一种3D打印PCL-PMMA-万古霉素抗感染骨支架及制备方法和应用与流程

本发明涉及一种3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架及制备方法和应用，属生物工程化人体内植入物，可以用于治疗多种致病菌，如：金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、β-溶血性链球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌等导致的急、慢性骨髓炎、化脓性关节炎骨破坏的治疗及感染后骨缺损的治疗。

背景技术：

感染被定义为宿主组织与微生物局部浓度之间的平衡被打破，一般认为体内微生物超过10⁵个每克组织或有金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、β-溶血性链球菌等致病菌的存在即被认为存在感染。在众多感染性疾病中，骨、关节的感染不仅是骨科常见多发病，而且受限于局部血液供应差、对细菌抵抗力低、抗生素渗透性差等缺陷，往往难以愈合，很多急性、亚急性感染最终迁延为慢性感染。以往该骨科常用的抗感染策略通常是一期手术清创，静脉予以抗生素，局部应用含抗生素的间隔块或者骨水泥串珠。一般而言，这种方法取得较好的效果。随后可二期手术去除局部填充物，行翻修手术。但是，随着耐药菌株的出现，即使局部及静脉联合应用抗生素，也有可能发生抗感染的失败。

在骨、关节感染的治疗中，由于局部微循环差，生长因子少、活性低，细胞膜受体结构变化导致生长因子与受体之间失偶联，细菌还可能黏附在内植物部位形成生物膜导致内植物表面存在生物材料整合入周围组织与细菌黏附到材料表面的竞争等。同时，感染性病变对骨的侵蚀、破坏往往带来局部的死骨形成及骨缺损，甚至伴有皮肤、软组织的窦道形成，清创手术失败率、感染复发率高，往往导致患者严重的活动受限。因此，目前如何实现理想的局部抗菌，在清创祛除死骨与感染性病灶后能够有效的促进骨长入，同时无需二次手术一直是骨科临床与科研关注的重点。

目前的临床经典的治疗策略是将聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,pmma)与抗生素混合，做成pmma-抗生素珠链填充于感染性骨缺损区域用于感染的治疗，但该方法获取的pmma-抗生素珠链，其外形、内部结构及理化特性无法准确控制，不能很好的匹配待植入区的复杂解剖外形及生物力学环境，而且难以构建多孔隙的结构，导致植入物难以获得理想的组织整合，因此急需新的方法进行替代。

近年来有多种新的工程化生物材料可以被用来通过3d打印构建多孔结构材料，聚乳酸(polylacticacid，pla)、聚羟基乙酸(polyglycolicacid，pga)、pga-pla共聚物等人工材料。但这些材料的生物活性低、弹性模量、拉伸强度、三维精加工方式上存在一定不足，不能满足植入后承担人体负载的生物学性能。同时，目前尚没有理想的调控手段，难以针对不同感染阶段(急性期、亚急性期、慢性感染)的用药特点实现有效合理的抗生素与这些材料的复合以释放抗感染药物。

而羟基磷灰石(hydroapatite,ha)-抗生素支架，磷酸钙水泥(alciumphosphatecement,cpc)-壳聚糖-抗生素复合支架，聚乳酸(polylacticacid，pla)、聚羟基乙酸(polyglycolicacid，pga)、pga-pla共聚物等人工类ecm材料-抗生素复合支架的脆性高、加工性能低，难以进行特定三维形态的加工与塑性，往往依赖于材料本身的三维构型。同时，这些材料的价格昂贵，加工方法复杂，难以在临床应用中面向广大患者进行推广应用。

综上所述，开发出一种结构简单可靠，弹性和支撑力合适，手术植入方便，对人体创伤小，低成本、可诱导骨长入且可以实现抗生素控制释放的抗感染骨修补材料，对急、慢性骨髓炎、化脓性关节炎骨破坏的治疗及感染后骨缺损的修复治疗、对我国的卫生事业发展、对建设创新性国家都有重要的现实意义。

技术实现要素：

为了克服现有抗骨感染材料的上述问题，本发明的目的是提供一种结构简单可靠，外形与微结构可控，力学性能可靠，药物释放性能可控，植入方便，创伤小，有我国自主知识产权的抗感染骨修补材料－“3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架”，用于急、慢性骨髓炎、化脓性关节炎骨破坏的治疗及感染后骨缺损的修复治疗。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架，该支架通过如下方法制备得到：

1)将mma单体溶液加入pmma粉体聚合材料中，真空搅拌均匀，得到pmma的混合体；

2)将万古霉素加入到pmma的混合体中，继续真空搅拌至pmma-万古霉素混合物的半流期；

3)将3d打印pcl支架加入前端可调的密封容器中，并加入半流期的pmma-万古霉素混合物，加压，促进混合物填充进入3d打印pcl支架的孔隙内；

4)在pmma的面团期将3d打印支架取出，去除支架表面多余骨水泥，获得3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架。

本发明技术方案中：所述的pmma粉体聚合材料由聚甲基丙烯酸甲酯、硫酸钡和过氧化苯甲酰组成，且聚甲基丙烯酸甲酯、硫酸钡和过氧化苯甲酰的重量份数依次为50～80：10～40：1～5；所述的mma单体溶液由甲基丙烯酸甲酯、n,n-二甲基对甲苯胺和对苯二酚组成，其中：甲基丙烯酸甲酯、n,n-二甲基对甲苯胺的质量比为95～99.9：0.1～5，且对苯二酚的添加量为甲基丙烯酸甲酯和n,n-二甲基对甲苯胺总质量的50～100ppm。。

本发明技术方案中：pmma粉体聚合材料与mma单体溶液的质量比为20：5～15。

本发明技术方案中：：步骤2)中万古霉素与pmma的混合体质量比为1：10～30。

一种3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架的制备方法，该方法包括如下步骤：

1)将mma单体溶液加入pmma粉体聚合材料中，真空搅拌均匀，得到pmma的混合体；

2)将万古霉素加入到pmma的混合体中，继续真空搅拌至pmma-万古霉素混合物的半流期；

3)将3d打印pcl支架加入前端可调的密封容器中，并加入半流期的pmma-万古霉素混合物，加压，促进混合物填充进入3d打印pcl支架的孔隙内；

4)在pmma的面团期将3d打印支架取出，去除支架表面多余骨水泥，获得3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架。

本发明所述的制备方法中：所述的pmma粉体聚合材料由聚甲基丙烯酸甲酯、硫酸钡和过氧化苯甲酰组成，且聚甲基丙烯酸甲酯、硫酸钡和过氧化苯甲酰的重量份数依次为50～80：10～40：1～5；所述的mma单体溶液由甲基丙烯酸甲酯、n,n-二甲基对甲苯胺和对苯二酚组成，其中：甲基丙烯酸甲酯、n,n-二甲基对甲苯胺的质量比为95～99.9：0.1～5，且对苯二酚的添加量为甲基丙烯酸甲酯和n,n-二甲基对甲苯胺总质量的50～100ppm。。

本发明所述的制备方法中：pmma粉体聚合材料与mma单体溶液的质量比为20：5～15。

本发明所述的制备方法中：步骤2)中万古霉素与pmma的混合体质量比为1：10～30。

本发明所述的pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架在制备骨缺损修复材料领域中的应用。

本发明技术方案中：将pcl通过熔融挤压成型式3d打印的加热系统升温至液态，挤压出成型纤维束，通过纤维束的不同层次与角度的拼接架构获得3d打印pcl支架。

本发明是以fdm3d打印的纤维通过不同层次与角度的逐层累积与拼接架构而成的多孔隙结构，孔隙是各层纤维在0-180°的范围内相交并累积而形成，每个纤维之间的距离也可以影响孔隙的大小，这样就最终可以形成包括0-90°正交行结构、0-45-90-135-180°菱形结构、0-60-120-180°三角形结构在内的规律性孔隙，亦可以依据实际需要形成特殊的梯度化、层次化相交结构。

万古霉素释放的可控性：本发明的3d打印微结构(包括支架的孔大小、孔形状、孔取向、孔隙率和连通性、及支架表面特性等)均可以调控支架的力学性能、细胞粘附性能、以及万古霉素的释放特性。同时，通过改变制作过程中万古霉素与pmma混合的浓度，可调控支架内万古霉素的负载量，进而调控万古霉素的药物含量及释放特性，最终可以针对不同病情(急性期、亚急性期、慢性感染)选择合理用药的强度。

良好的力学性能：本发明的pcl、pmma材料均具有一定的弹性模量与强度，通过对3d打印形成的孔隙微结构的调控(比如：孔形貌、孔隙大小、孔隙率)，不仅影响pcl支架的力学性能，也可以控制pmma填充后的力学性能，从而可以调控3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架的力学特性，以满足骨缺损部位的力学要求。

良好的组织整合特性：3d打印支架的基材pcl在植入后会不断降解，周围新生的骨组织将逐步生长并填充孔隙，就能够形成在宿主部位良好的骨整合性能，最终可以控制感染并填充骨组织缺损。

良好的生物安全性：本发明采用的pcl、pmma及万古霉素均为高生物相容性与生物安全性材料，均已被国家食药监局批准用于作为可临床使用的内植入物、药物材料；三者复合后无生物有害物质的生成，使得3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架具备良好的生物安全性。

3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨支架的特点是：①通过fdm3d打印技术构建，可以实现外形、内部孔隙结构的精细控制；②通过对材料中孔隙微结构(包括支架的孔大小、孔形状、孔取向、孔隙率和连通性、及支架表面特性等)的精细控制以及对于pmma中混合万古霉素的比例的调控，可以实现对万古霉素释放的调控；③通过对pmma中混合万古霉素的比例、3d打印支架孔隙结构的控制，可使得支架具有良好的力学性能；④支架随着pcl的降解，可形成多孔微结构，具备良好的组织整合特性；⑤采用的pcl、pmma及万古霉素均为高生物相容性与生物安全性材料，由此得到的3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架具备良好的生物安全性。

本发明的有益效果是设计一种新型的3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架，在克服了现有抗骨感染材料缺点的同时还充分发挥了3d打印技术、支架材料本身的性能，使得本发明具有结构简单可靠，外形与微结构可控，力学性能可靠，离子释放性能可控，植入方便，创伤小、成本低的优点，可以用于急、慢性骨髓炎、化脓性关节炎骨破坏的治疗及感染后骨缺损的修复治疗。

附图说明：

图1为本发明的3d打印pcl支架的纤维层叠排列、建立三维多孔结构的示意图。a：支架纤维层叠排列二维视图，b：纤维0-90°层叠排列的正方形孔隙支架的结构示意图，

c：纤维0-60-120-180°层叠排列的三角形孔隙支架的结构示意图，d：纤维

0-45-90-135-180°层叠排列的菱形孔隙支架的结构示意图。

图2为本发明植入骨感染性缺损区后发挥抗感染、骨组织长入生物学作用的示意图。

图3为本发明采用不同孔隙微结构进行3d打印制备的通用型支架的实物图。a：纤维成0-60-120-180°层叠排列的3d打印pcl支架，b：纤维成0-45-90-135-180°层叠排列的3d打印pcl支架，c：纤维成0-90°层叠排列的3d打印pcl支架；d：纤维成0-90°的c支架与pmma-万古霉素复合后的3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨架。

图4为本发明采用cad设计与3d打印制备的个性化支架的示例图。a：通过ct扫描获取的感染性骨缺损区域三维影像，b：个性化支架cad设计图，c：个性化支架实物图。

图5为本发明的理化特性检测实验的结果图。a：支架抑菌性能检测图，b：扫描电镜纤维视图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1～3的制备方法

一种3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架，该支架通过如下方法制备得到：

1)将mma单体溶液加入pmma粉体聚合材料中，真空搅拌均匀，得到pmma的混合体；

2)将万古霉素加入到pmma的混合体中，继续真空搅拌至pmma-万古霉素混合物的半流期；

3)将3d打印pcl支架加入前端可调的密封容器中，并加入半流期的pmma-万古霉素混合物，加压，促进混合物填充进入3d打印pcl支架的孔隙内；

4)在pmma的面团期将3d打印支架取出，去除支架表面多余骨水泥，获得3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架。

实施例1～3制备过程的参数

对于感染性骨缺损患者，如果缺损区没有金属异物等可能影响ct扫描图像的干扰因素，可以通过ct扫描获得解剖数据，并结合感染、骨缺损的病情严重程度，设计具备个性化外形与理化特性的3d打印支架并植入感染性骨缺损区域。对于无法获取精确解剖数据的患者，使用预先准备好的3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架，依据实际缺损情况决定植入支架的数量。支架植入后，随着万古霉素的释放对感染进行控制，与此同时，随着pcl的降解，周围新生骨组织则不断长入pcl降解后的孔隙，最终实现控制感染、填充骨缺损区域的目标。

如图1所示，支架的3d打印pcl多孔结构由不同层次排列的pcl纤维束叠加形成，图1a为支架纤维依不同层次叠加排列的二维示意图，可以看到支架的孔隙形态由支架纤维的不同层叠方法确定，包括孔大小、孔形状、孔取向、孔隙率和连通性等。图2b、c、d分为提供了采用0-90°、0-60-120-180°、0-45-90-135-180°层叠排列形成具有正方形、三角形、菱形孔隙的3d打印pcl支架的结构示意图。在实际工作中，亦可以依据不同待修复区力学环境、感染程度等的实际要求，通过对支架纤维层叠的调控，进而制备个性化设计、具备特定孔隙微结构的支架。

图2为的1-6是本发明植入骨感染性缺损区后发挥抗感染、骨组织长入生物学作用的示意图。1为支架植入骨缺损部位；2为支架植入时局部的放大图；3显示3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架植入后释放万古霉素，并对组织中对细菌进行杀灭；4-5为随着pcl的降解，骨组织逐步长入pcl的间隙，直到8显示支架与骨组织形成良好整合，骨感染被治愈，同时骨缺损区域获得良好的填充与修复。

图3的a、b、c分别是按照前述技术路线，制备的不同结构通用型3d打印pcl支架的实物图，其中a为纤维成0-60-120-180°层叠排列的具备三角形孔隙微结构的支架，b为纤维成0-45-90-135-180°层叠排列的具备菱形孔隙微结构的支架，c为纤维成0-90°层叠排列的具备正方形微结构的支架；d为纤维成0-90°的c支架与pmma-万古霉素复合后，得到的3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架的实物图。

图4a、b、c分别是按照前述技术路线进行个性化支架制备的示例图，其中a为通过ct扫描获取的感染性骨缺损区域三维影像，b为计算机辅助设计的个性化支架的三维cad图像，c为采用成0-90°纤维层叠排列的个性化3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架。

图5a、b分别是按照前述技术路线构建的3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架的理化特性检测实验的结果图，其中a为将0-90°纤维层叠排列的3d打印pcl-pmma-万古霉素抗感染骨支架植入含有金葡菌的培养皿内进行抑菌实验，可以看到在培养2周后，支架周围有环形抑菌圈，可见本发明制备的3d打印支架具有可靠的抑菌效能，b为扫描电镜检测图，可以看到支架多孔结构内被pmma-万古霉素混合物填充，万古霉素在pmma内分布均匀。