一种靶向EGFR的多肽类PET显像剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种靶向egfr的多肽类pet显像剂及其制备方法和应用。

背景技术：

恶性肿瘤是全球最大的公共卫生问题之一，对人类健康的危害极大。《2017中国癌症报告》公布了我国2013年癌症的发病和死亡数据，报告显示中国是癌症大国，癌症病人人数占全球癌症病人总人数的40％左右，我国每天约有1万人确诊癌症，平均每分钟就有7人确诊，所有癌症病例中肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、食管癌这六种最为常见，约占全部癌症病例的65％。

传统的癌症治疗方法主要包括手术治疗、化学治疗、放射治疗等。对于非实体瘤、全身广泛转移的癌症等无法进行有效的手术治疗及放疗，而化疗的副作用大、特异性差、疗效低，难以满足临床治疗的需求。随着人们对恶性肿瘤发病机理的研究不断深入，针对特定致癌基因、蛋白或受体的分子靶向治疗取得了不错的效果，相较普通化疗，靶向治疗的特异性强、疗效显著，同时副作用明显减小，已逐渐成为临床肿瘤治疗的一项重要手段。

表皮生长因子受体(egfr)因其分布广泛、生理作用重要而备受关注(cataldovd,gibbonsdl,pérez-solerr,etal.treatmentofnonsmall-celllungcancerwitherlotiniborgefitinib[j].nengljmed,2011,364(10):947-955.)，成为最早实现分子靶向治疗的靶点。egfr蛋白质结构由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区为配体结合区，跨膜区是单独一个α螺旋，胞内区包括一个酪氨酸激酶(tk)区和几个酪氨酸磷酸化位点的羧基末端。egfr在诱导细胞增殖、侵袭、转移和抑制凋亡等复杂的信号通路中具有重要作用。egfr在多种肿瘤细胞中都表现出过度表达或异常突变，如头颈部鳞癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌等(yewalec.,baradiad.,vhorai.,etal.epidermalgrowthfactorreceptortargetingincancer:areviewoftrendsandstrategies[j].biomaterials,2013,34(34):8690-8707.)。egfr过度表达的肿瘤细胞接收细胞生长信号，激活细胞内的某些基因表达，加速细胞分化，释放血管生成因子和转移因子，最终导致肿瘤的发生发展。

由于egfr酪氨酸激酶家族在癌症的形成中扮演重要角色，egfr已经成为癌症靶向治疗的重要靶标，为开发抗肿瘤药物提供了新的思路。根据egfr蛋白的结构特点，靶向egfr的抗肿瘤药物主要有两类：一类是单克隆抗体(egfr-mcab)，竞争结合细胞外配体结合区域；另一类是小分子酪氨酸激酶抑制剂(egfr-tkis)，在胞内与atp竞争性结合egfr磷酸化位点。近年来，各国批准了靶向egfr的多种单克隆抗体及小分子酪氨酸激酶抑制剂作为靶向药物，同时还有多种类似药物处于临床前或基础研发阶段。

pet是目前唯一可以在体显示生物分子的代谢、受体及神经介质活动的显像技术，已广泛用于多种疾病的诊断与鉴别诊断、疗效评价、脏器功能研究和新药开发等方面。靶向egfr的pet/ct显像可无创性进行此类药物的敏感个体筛选，明确肿瘤病灶分布，能进行实体瘤的早期诊断、肿瘤分期、术前定位、术后对比及疗效监测，可用于制定个性化治疗方案，指导手术或靶向治疗。以靶向egfr的药物为基础的pet显像剂得到了大量开发与研究。

ge11是一种利用噬菌体展示随机多肽库技术筛选到的egfr的多肽配体(zonghaili,ruijiaozhao,xianghuawu.etal.identificationandcharacterizationofanovelpeptideligandofepidermalgrowthfactorreceptorfortargeteddeliveryoftherapeutics[j].fasebj.,2005；19(14):1978-85.)，其序列为yhwygytpqnvi，与egfr具有较高亲和力(22nm)，被大量用于抗癌药物(如阿霉素、紫杉醇等)的靶向给药(igenta,echiesa,bcolzani,etal.ge11peptideasanactivetargetingagentinantitumortherapy:aminireview[j].pharmaceutics.2017；10(1))。如果利用¹⁸f-nfp为放射化学标记中间体，以赖氨酸为桥梁对ge11进行标记，有望获得一种特异性靶向egfr的多肽类pet显像剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种靶向egfr的多肽类pet显像剂及其制备方法和应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种靶向egfr的多肽类pet显像剂，其结构式为：

上述靶向egfr的多肽类pet显像剂的制备方法包括以下步骤：

1)应用回旋加速器轰击¹⁸o水生产¹⁸f，再将¹⁸f传导于阴离子交换柱中，再用淋洗液将¹⁸f淋洗到反应瓶中并进行共沸除水，再加入2-溴丙酸乙酯和溶剂，充分反应，得到2-¹⁸f-丙酸乙酯；

2)对2-¹⁸f-丙酸乙酯进行碱性水解，除去反应溶剂后再将水解产物、碳酸双(4-硝基苯基)酯和溶剂混合，充分反应，再进行半制备hplc分离纯化，得到¹⁸f-nfp；

3)将¹⁸f-nfp、lys-ge11多肽、n,n-二异丙基乙胺和溶剂混合，充分反应，加水稀释后通过sep-parc-18柱，用水冲洗c-18柱，再用乙醇淋洗c-18柱，收集淋洗液，得到靶向egfr的多肽类pet显像剂(¹⁸f-fp-lys-ge11)。

步骤1)所述淋洗液由4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷、k2co3或khco3、水和乙腈组成。

步骤1)所述反应在95～105℃下进行，反应时间为5～15min。

步骤2)所述碱性水解在95～105℃下进行，反应时间为5～15min。

步骤2)所述反应在95～105℃下进行，反应时间为5～15min。

步骤3)所述lys-ge11多肽的结构式为：

步骤3)所述反应在30～40℃下进行，反应时间为15～25min。

本发明的有益效果是：本发明利用¹⁸f-nfp作为放射化学标记中间体进行¹⁸f标记，得到高纯度的pet显像剂¹⁸f-fp-lys-ge11，其稳定性好、水溶性强，体内血液清除快，主要经肾脏代谢，在表皮生长因子(egfr)阳性表达的pc-3荷瘤鼠中摄取明显，肿瘤病灶部位显像对比度高，肿瘤分辨能力强，在进行肿瘤pet显像方面具有很好的临床应用开发前景。

附图说明

图1为实施例1的¹⁸f-fp-lys-ge11的放射性hplc图谱。

图2为实施例1的¹⁸f-fp-lys-ge11的体外稳定性实验结果。

图3为实施例1的¹⁸f-fp-lys-ge11在balb/c小鼠体内的生物分布图。

图4为实施例1的¹⁸f-fp-lys-ge11在pc-3荷瘤鼠模型中的pet/ct显像图。

具体实施方式

一种靶向egfr的多肽类pet显像剂，其结构式为：

上述靶向egfr的多肽类pet显像剂的制备方法包括以下步骤：

1)应用回旋加速器轰击¹⁸o水生产¹⁸f，再将¹⁸f传导于阴离子交换柱中，再用淋洗液将¹⁸f淋洗到反应瓶中并进行共沸除水，再加入2-溴丙酸乙酯和溶剂，充分反应，得到2-¹⁸f-丙酸乙酯；

2)对2-¹⁸f-丙酸乙酯进行碱性水解，除去反应溶剂后再将水解产物、碳酸双(4-硝基苯基)酯和溶剂混合，充分反应，再进行半制备hplc分离纯化，得到¹⁸f-nfp；

3)将¹⁸f-nfp、lys-ge11多肽、n,n-二异丙基乙胺和溶剂混合，充分反应，加水稀释后通过sep-parc-18柱，用水冲洗c-18柱，再用乙醇淋洗c-18柱，收集淋洗液，得到靶向egfr的多肽类pet显像剂(¹⁸f-fp-lys-ge11)。

优选的，步骤1)所述淋洗液由4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷、k2co3或khco3、水和乙腈组成。

优选的，步骤1)所述反应在95～105℃下进行，反应时间为5～15min。

优选的，步骤1)所述溶剂为乙腈。

优选的，步骤2)所述碱性水解的具体操作为：将氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液加入到2-¹⁸f-丙酸乙酯反应液中进行水解反应。

优选的，步骤2)所述碱性水解在95～105℃下进行，反应时间为5～15min。

优选的，步骤2)所述溶剂为乙腈。

优选的，步骤2)所述反应在95～105℃下进行，反应时间为5～15min。

优选的，步骤2)所述半制备hplc分离的条件为：c-18柱，流动相：a相：0.1％三氟乙酸的水溶液，b相：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，时间梯度为0～5min，40％b相；5～30min，40％～90％b相；30～40min，90％～40％b相。

优选的，步骤3)所述lys-ge11多肽的结构式为：

优选的，步骤3)所述溶剂为二甲基亚砜、n,n-二甲基乙酰胺中的一种。

优选的，步骤3)所述反应在30～40℃下进行，反应时间为15～25min。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释和说明。

实施例1：

一种靶向egfr的多肽类pet显像剂的制备方法包括以下步骤：

1)应用医用回旋加速器轰击¹⁸o水，通过¹⁸o(pn)¹⁸f核反应生产¹⁸f，再将¹⁸f传导于阴离子交换柱中，测定活度并用1ml淋洗液(由12mg的4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷+3mg的k2co3+0.15ml水+1.35ml乙腈组成)将¹⁸f淋洗到反应瓶中，再向反应瓶中不断吹入高纯氦气并加热至110℃进行共沸除水，吹干，再加入5mg的2-溴丙酸乙酯和1ml乙腈，100℃反应10min，得到2-¹⁸f-丙酸乙酯；

2)在2-¹⁸f-丙酸乙酯中加入0.5ml浓度0.1mol/l的氢氧化钾溶液，100℃水解10min，反应结束后蒸干溶剂，再将水解产物和1.5ml溶解有40mg碳酸双(4-硝基苯基)酯(npc)的无水乙腈溶液混合，100℃反应10min，再加入1ml质量分数5％的醋酸溶液终止反应，再进行半制备hplc分离纯化(分离条件：c-18柱，流动相：a相：0.1％三氟乙酸的水溶液，b相：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，时间梯度为0～5min，40％b相；5～30min，40％～90％b相；30～40min，90％～40％b相)，得到¹⁸f-nfp；

3)将¹⁸f-nfp和150μl无水dmso溶液(其中包含50μg的lys-ge11多肽和30μl的dipea)混合，40℃反应15min，再加10ml水稀释后通过sep-parc-18柱，用10ml水冲洗c-18柱，再用2ml乙醇淋洗c-18柱，收集淋洗液，得到靶向egfr的多肽类pet显像剂(¹⁸f-fp-lys-ge11)。¹⁸f-fp-lys-ge11的放射性hplc图谱如图1所示。

经测算，合成效率为2.0％，放射化学纯度为99％。

¹⁸f-fp-lys-ge11的合成路线如下：

实施例2：

一种靶向egfr的多肽类pet显像剂的制备方法包括以下步骤：

1)应用医用回旋加速器轰击¹⁸o水，通过¹⁸o(pn)¹⁸f核反应生产¹⁸f，再将¹⁸f传导于阴离子交换柱中，测定活度并用1ml淋洗液(由12mg的4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷+3mg的k2co3+0.15ml水+1.35ml乙腈组成)将¹⁸f淋洗到反应瓶中，再向反应瓶中不断吹入高纯氦气并加热至110℃进行共沸除水，吹干，再加入7mg的2-溴丙酸乙酯和1ml乙腈，100℃反应15min，得到2-¹⁸f-丙酸乙酯；

2)在2-¹⁸f-丙酸乙酯中加入0.5ml浓度0.1mol/l的氢氧化钾溶液，100℃水解15min，反应结束后蒸干溶剂，再将水解产物和1.5ml溶解有40mg碳酸双(4-硝基苯基)酯(npc)的无水乙腈溶液混合，100℃反应15min，再加入1ml质量分数5％的醋酸溶液终止反应，再进行半制备hplc分离纯化(分离条件：c-18柱，流动相：a相：0.1％三氟乙酸的水溶液，b相：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，时间梯度为0～5min，40％b相；5～30min，40％～90％b相；30～40min，90％～40％b相)，得到¹⁸f-nfp；

3)将¹⁸f-nfp和200μl无水dmso溶液(其中包含50μg的lys-ge11多肽和30μl的dipea)混合，40℃反应15min，再加10ml水稀释后通过sep-parc-18柱，用10ml水冲洗c-18柱，再用2ml乙醇淋洗c-18柱，收集淋洗液，得到靶向egfr的多肽类pet显像剂(¹⁸f-fp-lys-ge11)。

经测算，合成效率为3.0％，放射化学纯度为99％。

实施例3：

一种靶向egfr的多肽类pet显像剂的制备方法包括以下步骤：

1)应用医用回旋加速器轰击¹⁸o水，通过¹⁸o(pn)¹⁸f核反应生产¹⁸f，再将¹⁸f传导于阴离子交换柱中，测定活度并用1ml淋洗液(由12mg的4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷+3mg的k2co3+0.15ml水+1.35ml乙腈组成)将¹⁸f淋洗到反应瓶中，再向反应瓶中不断吹入高纯氦气并加热至110℃进行共沸除水，吹干，再加入7mg的2-溴丙酸乙酯和1ml乙腈，105℃反应10min，得到2-¹⁸f-丙酸乙酯；

2)在2-¹⁸f-丙酸乙酯中加入0.5ml浓度0.1mol/l的氢氧化钾溶液，105℃水解10min，反应结束后蒸干溶剂，再将水解产物和1.5ml溶解有40mg碳酸双(4-硝基苯基)酯(npc)的无水乙腈溶液混合，105℃反应10min，再加入1ml质量分数5％的醋酸溶液终止反应，再进行半制备hplc分离纯化(分离条件：c-18柱，流动相：a相：0.1％三氟乙酸的水溶液，b相：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，时间梯度为0～5min，40％b相；5～30min，40％～90％b相；30～40min，90％～40％b相)，得到¹⁸f-nfp；

3)将¹⁸f-nfp和200μl无水dmso溶液(其中包含50μg的lys-ge11多肽和30μl的dipea)混合，40℃反应20min，再加10ml水稀释后通过sep-parc-18柱，用10ml水冲洗c-18柱，再用2ml乙醇淋洗c-18柱，收集淋洗液，得到靶向egfr的多肽类pet显像剂(¹⁸f-fp-lys-ge11)。

经测算，合成效率为2.2％，放射化学纯度为99％。

测试例：

1)¹⁸f-fp-lys-ge11的体外稳定性测试：

为了检测显像剂在体外的稳定性，分别考查了实施例1制备得到的¹⁸f-fp-lys-ge11在pbs(ph＝7.4)和小鼠血清中的稳定性。

取2ml的pbs(ph＝7.4)缓冲液与50μci显像剂¹⁸f-fp-lys-ge11充分混合，在孵箱中37℃孵育2h，取少量溶液，通过hplc检测显像剂稳定性，以上实验重复4次。

babl/c小鼠摘眼取血1.5ml离心取上层血清，加入100μci显像剂¹⁸f-fp-lys-ge11充分混合，在孵箱中37℃孵育2h，用高速离心机在转速12000转/分下离心5min，取上清液进行hplc分析显像剂的体外稳定性，以上实验重复4次。

实施例1的¹⁸f-fp-lys-ge11的体外稳定性测试结果如图2所示。

由图2可知：¹⁸f-fp-lys-ge11在pbs中100％以原型稳定存在；¹⁸f-fp-lys-ge11在babl/c小鼠血清中2h后有约80％以原型存在，另外在7min处有一分解峰存在。

2)¹⁸f-fp-lys-ge11的脂水分配系数测定：

脂水分配系数(logp)是化合物的一项基本物理化学性质，尤其是药物化学中非常重要的研究参数，是一个影响药物在体内的吸收、分布、代谢和消除的重要因素。取10μl配制好的¹⁸f-fp-lys-ge11注射液于装有1ml正辛醇与990μl水的2.5ml离心管中，密闭置于干式恒温器中常温震荡10min，静置10min使两相分层，用移液器从两相中分别各取500μl置于γ计数管中，用γ计数器测定计数。平行进行两批次实验，每批重复3次。

根据以下公式计算logp值：

测定得到实施例1的¹⁸f-fp-lys-ge11的脂水分配系数logp为-2.088±0.049，说明¹⁸f-fp-lys-ge11为水溶性物质，具有较好的亲水特性，预测体内摄取与显像中主要经肾脏代谢，其他软组织摄取可能较低，显像背景摄取比较低。¹⁸f-fp-lys-ge11具有较好亲水性，体内清除快，适合用于pet显像研究应用。

3)¹⁸f-fp-lys-ge11的体内分布测试：

取4只正常balb/c小鼠分别经尾静脉注射30μci实施例1的¹⁸f-fp-lys-ge11，正常饲养摄取2h，处死小鼠，取血及脑、心、肺、肝脏、肾脏等主要脏器与组织称重并进行γ计数，研究¹⁸f-fp-lys-ge11在小鼠体内的生物分布情况。

实施例1的¹⁸f-fp-lys-ge11在balb/c小鼠体内的生物分布如图3所示。

由图3可知：¹⁸f-fp-lys-ge11主要经肾脏代谢，肝脏也有部分代谢最后经肠道排泄，血液清除速度快，骨中放射性不高，¹⁸f-fp-lys-ge11在体内不脱氟。表明¹⁸f-fp-lys-ge11经肾脏代谢，体内清除快，肌肉、骨骼、心脏、肺、肝脏等背景脏器和组织背景摄取底，适合用作pet显像。

4)荷瘤鼠¹⁸f-fp-lys-ge11的micropet显像测试：

取egfr阳性表达人前列腺癌pc-3细胞以5×10⁶/只的密度进行裸鼠皮下接种，待肿瘤直径生长至5～10mm时，进行显像剂¹⁸f-fp-lys-ge11的micropet显像研究。

实施例1的¹⁸f-fp-lys-ge11在pc-3荷瘤鼠模型中的pet/ct显像图如图4所示。

由图4可知：¹⁸f-fp-lys-ge11聚集在肿瘤部位，肿瘤部位的摄取量明显高于肌肉、骨骼、肺、脑等器脏或组织。表明¹⁸f-fp-lys-ge11靶向特异性摄取于肿瘤部位，肿瘤摄取对比度好，能清晰分辨病灶部位，¹⁸f-fp-lys-ge11具有较好的egfr阳性肿瘤特异性显像应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。