一种酪氨酸衍生装载苦杏仁苷水凝胶的制备方法和应用与流程

本发明涉及一种酪氨酸衍生装载苦杏仁苷水凝胶的制备方法和应用，属于超分子水凝胶
技术领域：
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背景技术：
：苦杏仁苷又被称为维生素b17是一种氰化物，其化学分子式为c20h27no11，分子量为457.42。苦杏仁苷广泛存在于很多植物中，特别是蔷薇科植物的种子中，例如杏仁、桃仁、樱桃、李子等。苦杏仁苷可以水解和生成红木素和扁桃腈，在葡萄糖苷酶的作用下，最终分解成苯甲醛和氢氰酸。很多研究表明苦杏仁苷具有止咳平喘、抗动脉粥样硬化、抑制肾间质纤维化、抑制肺纤维化、抗高压氧性肺损伤、免疫抑制、免疫调节、抗肿瘤、抗炎和抗溃疡的作用。苦杏仁苷被用于治疗哮喘、支气管炎、肺气肿、麻风病、大肠癌和白癜风等。因为苦杏仁苷可以分解为苯甲醛，而苯甲醛具有止痛作用，可以用来缓解疼痛。创伤性颅脑损伤(traumaticbraininjury，tbi)是主要的致死和致残的疾病之一，创伤性颅脑损伤可以导致50000人/年死亡。创伤性颅脑损伤威胁着人类的健康，并且给社会和家庭造成巨大的经济损失，上述问题也促使人们寻找更好的治疗方法。创伤性颅脑损伤主要由于原发性损伤和继发性损伤两发面导致的。原发性损伤是指受伤时造成的颅脑损伤，主要是由于机械外力打击而造成的损伤，这是无法进行人为干预。继发性损伤是指在原发性损伤之后大脑内部发生的一系列“瀑布式”病理生理级联反应，其中炎症反应是主要的病理变化之一。创伤性颅脑损伤主要由于原发性损伤和继发性损伤两发面导致的。原发性损伤是指受伤时造成的颅脑损伤，主要是由于机械外力打击而造成的损伤。继发性损伤是指在原发性损伤之后大脑内部发生的一系列“瀑布式”病理生理级联反应，其中炎症反应是主要的病理变化之一。因为原发性损伤是无法人为干预，因此临床上主要通过干预继发性损伤的病理过程，来发挥神经保护作用。继发性颅脑损伤后各种因素不仅遵循自身发展，而且各种因素相互交织、相互作用、共同促进，最终形成复杂的损伤网络。大量研究发现颅脑损伤后可以导致炎症反应、钙离子超载、兴奋性神经毒性和氧化应激等病理变化。其中炎症反应是创伤性颅脑损伤后一个关键因素。已经证实创伤性颅脑损伤后可以导致炎症的过度激活及促炎因子的释放，例如白介素1-β(interleukin1β，il-1β)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,tnf-α)等。这些炎症因子的上调可以增加血脑屏障的通透性和持续的胶质细胞活化，这些结果又会使得炎症反应进一步放大。并且相关文献报道通过干预创伤性颅脑损伤后炎症反应可以促进神经功能的恢复和发挥脑保护作用，其中science和jama就明确表明通过干预创伤性颅脑损伤后炎症反应可以发挥脑保护作用。因此，通过干预创伤性颅脑损伤后的炎症反应是一个有效可行的方法和关键的治疗靶点。苦杏仁苷药物有很好的抗炎药理作用，但是由于传统中药剂型在人体有一定的药物半衰期，并且不能直接作用于创伤性颅脑损伤部位，难以起到相应的疗效，因此需要一种的新的方式来提高其治疗作用。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供了一种酪氨酸衍生装载苦杏仁苷水凝胶的制备方法和应用，生产的酪氨酸衍生装载苦杏仁苷水凝胶能够作用于创伤性颅脑损伤部位，具有显著的疗效。为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种酪氨酸衍生装载苦杏仁苷水凝胶的制备方法，包括以下步骤：步骤1，配置fmoc-tyr-oh储备溶液；用二甲基亚砜溶解fmoc-tyr-oh固体粉末，超声分散得到fmoc-tyr-oh储备溶液；步骤2，配置苦杏仁苷储备溶液；用超纯水溶解苦杏仁苷溶液，配成苦杏仁苷储备溶液；步骤3，配制水凝胶；将所述fmoc-tyr-oh储备溶液和苦杏仁苷储备溶液混合摇匀，静置即得到酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶。作为上述制备方法的改进，步骤1中用二甲基亚砜溶解fmoc-tyr-oh固体粉末，超声分散的时间为0.5～1分钟，所得到fmoc-tyr-oh储备溶液的浓度为50～100mg/ml。作为上述制备方法的改进，步骤2中，所述苦杏仁苷储备溶液的浓度为1～16mg/ml。作为上述制备方法的改进，步骤3中，取30～50μl的fmoc-tyr-oh储备溶液加入洗净干燥的5.0ml的螺口瓶中，快速加入950～970μl苦杏仁苷储备溶液，迅速摇匀，然后静置，所述酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶即形成。作为上述制备方法的改进，在不添加还原剂与稳定剂的条件下，所述酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶为由fmoc-tyr-oh凝胶因子通过非共价键自组装得到的澄清透明的水凝胶。一种上述制备方法生产的酪氨酸衍生装载苦杏仁苷水凝胶在治疗创伤性颅脑损伤疾病的药物中的应用。一种上述制备方法生产的酪氨酸衍生装载苦杏仁苷水凝胶在减轻或治疗创伤性颅脑损伤疾病炎症性疾病药物中的应用。通过上述技术方案，本发明技术方案的有益效果是：1)本发明制备的酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶，生物相容性好，易降解。2)本发明制备的超分子水凝胶是澄清透明的水凝胶，具有适合的硬度、弹性和粘性，易于注射。3)本发明制备过程中没有添加任何还原剂与分散剂，通过静置可以形成超分子水凝胶，绿色环保。4)本发明制备方法简单，成本低廉，可商品化，可以适用于应用。5)本发明制备的超分子水凝胶具有良好的抗炎作用，能抑制创伤性颅脑损伤后炎症反应。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为酪氨酸衍生物超分子水凝胶的扫描电子显微镜(sem)图；图2为苦杏仁苷溶液的扫描电子显微镜(sem)图；图3为本发明实施例1制备的酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶的扫描电子显微镜(sem)图。图4为本发明实施例1制备的酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶的数码照片图。图5为本发明实施例2中酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶的傅里叶红外谱图。图6为本发明实施例3中的酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶流变图。图7为本发明实施例4中酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶和酪氨酸水凝胶对创伤性颅脑损伤中大鼠的神经功能评分的影响。图8为本发明实施例4中酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶和酪氨酸水凝胶对创伤性颅脑损伤中白介素1β(il-1β)的影响。图9为本发明实施例4中酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶和酪氨酸水凝胶对创伤性颅脑损伤中肿瘤坏死因子α(tnf-α)炎症因子水平的影响。图10为本发明实施例4中酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶和酪氨酸水凝胶对创伤性颅脑损伤中白介素10(il-10)炎症因子水平的影响。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1称取5.0mg/ml的fmoc-tyr-oh固体粉末，溶于100μl二甲基亚砜，超声分散30秒，使得其完全溶解，制备浓度为50mg/ml的fmoc-tyr-oh储备溶液；称取5.0mg的苦杏仁苷于离心管中，加入1.0ml的超纯水将其溶解，制备浓度为5mg/ml的苦杏仁苷储备液。取50μl的fmoc-tyr-oh储备溶液加入洗净干燥的5.0ml螺口瓶中，加入970μl苦杏仁苷储备溶液，迅速振荡摇匀，并静置3分钟即形成澄清透明的酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷的水凝胶。扫描电镜的实验步骤：用水虎鱼溶液(浓硫酸(v)∶双氧水(v)＝7∶3)超声清洗硅片15分钟，然后用乙醇溶液超声清洗15分钟，最后用超纯水清洗15分钟，然后将硅片从水虎鱼溶液中取出，用二次水冲洗硅片，随后用氮气将硅片吹干。用移液枪取10μl苦杏仁苷水凝胶置于硅片上，放入-4℃冰箱冷冻，后将冷冻的样品放入真空冷冻干燥器，将其中水分抽除。进行sem测试前将制备好样品放入干燥器保存。进行sem测试时，将硅片放入样品台，然后对样品进行喷金处理，放入仪器中，在真空环境下观测。图1为酪氨酸衍生物超分子水凝胶扫描电子显微镜图，图2为苦杏仁苷溶液扫描电子显微镜图，图3为酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷超分子水凝胶电镜扫描结果。如图所示，酪氨酸衍生物可以形成网状结构，如图1所示,酪氨酸衍生物可以装载苦杏仁苷，如图3所示。图4为本发明实施例1制备的酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶的数码照片图实施例2称取5.0mg/ml的fmoc-tyr-oh固体粉末，溶于100μl二甲基亚砜，超声分散30秒，使得其完全溶解，制备浓度为100mg/ml的fmoc-tyr-oh储备溶液；称取16.0mg的苦杏仁苷于离心管中，加入1.0ml的超纯水将其溶解，制备浓度为16mg/ml的苦杏仁苷储备液。取30μl的fmoc-tyr-oh储备溶液加入洗净干燥的5.0ml螺口瓶中，加入950μl苦杏仁苷储备溶液，迅速震荡摇匀，并静置3分钟即形成澄清透明的酪氨酸装载苦杏仁苷的水凝胶。傅里叶红外测试实验步骤：将样品在冷冻干燥机中干燥12个小时后，称取0.2g溴化钾粉末然后加入2mg样品，放入研钵内研磨，将二者充分混匀，然后将混合物放入模具中压成片状，进行红外测试。图5为酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷和苦杏仁苷粉末的傅里叶红外谱图。测试结果如图5所示，从图中可以得到：在红外光谱中蛋白质和多肽的特征性吸收带被定义为氨基酸a，b和ⅰ-ⅶ。酰胺ⅰ(1600-1690cm-1)和酰胺ⅱ(1480-1575cm-1)的吸收带常常被用来分析蛋白质的二级结构。在酰胺ⅰ，β-折叠、α-螺旋和随机卷曲的吸收峰分别接近1630cm-1、1655cm-1、1645cm-1。fmoc-tyr-oh-amygdalin其在1643cm-1处有一个酰胺ⅰ吸收峰，苦杏仁苷(amygdalin)在1642cm-1处有一个吸收峰。酰胺ⅱ是由于c-n伸缩震荡和n-h弯曲衍生而来的。两者都在1481cm-1处有吸收峰。这些结果表明苦杏仁苷药物加入fmoc-tyr-oh水凝胶中并没有导致苦杏仁苷结构的改变。实施例3称取5.0mg/ml的fmoc-tyr-oh固体粉末，溶于100μl二甲基亚砜，超声分散60秒，使得其完全溶解，制备浓度为75mg/ml的fmoc-tyr-oh储备溶液；称取1.0mg的苦杏仁苷于离心管中，加入1.0ml的超纯水将其溶解，制备浓度为1mg/ml的苦杏仁苷储备液。取40μl的fmoc-tyr-oh储备溶液加入洗净干燥的5.0ml螺口瓶中，加入960μl苦杏仁苷储备溶液，迅速震荡摇匀，并静置3分钟即形成澄清透明的酪氨酸装载苦杏仁苷水凝胶。流变测试实验步骤：采用ar2000流变仪器来测试其流变学行为，使用直径为50mm的平行板，间隙设置为0.2mm，测试条件：温度为25℃，强度为2％，频率为0.1—100hz。测试结果如图6所示，同时测定了fmoc-tyr-oh超分子水凝胶和fmoc-tyr-oh-amygdalin超分子水凝胶的储能模量(g’)耗损模量(g”)，其中储能模量(g’)表示材料因为弹性形变而储存的能量，耗损模量(g”)表示由于材料的粘性形变而耗损的能量，耗损角正切值(tanθ)是耗损模量(g”)和储能模量(g’)的比值，被用来表示材料的粘弹性比例。在一般的凝胶体系中g’＞g”，即tanθ＜1。如图6所示，在扫描的频率范围内，g’的值远大于g”,并且fmoc-tyr-oh超分子水凝胶中加入苦杏仁苷后其g’相对单纯fmoc-tyr-oh超分子水凝胶增加。根据上述结果，苦杏仁苷装载于fmoc-tyr-oh超分子水凝胶中不会影响其性质。实施例4取上述实施例1中的fmoc-tyr-oh储备溶液30μl，加入洗净干燥的5.0ml螺口瓶中，快速加入970μl与实施例1配制方法相同的8mg/ml苦杏仁苷储备溶液，迅速摇匀，静置即形成澄清透明的酪氨酸装载苦杏仁苷水凝胶。实验动物：本实验选取清洁级雄性的sprague-dawley(sd)大鼠，所有实验动物均购买于中南大学实验动物部，许可证号：scxk(湘)2016-0002，体重：200—250g。实验动物通过了中南大学动物伦理委员会批准，并且实验过程遵循《关于善待实验动物的指导性意见》(2006版)。所有动物分笼饲养在中南大学动物实验部spf级动物房：室温维持在(22-25)℃，环境湿度维持在(50±10)％，每天12小时循环光照。创伤性颅脑损伤模型制备:采用usatbi0310headimpactor复制颅脑损伤模型，具体方法如下：用5％水合氯醛4ml/kg腹腔注射，麻醉sd大鼠后，将sd大鼠头部固定在颅脑损伤仪器上，备皮，严格遵循无菌操作，碘伏常规消毒三遍后，用无菌剪从正中剪开皮肤，暴露颅骨，在右侧前囟与后囟之间用牙科钻在中心位置开一个直径为5mm的骨窗，将开完骨窗大鼠固定于颅脑损伤仪器上，将实验参数设定为：深度为5mm，速度为6mac/s，停留时间为2s，打击完毕后，缝合皮肤并消毒，将动物放入恒温电热毯上保暖待苏醒,苏醒后分笼饲养。实验动物分组：将雄性sd大鼠随机分成4组，假手术组(sham)、颅脑损伤组(tbi+pbs)、颅脑损伤+酪氨酸衍生物水凝胶组(tbi+fmoc-tyr-oh)、颅脑损伤+酪氨酸装载苦杏仁苷水凝胶组(tbi+8mg/mlfmoc-tyr-oh-amygdalin)，具体方案如下：假手术组(sham)：手术后24h，腹腔注射5％水合氯醛4ml/kg麻醉后，在开骨窗处注入20μlpbs(以4μl/min速度)，缝合皮肤，并消毒，将动物放入恒温电热毯保暖，待苏醒。颅脑损伤组(tbi+pbs)：手术后24h，腹腔注射5％水合氯醛4ml/kg麻醉后，在开骨窗处注入20μlpbs(以4μl/min速度)，缝合皮肤，并消毒，将动物放入恒温电热毯保暖，待苏醒。颅脑损伤+酪氨酸衍生物水凝胶组(tbi+fmoc-tyr-oh)：手术后24h，腹腔注射5％水合氯醛4ml/kg麻醉后，在开骨窗处注入20μl酪氨酸衍生物水凝胶(以4μl/min速度)，缝合皮肤，并消毒，将动物放入恒温电热毯保暖，待苏醒。颅脑损伤+8mg/ml酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶组(fmoc-tyr-oh-amygdalin)：手术后24h，腹腔注射5％水合氯醛4ml/kg麻醉后，在开骨窗处注入20μl8mg/ml苦杏仁苷水凝胶(以4μl/min速度)，缝合皮肤，并消毒，将动物放入恒温电热毯保暖，待苏醒。神经功能评分：项目分数最高分18动力测试提住尾巴大鼠逐渐升高31前肢屈曲1后肢屈曲1头上抬距垂直轴＞10°，且维持在30s内将大鼠置于地面(正常＝0；最大值＝3)30正常爬行1无法直线爬行2沿患侧转圈3患侧跌倒感觉测试21位置感知测试(视觉和触觉测试)2本体感觉测试(深部感觉，相对桌缘推爪子以刺激肢体肌肉)梁平衡测试(正常＝0；最大值＝6)60静态姿势下可平衡1抓握梁边2抱住梁，有一肢体掉落3抱住梁，有两肢体掉落或在梁上旋转(＞60s)4试图在梁上保持平衡，但跌落(＞40s)5试图在梁上保持平衡，但跌落(＞20s)6跌落，但没有试图保持平衡或抓握梁(＜20s)反射缺失或异常动作41耳廓反射(当触耳道时摇头)1角膜反射(用棉花丝轻触角膜时眨眼)1惊吓反射(噪音引起的运动反应)1抓握、肌阵挛、肌张力障碍注：分数越高代表损伤程度越高，而1分代表没有能力进行测试或被测试反射缺失。蛋白印迹法测定大鼠损伤侧皮质il-1β、tnf-α、il-10的表达(1)样品制备：用水合氯醛以4ml/kg腹腔注射麻醉后，迅速暴露心脏，用灌注针从左心室尖向主动脉方向插入，用止血钳固定针头，用冰生理盐水灌注，剪破右心耳，直至右心耳流出无色澄清液体为止。然后断头取脑，分别取患侧皮质，封装于冻存管中。剪取组织，用冰pbs冲洗组织，加入200ulripa裂解液于匀浆器中反复研磨组织直至看不见组织块。在冰上，让蛋白裂解10分钟，裂解完毕后，在4℃下离心机以12000rpm/min离心15分钟，洗去上清液备用。(2)蛋白浓度检测：以50:1的bca试剂a和bca试剂b配制适量的bca工作液，充分混匀。完全溶解蛋白标准品，浓度为2mg/ml，将标准品按0μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl分别加入到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20μl。加制备样品到96孔板，加用于稀释标准品的溶液到20μl。④每个孔中加入200μlbca工作液，在37℃中放置30min。在562nm处测点吸光度，并根据标准曲线计算蛋白质浓度。(3)电泳：配制10％的分离胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶。灌胶后，用异丙醇封胶。使胶充分凝固后将胶上异丙醇倒去，用滤纸吸干水分。配制4.8％的浓缩胶，加入temed后将浓缩胶立即摇匀，加入配置好的浓缩胶。根据蛋白定量结果调整各组上样量使样品中蛋白含量一致，加入5*loadingbuffer混匀，沸水煮5min使蛋白变性，放入冰盒中速冷。根据蛋白定量的结果，第一孔点入maker，其它每孔加入各组样品，开始电泳。电泳浓缩胶电压为80v，分离胶电泳电压为120v。待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。(4)转膜：分别切胶il-1β、tnf-α、il-10。准备6张与所切胶同样大小的滤纸和1张硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜和滤纸一起放入转膜缓冲液中，至完全浸透。按照滤纸、膜、胶、滤纸的顺序依次放好，将中间气泡排尽。盖上仪器，接通电源，转膜电压为300ma，时间为45min～1h。转膜完毕后，将膜取出放入1*tbst中洗1次，时间5min。用丽春红染膜，检测蛋白转膜的效率。用1*tbst将丽春红洗净。(5)封闭：用1*tbst配制5％脱脂奶粉，将膜浸入后，室温放置1.5h。(6)一抗孵育：用1*tbst将一抗按照一定比例稀释(表3-2)，将膜与一抗一起孵育，4℃过夜。孵育结束，1*tbst洗3次，每次15min。表3-2蛋白印迹中各抗体使用(7)二抗孵育：用1*tbst稀释hrp标记的二抗(proteintech)，兔抗(r)稀释比例1：6000，鼠抗(m)稀释比例1：5000，将稀释后的二抗与膜共同孵育90min。孵育结束，1*tbst洗3次，每次15min。(8)显色曝光：使用ecl化学发光液(thermo)与膜孵育3min，用吸水纸吸尽液体，用保鲜膜将膜包裹杂交膜，在暗盒内与x胶片曝光数分钟；显影冲洗。实验结果分别见图7、图8、图9和图10。图7为酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷超分子水凝胶和酪氨酸超分子水凝胶对创伤性颅脑损伤后大鼠神经功能评分的影响。从图7可以看出：与假手术组相比，模型组神经功能评分显著增加(p＜0.01)；与模型组比较，酪氨酸衍生物超分子水凝胶神经功能评分无明显差异(p＞0.05)，酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷超分子水凝胶组神经功能评分降低(p＜0.05)；酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶组与酪氨酸衍生物组比较，神经功能评分明显下降(p＜0.05)，说明其神经功能的改善是酪氨酸衍生物水凝胶通过释放苦杏仁苷药物而发挥作用。图8为酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷和酪氨酸衍生物超分子水凝胶对il-1β的影响，从图6可以看出：与假手术组比较，模型组il-1β水平显著升高(p＜0.01)；与模型组比较，酪氨酸衍生物水凝胶组il-1β表达水平变化不明显(p＞0.05)，酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶组il-1β表达水平显著下降(p＜0.01)，酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶组与酪氨酸衍生物水凝胶组比较，il-1β表达水平明显下降(p＜0.05)，说明其主要通过释放苦杏仁苷抑制il-1β表达。图9为酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷和酪氨酸衍生物超分子水凝胶对tnf-α的影响，从图9可以看出：与假手术组比较，模型组tnf-α水平显著升高(p＜0.01)；与模型组比较，酪氨酸衍生物水凝胶组tnf-α表达水平变化不明显(p＞0.05)，酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶组tnf-α表达水平显著下降(p＜0.01)，酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶组与酪氨酸衍生物水凝胶组比较，il-1β表达水平明显下降(p＜0.05)，说明其主要通过释放苦杏仁苷抑制tnf-α表达。图10为酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷和酪氨酸衍生物超分子水凝胶对il-10的影响，从图7可以看出：与假手术组比较，模型组il-10水平显著下降(p＜0.01)；与模型组比较，酪氨酸衍生物水凝胶组il-10表达水平变化不明显(p＞0.05)，酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶组il-10表达水平显著升高(p＜0.01)，酪氨酸衍生物装载苦杏仁苷水凝胶组与酪氨酸衍生物水凝胶组比较，il-10表达水平明显升高(p＜0.05)，说明其主要通过释放苦杏仁苷促进il-10表达。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页12