气管给药，可使小鼠立即死亡；

6)注药后轻轻拔出灌胃管，一次灌药剂量为0.1～0.3ml/只。

uuo造模手术：

1)每只小鼠(40g左右)腹腔注射400ul质量分数为0.8％戊巴比妥钠进行深度麻醉，此麻醉状态下小鼠较少因疼痛而挣扎而抽搐，且为安全的麻醉剂量，术后约1.5h可苏醒活动如常；

2)将小鼠用医用胶带固定于小鼠解剖台(四肢、尾巴)，左腋中线及左下腹褪毛，用医用酒精润湿。

3)沿左腋中线，腋下2～3cm做切口，切口可略微开大一点，打开腹膜后向深部寻找肾脏，极易找到，找到肾脏后轻轻提起肾脏，下端白色线状组织即为输尿管及其包绕的结缔组织，一并结扎，做近端、远端两处结扎。

4)放回肾脏，关闭腹膜，缝合皮肤。

5)等待小鼠苏醒，观察其状态，实验结束。

标本收集：

1)颈椎脱臼法处死小鼠，行中线剖腹术，取出两侧肾脏，去除肾包膜。

2)迅速将肾脏对半纵切，一半均分为2～3份(视肾脏大小而定，若较大可分为5～6份)，每份用锡纸包好，迅速放入液氮中，随后转移到-80℃冰箱中长期保存。为后续pcr试验做准备。

3)另一半用多聚甲醛固定，肾脏体积：多聚甲醛≤1:10，两天后去掉多聚甲醛，加入体积分数为70％酒精脱水。

4)以上过程于冰上进行。

he染色：

(1)肾脏组织固定后，进行脱水；

(2)将已脱水的组织用石蜡包埋机进行包埋；

(3)切片，60℃烘烤20分钟；

(4)更换二甲苯，将切片浸泡10分钟后，再于各级酒精中洗掉二甲苯，以增加水分，每次持续时间为5分钟，最后放于蒸馏水；

(5)苏木素染核约5分钟，自来水洗，固定蓝染(若染色过深则用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝)；

(6)伊红染胞浆约1分钟，自来水洗(若染色过深则用体积分数为80％～95％乙醇分化)；

(7)切片于60℃烘烤15分钟进行脱水；

(8)二甲苯浸泡10分钟，两次；

(9)适宜浓度封固剂(树胶)进行封片；

(10)显微镜下观察切片，进行拍照。

免疫组化：

收集肾组织，用4％甲醛固定，切片。用抗e-cadherin(e-ca)，抗波形蛋白(vimentin)和抗四型胶原(coltypeⅳ)抗体染色小鼠肾脏标本，0.5％tritonx-100在4℃放置14小时通透性处理，然后用alexafluor488或588(invitrogen)的二抗孵育。

参考实施例3，qpcr法测肾脏组织中emt相关蛋白mrna表达量和间质胶原蛋白沉积。

实验结果：

1.对细胞形态改变的影响

如图4的he染色的结果所示，相比于空白对照组，实验处理组1即uuo模型组的肾小管萎缩和纤维化程度明显，而实验处理组2中用低、高浓度五味子乙素治疗的小鼠肾脏肾小管萎缩和纤维化则不明显。

2.对肾小管emt相关蛋白和间质胶原蛋白沉积的影响

如图4的免疫组化和图5中qpcr的结果显示，相比于实验处理组1(uuo模型组)，实验处理组2中用低、高浓度五味子乙素治疗的小鼠emt相关蛋白(vimentin，snail)的表达明显下降，胶原(一型胶原，四型胶原)相对表达量明显下降，实验数值表示为平均值±sd，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，均与空白对照组相比。

以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。