一种薏米发酵提取物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及化妆品
技术领域：
，具体地说是一种薏米发酵提取物及其制备方法和应用。
背景技术：
薏米为薏仁属禾本科植物，主产于33°n以南的广大地区。薏仁的籽实、根、茎、叶等都可以为人类所利用，其营养价值和药用价值都是其他植物所不能比拟的，因此，被誉为“世界禾本科植物之王”。卫生部现在已将薏仁列为既是食品又是药品的品种名单。目前，市场上含有薏米成分的化妆品，都是在化妆品基础配方内添加一定比例的薏米提取物，其添加量较低，同时受提取条件限制，提取物中所含物质成分有限，不能充分发挥薏米的美容功效。因此，现有技术还有待发展。技术实现要素：鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种薏米发酵提取物及其制备方法。旨在解决现有提取技术效率低下的问题。为了达到上述目的，本发明提供一种薏米发酵提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)配料：配料：发酵菌：薏米粉末：水＝5～10ml：10-15g、250～350ml；所述发酵菌浓度为105-106cfu/ml；2)制备初始体系：将所述薏米粉末、发酵菌、水充分混合，得到初始体系；3)发酵：对初始体系进行发酵处理，得到发酵液；4)得成品：对发酵液依次进行灭菌、离心处理后收集上清液，得到所述薏米发酵提取物；所述发酵菌采用酵母菌的菌液。进一步的，所述酵母菌采用红法夫酵母。进一步的，所述薏米粉末的目数为20-40目，具体为30目。进一步的，所述初始体系是取发酵菌的菌液8ml、30目薏米粉10g和水300ml混合而得。进一步的，所述发酵中发酵温度为20-30℃，发酵时间为35-40小时。所述发酵的发酵温度为28℃。进一步的，所述离心转速为10000-12000r/min，离心半径为9-12cm；离心时间为15-30min，具体为22min。本发明还提供了一种所述的制备方法制备的薏米发酵提取物。本发明还提供了所述薏米发酵提取物在制备具有下述至少一种功能的化妆品中的应用或直接作为具有下述至少一种功能的化妆品中的应用：1)清除dpph自由基；2)抑制酪氨酸酶活性；3)保湿。进一步的，所述化妆品为面膜、精华液或爽肤水。本发明与现有技术相比，具备如下优势：(1)本发明采用红法夫酵母对薏米进行全植物发酵，保留了植物的全部功效成分及其活性，避免了提取方法造成的活性成分流失。(2)本发明所采用的发酵法，在对薏米有效成分提取过程中，不添加任何有机试剂，发酵温度和发酵ph温和，植物活性成分结构不被破坏，保持植物的天然活性。(3)本发明提供的薏米提取物发酵完成后，可做为化妆品直接使用，发酵原浆中不添加香精等对化学成分，确保产品对人体的安全性。(4)本发明提供的薏米发酵提取物中富含具有抑制酪氨酸酶活性和抑制黑色素合成的活性物质，从而对皮肤具有较强的美白功能，同时与发酵提取物中的成分具有协同作用。(5)本发明提供的薏米发酵提取物化妆品具有减缓皮肤水分流失的作用，从而达到保湿的功效。(6)本发明提供的薏米发酵提取物具有分子量小，易于皮肤吸收的优点。附图说明图1为薏米发酵提取物化妆品清除dpph自由基结果示意图；图2为薏米发酵提取物化妆品抑制酪氨酸酶活性结果示意图；图3为薏米发酵提取物分子量示意图；图4为薏米发酵提取物化妆品减缓皮肤水分流失结果示意图。具体实施方式以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明所用薏米为市售薏米，粉碎后经过筛分去除了尺寸较大的颗粒，保留目数为20-40目的薏米粉末。本发明所用红法夫酵母(phaffiarhodozyma)购自苏州北纳创联生物技术有限公司，胶红酵母、乳杆菌、酿酒酵母购自中国普通微生物菌种保藏中心。下述实施例所用红法夫酵母按照如下步骤进行预处理：发酵过程首先将菌种进行活化，使保持更高的生活力；然后将菌纯化，使发酵时使用单一菌种；接着扩培使菌大量繁殖。将扩培后的菌接入薏米粉与水的混合液在适应的条件下进行发酵，然后离心取上清进行检测。具体过程如下：(1)菌种活化：从保藏的斜面中挑取菌落放入液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。该活化采用该菌种常规的活化方法，本发明中不作展开描述。(2)菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落。(3)菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在20-30℃的摇床中培养，至其od值＝0.5-1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度105-106cfu/ml。所用培养基为麦芽汁琼脂培养基，组成如下：酵母浸粉100ml，琼脂1.5g。实施例1将扩培培养基里的发酵菌浓度为1o5-106cfu/ml的发酵菌菌液8ml接种到30目10g的薏米粉和300ml的水中，并且在28℃摇床中进行发酵40小时后，将所得发酵液进行115℃高压灭菌，20min高压灭菌，使菌失活，将灭菌后的发酵液在12000r/min、离心半径为9cm的条件下离心20min，收集上清液，即为本发明提供的薏米发酵提取物。该实施例制备所得的薏米发酵提取物可直接作为化妆品使用，其外观为粘稠液体、颜色为淡粉色至棕红色。ph值5.2-6.8，粘度200-500cp，可溶性固含物含量2-5.0％，菌落总数小于50cfu/ml，无致病菌检出，符合化妆品质量要求。对该薏米发酵提取物化妆品进行成分分析，蛋白质检测方法参照gb5009.5-2010；粗多糖检测方法参照gb/t5009.8-2008；氨基酸检测方法参照gb/t5009.124-2003所得结果如下：表1不同菌株对薏米发酵提取物的成分分析(g/kg)含粗多糖总黄酮总酚总蛋白胶红酵母5.230.150.041.6乳杆菌4.020.130.031.3酿酒酵母7.150.160.031.4红法夫酵母10.070.330.084.4如表1所述，红法夫酵母制得的薏米发酵提取物化妆品含蛋白质4.4g/kg、粗多糖10.07g/kg、总黄酮0.033g/kg(以芦丁计)、总酚0.08g/kg。因此，对红法夫酵母制得的薏米发酵提取物进行进一步分析。实施例2dpph是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，dpph的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对dpph自由基的清除效果。dpph自由基清除实验的具体实验步骤为：(1)取等体积(一般为3ml)的待测液与2×10-4mol/l的dpph溶液混匀(a1管)；(2)取等体积的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10-4mol/l的dpph溶液混匀(a2管)；(3)取等体积的无水乙醇与待测液混匀(a3管)；(4)反应30min后，在517nm下测a1、a2、a3管吸光度值。清除率计算公式为：清除率(％)＝[(a2+a3)-a1]/a2由图1所示的结果可知，实施例1所得薏米发酵提取物对dpph清除作用的ic50＝3.91％，说明薏米发酵提取物具有较强的抗氧化能力可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。实施例3酪氨酸酶是黑素生成的关键酶，它控制着黑素的形成过程，其活性程度对色素的沉积起主要作用。目前市场上销售的许多美白、祛斑产品都是以抑制酪氨酸酶达到美白作用，故对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价增白化妆品的主要指标。通过测定样品对酪氨酸酶的影响来评价样品的美白功能，具体方法如下：按表2所示配比配置溶液：表2、溶液配制列表单位(ml)c1c2t1t2l-酪氨酸2222样品0022pbs4523酪氨酸酶1010总体积7777注：c1和t1加入1ml酪氨酸酶，酶活为100u/ml。(1)c2管配好摇匀后，在37℃水浴锅中水浴加热10min，波长475nm下调零。(2)c1管溶液配好摇匀，37℃水浴10min后，加酪氨酸酶1ml，继续水浴10分钟，测定c1吸光度值。(3)按(1)(2)同样方法，以t2调零测定t1吸光度值。(4)计算样品对酪氨酸酶的活性抑制率t(％)。t(％)＝(c1-t1)/c1×100％如图2所示，实验证明薏米发酵提取物对酪氨酸酶活性的平均抑制率为64.53％，1％的熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制率99.52％，即薏米发酵提取物的美白效果相当于64.84％的熊果苷的效果，具有一定的美白功效。实施例4斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对薏米发酵提取物化妆品进行人体封闭式斑贴试验，对其潜在皮肤刺激性进行评估。选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。称取0.020g-0.025g将固体样品或半固体的样品放入斑试器中备用。将液体样品0.2ml到0.025ml滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油。试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。斑贴试验结果如表3：表3、斑贴试验结果*″-″＝阴性反应；″±″＝可疑反应：仅有微弱红斑；″+″＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；″++″＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区；″+++″＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。由表3可知，实施例1提供的薏米发酵提取物在试验中未产生不良反应。经判定，薏米发酵提取物具有安全性，不会给人体带来安全隐患。实施例5薏米发酵提取物的分子量大小检测分子量大小是检验是否能够进行皮肤渗透的重要因素。本发明通过高效液相色谱(hplc)测定实施例1制备的薏米发酵提取物的分子量大小。具体步骤如下：1、试验的试剂和溶液的制备(1)流动相：乙腈∶水∶三氟乙酸＝30∶70∶0.1(v/v/v)。(2)样品制备：以流动相为溶剂配制浓度为5mg/ml的样品，再在用微孔膜(0.45μm)过滤后供进样。(3)标准样品制备：将牛血清蛋白(mr67000)、b12(mr1335)、氧化型谷胱甘肽(mr614)配成混标，每种物质的浓度均为5mg/ml。2、试验方法将三种已知分子量的标准品：牛血清白蛋白(mw67000)，维生素b12(mw1335)和氧化型谷胱甘肽(mw614)通过高效液相色谱仪(waters公司)参照文献“王成忠等.蛋白酶酶解麦胚蛋白及酶解液中多肽分子量分布的研究.粮食加工，2012：37(2)”中的方法进行hplc分析，绘制分子量对数与洗脱时间的标准曲线。根据凝胶柱渗透层析原理，多肽分子量大的物质先被洗脱出来，洗脱时间与分子量的对数呈线性关系。再按照同样的方法将实施例1中制备的薏米发酵提取物进行hplc分析，得到相应峰的洗脱时间，将洗脱时间代入标准曲线，即可得到实施例1制备的薏米发酵提取物的分子量大小。色谱条件：色谱柱：tskgel2000swxl300mm×7.8mm；检测波长：uv280nm；流速：1ml/min；柱温：30℃。3、试验结果标准物质的分子量与洗脱时间的如表4所示，根据分子量的对数和洗脱时间做图得到标准曲线：y＝-2.4738x+17.656，r2＝0.9998。其中y为洗脱时间(min)；x为分子量对数。表4、标准物质的分子量与洗脱时间实验组1制备的薏米发酵提取物的hplc图谱如图3所示：薏米发酵提取物的图谱中主要包括1个组分峰，洗脱时间为11.61min，将洗脱时间代入标准曲线：y＝一2.4738x+17.656，计算出峰的分子量为277.2da，并且根据峰面积计算薏米发酵提取物占96.83％。一般认为分子量500da左右活性肽成分更易被皮肤吸收，所以薏米发酵物中存在容易被吸收的活性多肽。三、薏米发酵提取物的保湿性能检测将实施例1制备的薏米发酵提取物作为面膜或精华液或爽肤水等化妆品直接对皮肤进行涂抹，并通过皮肤含水量测试试验对其保湿性能进行检测，具体步骤如下：1、试验对象随机选取24名健康的志愿受试者，所有受试者均无任何皮肤和系统性疾患史。且受试部位(前臂内侧)的皮肤无异常，也不涂抹任何外用药物和化妆品等其他外用制剂。2、试验方法将测试物(实施例1的实验组、实验组2和实验组3获得的薏米发酵提取物)对受试者的前臂内侧的皮肤进行涂抹(涂抹的量为0.08-0.1ml)，并以蒸馏水为对照。在涂抹后的0h、0.5h、1h后使用仪器为corneometercm-825测量受试部位的皮肤含水量，测量结果通过设定的湿度测量值(moisturemeasurementvalue，mmv)来表示，mmv为0～150的数值。整个研究是在室内温度为22℃～24℃，湿度为50％～60％的良好皮肤非创伤性检查实验室内进行。3、试验结果测量结果如图4所示：图4中的为实施例1制备的薏米发酵提取物。从图中可以看出，和对照相比，受试者在涂抹实施例1获得的薏米发酵提取物后，皮肤含水量均明显提高，且在涂抹1小时后仍有很高的保湿功能。说明本发明的薏米发酵提取物具有很好的保湿功能，可以直接作为面膜或精华液或爽肤水等化妆品用于提高皮肤的含水量。当前第1页12