异甘草素在抑菌、干预生物被膜及治疗奶牛乳房炎中的用途的制作方法

本发明涉及异甘草素在抗菌中的新药理用途，尤其涉及异甘草素在抑制木糖葡萄球、干预木糖葡萄球生物被膜以及治疗奶牛乳房炎中的新的药理用途，属于异甘草素药理活性新用途领域。

背景技术：

木糖葡萄球菌(staphylococcusxylose,s.xylose)是一种血浆凝固酶阴性葡萄球菌(coagulasenegativestaphylococcus,cns)，其广泛存在于动物和人的皮肤中，并且通常被认为是非致病性细菌(akhaddar,a.,etal.,staphylococcusxylosusisolatedfromanotogenicbrainabscessinanadolescent.surgicalinfections,2010.11(6):p.559-561.)。但近年来有研究表明木糖葡萄球菌可引起动物隐性乳房炎和人类的某些细菌性感染(急性肾盂肾炎，根管感染，尿路感染)以及抗生素耐药(persson,y.,etal.,intramammaryinfectionsandsomaticcellcountsinmeatandpeltproducingeweswithclinicallyhealthyudders.smallruminantresearch,2017.156:p.66-72；tselenis-kotsowilis,a.d.,m.p.koliomichalis,andj.t.papavassiliou,acutepyelonephritiscausedbystaphylococcusxylosus.journalofclinicalmicrobiology,1982.16(3):p.593-4；ugur,a.ando.ceylan,occurrenceofresistancetoantibiotics,metals,andplasmidsinclinicalstrainsofstaphylococcusspp.archivesofmedicalresearch,2003.34(2):p.130-136.)。此外，木糖葡萄球菌具有很强的形成生物被膜的能力，这可能导致宿主免疫系统的持续感染和对抗生素抗性(parsek,m.r.andp.k.singh,bacterialbiofilms:anemerginglinktodiseasepathogenesis.annualreviewofmicrobiology,2003.57:p.677-701.planchon,s.,etal.,comparativesubproteomeanalysesofplanktonicandsessilestaphylococcusxylosusc2a:newinsightincellphysiologyofacoagulase-negativestaphylococcusinbiofilm.journalofproteomeresearch,2009.8(4):p.1797-1809.)。生物被膜是细菌、真菌等在生长过程中为适应生存环境而形成的一种与浮游细胞相对应的生存方式，主要以黏附在非生物或生物表面的、包裹着胞外基质的三维结构的微生物群落方式存在。细菌形成生物被膜会造成机体的慢性感染，天然的物理屏障作用会导致细菌耐药性的加剧。近年来，cns感染的乳房炎不断增加，而木糖葡萄球菌不仅可以引起奶牛乳房炎，并且其有着极强的形成生物被膜能力(干霞芳，李蒙英.生物被膜和生物被膜形成菌的研究[j].安徽大学学报(自然科学版).2007(06):58；garciaab,percivalsl.zoonoticinfections:theroleofbiofilms[j].biofilmsandveterinarymedicine,2011,6:69-110；blackledgems,worthingtonrj,melanderc.biologicallyinspiredstrategiesforcombatingbacterialbiofilms[j].currentopinioninpharmacology,2013,13:699-706.)。因此，开发抑制木糖葡萄球菌生物被膜形成的新型抗菌药物具有重要的应用价值。

咪唑甘油磷酸酯脱水酶(imidazoleglycerolphosphatedehydratase，igpd)是微生物体内组氨酸生物合成的关键酶之一，因其仅存在于细菌和植物中，所以有着天然药物靶点研发的优势(马金梅,迟良,邹明,等.奶牛隐性乳房炎诊断技术研究进展[j].中国动物检疫,2016,(11):71-74.)。l-组氨酸的合成与木糖葡萄球菌的生物被膜形成有关，igpd是l-组氨酸合成通路中第一个具有专一合成l-组氨酸的酶。

计算机辅助药物设计已成为当今研发新药一个有效的手段，被越来越多的学者所重视，可以利用这一技术对已知药物和蛋白靶点进行筛选，从而高效的得到治疗药物。

目前，关于异甘草素的研究主要集中于其抗氧化、抗肿瘤等方面，尚未见其具有抑菌和干预生物被膜作用的报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供异甘草素在抑菌、干预生物被膜及治疗奶牛乳房炎中的新的药理用途

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案包括：

本发明以igpd为研究对象，使用计算机辅助药物设计(computer-aideddrugdesign，cadd)技术，通过计算机分子模拟的手段来预测异甘草素与igpd之间的作用，并辅以体外与体内验证试验，最终确定了异甘草素可能通过作用于靶标蛋白igpd从而对木糖葡萄球菌生物被膜产生干预作用，对于木糖葡萄球菌所导致的奶牛乳房炎也具有确切的治疗效果。

本发明整体技术方案的详述

本发明首先进行了异甘草素对木糖葡萄球菌atcc700404生物被膜形成的影响的试验：本试验使用计算机辅助药物设计技术，通过计算机分子模拟对接的手段准确的预测了异甘草素与igpd之间的作用关系，可知异甘草素与igpd的两个mn²⁺形成两个作用力强的金属键，又与ile70、met96、asn142、glu162分别形成pi-alkyl、pi-sigma、conventionalhydrogenbond、pi-anion，作用力极强，由此推测异甘草素作用于igpd并抑制igpd与其底物的结合。体外模型试验表明，在异甘草素为1/2mic时，木糖葡萄球菌igpd的酶活性与未加药组相比显著降低，由此推测异甘草素占据igpd酶的活性中心，使igpd无法与其底物结合，从而导致igpd酶活性降低。由于igpd是l-组氨酸合成通路中第一个具有专一合成l-组氨酸的酶(alifano,p.,etal.,histidinebiosyntheticpathwayandgenes:structure,regulation,andevolution.microbiologicalreviews,1996.60(1):p.44-69.)，而异甘草素抑制igpd与其底物结合会导致组氨酸合成途径受阻，从而影响木糖葡萄球菌生物被膜的形成。

本发明进一步采用亚mic的异甘草素对木糖葡萄球菌生物被膜进行干预，应用结晶紫染色方法，试验结果显示，异甘草素在亚mic时对木糖葡萄球菌生物被膜有明显的干预作用，生物被膜总量随着药物浓度的增加不断减少。通过扫描电子显微镜观察木糖葡萄球菌生物被膜的超微结构可以发现，在异甘草素为1/2mic时，对木糖葡萄球菌的生物被膜有很显著的干预效果。另外组氨酸合成是细菌重要的氮代谢途径的产物，且组氨酸的生成会间接影响细菌生物被膜的形成(dietl,a.-m.,etal.,histidinebiosynthesisplaysacrucialroleinmetalhomeostasisandvirulenceofaspergillusfumigatus.virulence,2016.7(4):p.465-476.kulis-horn,r.k.,m.persicke,andj.kalinowski,histidinebiosynthesis,itsregulationandbiotechnologicalapplicationincorynebacteriumglutamicum.microbialbiotechnology,2014.7(1):p.5-25.)。在异甘草素为1/2mic时，木糖葡萄球菌24h的组氨酸含量比未加药组显著降低，且igpd基因显著下调，说明igpd基因被抑制表达，异甘草素影响了组氨酸合成通路。

tnf-α是重要的促炎细胞因子，可以促进炎症细胞的聚集、活化和炎症介质的释放，还可以直接刺激发热中枢引起发热，加重炎症症状，是最重要的白细胞聚集因子(winter,p.andi.g.colditz,immunologicalresponsesofthelactatingovineudderfollowingexperimentalchallengewithstaphylococcusepidermidis.veterinaryimmunology&immunopathology,2002.89(1-2):p.57.)。il-6作为一种多效性因子，是参与免疫调节和炎性反应的重要细胞因子之一，是宿主对感染和组织损伤所引起反应的主要介质(luppip,licataa,haluszczakc,etal.analysisoftcrvbetarepertoireandcytokinegeneexpressioninpatientswithidiopathicdilatedcardio-myopathy[j].jautoimmun,2001,16(1):3-13.)。发生局部炎症时，在趋化因子作用下，单核细胞/巨噬细胞迅速到达炎症部位，参与吞噬病原体和分泌各种炎症反应的介质和细胞因子，其中和炎症反应关系最密切的是tnf-α和il-6(周光炎,免疫学原理-第2版.2007:上海科学技术出版社.)。因此，本发明使用elisa试剂盒测定乳腺组织匀浆中tnf-α和il-6的浓度表示炎症的严重程度。乳腺组织匀浆中tnf-α和il-6结果通过统计分析显示，攻毒组和阴性对照组间以及治疗组间差异显著，且病理切片观察发现阴性对照组无明显病理学变化，而攻毒组腺泡高度扩张，炎性细胞出现在在腺泡腔内和组织间，治疗组虽然腺泡扩张，但腺泡腔内只有少量分泌物，偶见凋亡腺上皮细胞与炎性细胞。试验结果表明小鼠乳房炎模型建立成功，且使用异甘草素治疗效果显著。

本发明通过试验发现，异甘草素抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成在两个方面有所体现：一是异甘草素作为潜在的竞争性抑制剂与igpd酶的活性中心结合，使igpd无法与其底物结合而抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成；另一方面是异甘草素可以抑制igpd基因的表达，从而导致组氨酸代谢途径被抑制来间接影响木糖葡萄球菌生物被膜的形成；本发明的体内试验表明异甘草素可用于治疗因木糖葡萄球菌生物被膜造成的相关感染。

由此，本发明公开了一种抑制致病菌的药物组合物，包括：预防或治疗上有效量异甘草素的和药学上可接受的辅料或载体。

进一步的，本发明公开了一种干预致病菌生物被膜的药物组合物，包括:预防或治疗上有效量的异甘草素和药学上可接受的辅料或载体。

更进一步的，本发明公开了一种治疗由致病菌引起的奶牛乳房炎的药物组合物，包括:预防或治疗上有效量的异甘草素和药学上可接受的辅料或载体。

所述的干预致病菌生物被膜包括抑制致菌生物被膜的形成或杀灭成熟的制致生物被膜内的菌。

本发明中所述的“致病菌”优选为血浆凝固酶阴性葡萄球菌，更优先为木糖葡萄球菌。

所述的载体或辅料是指药学领域常规的载体或辅料，例如：稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂、表面活性剂等；另外，还可以在组合物中加入其它辅助剂如香味剂和甜味剂。

所述稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分；常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等。其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。

所述崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2－6％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2－6％)、海藻酸(与总重量比为2－5％)、微晶纤维素(与总重量比为5－15％)中之一种或几种混合物。其中以交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2－7％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2－6％)为佳。最佳为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2－6％)。

所述的润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸钙，聚乙二醇，滑石粉，氢化植物油中之一种或几种混合物。其中以硬脂酸镁最为适宜。润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10－1％，一般用量为0.25－0.75％，最佳用量为0.5－0.7％。

所述的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分。可以是淀粉浆(10－30％，与粘合剂总重量比)，羟丙基甲基纤维素(2-5％，与粘合剂总重量比)，聚乙烯吡咯烷酮(2-20％，与粘合剂总重量比)，以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳，最佳为聚乙烯吡咯烷酮的50％乙醇水溶液。

所述助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。

所述表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分。常用为十二烷基硫酸钠(常用范围为0.2－6％，与总重量比)。

总之，本发明通过试验发现异甘草素通过作用于靶标蛋白igpd从而对木糖葡萄球菌生物被膜产生干预作用，对于木糖葡萄球菌所导致的奶牛乳房炎也具有确切的治疗效果；因此，异甘草素能够用于制备抑制木糖葡萄球菌或木糖葡萄球生物被膜药物或者用于制备治疗奶牛乳房炎的药物。

附图说明

图1异甘草素与igpd蛋白相互作用图。

图2亚抑菌浓度异甘草素对木糖葡萄球菌atcc700404生物被膜形成能力影响。

图3扫描电镜观察木糖葡萄球菌atcc700404生物被膜的结构。

图41/2mic异甘草素处理下组氨酸含量的测定。

图51/2mic异甘草素处理下igpd活性的测定。

图61/2mic异甘草素作用下igpd基因的表达变化。

图7tnf-α、il-6炎性因子的含量测定。

图8病理组织学结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验例1异甘草素抑制木糖葡萄球菌以及干预木糖葡萄球菌生物被膜的试验

1试验材料与试验方法

1.1菌株及试剂

木糖葡萄球菌atcc700404，购自美国模式培养物集存库；异甘草素购自sigma-aldrich上海贸易有限公司；甲醇购自天津市科密欧化学试剂有限公司；tsb购自青岛高科园海博生物技术有限公司；分娩8～10天清洁级昆明系母鼠购自哈尔滨医科大学附属第二医院试验动物中心；tnf-α、il-6检测试剂盒购自泉州市科诺迪生物科技有限公司；igpd蛋白的氨基酸序列(通过序列搜索网站uniprot获得木糖葡萄球菌的igpd蛋白的氨基酸序列)；scifinder、swissmodel(来自互联网官方网站)；酶标仪(美国epoch公司)；扫描电子显微镜s-3400n(日本日立公司)。

1.2同源模建及分子对接

通过swissmodel官方网站，得到igpd同源蛋白，构建igpd的三级结构。下载得到异甘草素配体分子。使用cdocker进行分子对接，在工具浏览器中，展开receptor-ligandsinterraction|dockligands，点击cdocker进行分子对接，maximunbadorientations设置为800，orientationvdwenergythreshold设置为300，其他参数默认。

1.3菌种复苏、传代

将木糖葡萄球atcc700404复苏后接种到tsb培养基中，放入37℃恒温培养箱中培养12h。以相同接种方法对木糖葡萄球菌进行传代纯化培养后，即可备用。

1.4药物的配制

准确称取异甘草素1.28g，溶于10ml甲醇，进行倍比稀释，共稀释12个梯度，药物最大浓度为128mg/ml，最小浓度为0.0625mg/ml，作为储备液。分别取1ml储备液过0.22μm有机相滤膜，再用甲醇稀释后供测量mic使用。

1.5菌液的配制

取试管置于麦氏比浊仪中，先加一定量的生理盐水，调比浊仪显示100，再加传代后的木糖葡萄球菌，调菌液的浓度显示到85。然后用培养液对菌做1000倍稀释备用(约1.0×10⁵cfu/ml)。

1.6异甘草素对木糖葡萄球菌最小抑菌浓度的测定(mic)

试验操作及结果按照美国临床和实验室标准协会(clsi)推荐的标准微量稀释法进行判定。试验重复三次。

1.7亚抑菌浓度异甘草素对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用

向96孔板中加入实验1.5配制的菌液和实验1.4各个浓度药物共200μl(药物终浓度分别为1/2mic，1/4mic，1/8mic，1/16mic)。于37℃恒温培养箱中培养24h。固定，结晶紫染色，用酶标仪在595nm处，测定吸光度。试验重复三次。

1.8扫描电镜观察木糖葡萄球菌生物被膜的形成

取试验1.5配制的菌液2ml加到6孔组织培养板内。将盖玻片加入到6孔组织培养板内，然后向6孔组织培养板内加入终浓度为1/2mic异甘草素溶液，另设立对照组，在37℃恒温培养箱中静止培养24h。盖玻片用无菌pbs冲洗3次，以去除浮游细菌，于4℃冰箱中用戊二醛固定1h，然后用磷酸缓冲液冲洗两次，每次10min，依次再用50％、70％和90％乙醇脱水一次，每次15min，然后用100％乙醇脱水二次，每次15min，最后100％乙醇与叔丁醇1:1；纯叔丁醇各一次后，每次15min，用冷冻干燥仪对样品进行干燥4h。在真空条件下在样品表面镀一层厚150a的金属膜，扫描电子显微镜下观察生物被膜形成情况。

1.9组氨酸含量的测定

将木糖葡萄球菌atcc700404接种于无菌tsb培养基中，加入终浓度为1/2mic的异甘草素。在恒温培养箱中37℃培养到24h后，未加药的木糖葡萄球菌和添加1/2mic异甘草素的菌液各1ml于1.5ml离心管中，12000r/min离心2分钟，弃掉上清，用1ml的pbs将菌沉淀洗2次，弃掉上清，再用无菌双蒸水将菌悬起，使用超声波细胞粉碎机将菌体破碎，使其释放组氨酸。待菌液至澄清状态，12000r/min离心2分钟，将上清转移至新的离心管，备用。参照李继珩^[10]方法，配制溶液，使用紫外分光光度计在476nm处测量od值。试验重复三次。

1.10酶(igpd)活性的测定

将木糖葡萄球菌atcc700404接种于无菌tsb培养基中，加入终浓度为1/2mic的异甘草素。在恒温培养箱中37℃培养到24h后，未加药的木糖葡萄球菌和添加1/2mic异甘草素的菌液各1ml于1.5ml离心管中，12000r/min离心2分钟，弃掉上清，用1ml的pbs将菌沉淀洗2次，弃掉上清，再用无菌双蒸水将菌悬起，使用超声波细胞粉碎机将菌体破碎。待菌液至澄清状态，12000r/min离心2分钟，将上清转移至新的离心管，备用。参照macpherson^[11]方法，配制溶液，使用紫外分光光度计在280nm处测量od值。试验重复三次。

1.111/2mic异甘草素对木糖葡萄球菌igpd合成基因(hisb)表达的影响

无菌条件下取菌液50μl，加入含有1/2mic异甘草素的5ml培养基中37℃下培养24h。总rna的提取参照rnapreppure培养细胞或细菌总rna提取试剂盒(tiangen)，实验详细步骤参见试剂盒使用说明书。cdna的合成参照takara公司的primescript^tmrtreagentkit说明书进行。反应条件：37℃作用15min,85℃作用5s。反应体系：5×rtbuffer10μl；randomprimer(50mm)1μl；primescriptrtenzymemixi4μl；random6mers(100mm)1μl；ddh2o3μl。以16srrna为内参来检测gina基因的表达量。运用primerexpress和prilner5.0软件设计引物(引物见表1)。反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃31s，40个循环。反应体系：sybr(染料)10μl；cdna1.2μl；上游引物0.6μl；下游引物0.6μl；ddh2o7.6μl。

表1荧光定量引物

1.12乳房炎模型建立

参考杨明锋(杨明锋,etal.,金黄色葡萄球菌感染小鼠乳房炎模型的建立.中国兽医学报,2011.31(1):p.107-109.)方法，取15只分娩8～10天清洁级昆明系母鼠，全价饲料饲养，自由饮水，适应性饲养3天后随机分为3组(n＝5)。a组为阴性对照组；b组为攻毒组，每只注射木糖葡萄球菌1.0×10⁸cfu/100μl；c组为治疗组，每只注射木糖葡萄球菌1.0×10⁸cfu/100μl，在攻毒24h后乳腺基部注射80μg/ml的异甘草素100μl治疗。各注射组都注射在第4对乳头，每侧50μl。

1.13取样与样品处理

在接菌48h或给药24h后脱颈处死小鼠，快速剪开腹部皮肤，观察乳腺组织的病理变化。分离第4对乳腺，一侧乳腺组织用4％甲醛固定24h，制作石蜡切片，苏木素-伊红染色(h.e)后光学显微镜进行病理组织学观察。另一侧称重后按每克加入灭菌生理盐水1ml后冰上研磨成匀浆，将匀浆液以12000r/min离心15min取上清液，-80℃冰箱保存。elisa检测组织匀浆上清中的肿瘤坏死因子(tnf-α)、白细胞介素6(il-6)含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.14数据分析

本试验采用spss20.0软件对数据进行统计学处理与分析，数据以(x±sd)表示，采用多重比较和单因素方差分析对各组数据进行分析和比较。(p<0.05为差异性显著，p<0.01为差异性极显著)。

2试验结果

2.1同源模建及分子对接结果

数据显示，与igpd同源性最高的蛋白编号是2ae8，特征相似性高达78.65％，而其他蛋白仅仅只有40％左右(≥30％即可进行同源模建)，选择蛋白2ae8作为同源模建的模板蛋白，获得蛋白结构。由图1分子对接的相互作用3d图可知，异甘草素与两个mn2+形成两个作用力强的金属键，与ile70、met96、asn142、glu162分别形成hydrophobic，hydrophobic，hydrogenbond，electrostatic，作用力强。说明异甘草素与igpd存在相互作用。

2.3异甘草素对木糖葡萄球菌mic的结果

通过试验结果可以看出，异甘草素对木糖葡萄球菌atcc700404的mic为80μg/ml。

2.4亚抑菌浓度下生物被膜形成能力的检测

通过结晶紫染色，在酶标仪595nm处，测定各个药物浓度的od值，结果见图2。od值随着药物浓度增大而减小，呈现负相关。经过spss软件分析，当药物浓度为1/2mic、1/4mic、1/8mic时od值与对照组之间存在显著性差异(p<0.05)，当药物浓度为1/16mic时od值与对照组之间差异不显著(p>0.05)。

2.5扫描电镜观察木糖葡萄球菌生物被膜的结构

1/2mic异甘草素(40μg/ml)干预木糖葡萄球菌atcc700404生物被膜后，通过扫描电子显微镜观察，结果如图3。图3(a)显示，未处理组木糖葡萄球菌atcc700404不仅黏附于盖玻片表面，而且其形态不同于游离菌，形成蘑菇状结构的细菌聚集体；图3(b)显示木糖葡萄球菌atcc700404经1/2mic(40μg/ml)异甘草素处理后，只有少量细菌黏附于盖玻片表面，成熟的细菌生物被膜的立体结构消失。

2.6组氨酸含量的测定结果

木糖葡萄球菌atcc700404添加1/2mic异甘草素后，通过od值测定，确定木糖葡萄球菌组氨酸含量(图4)。木糖葡萄球菌atcc700404添加1/2mic异甘草素后和对照组相比，组氨酸含量显著性降低(p<0.05)。

2.7酶igpd活性的测定结果

木糖葡萄球菌atcc700404添加1/2mic异甘草素后，通过od值测定，确定酶活性变化(图5)。木糖葡萄球菌atcc700404添加1/2mic异甘草素后和对照组相比，酶活性显著性降低(p<0.05)。

2.81/2mic异甘草素对木糖葡萄球菌hisb基因表达的影响

为了进一步研究异甘草素干预木糖葡萄球菌生物被膜形成过程中igpd合成基因hisb表达情况，通过realtimepcr方法测定了亚抑菌浓度的异甘草素作用后的木糖葡萄球菌hisb基因的表达。由图6可知亚抑菌浓度的异甘草素干预木糖葡萄球菌生物被膜形成后，hisb基因表达下调。

2.9乳腺组织中tnf-α与il-6的检测

tnf-α与il-6检测结果如图7显示，在攻毒48h后b组乳腺组织中tnf-α与il-6含量相较于a组均显著上升，而c组在使用异甘草素治疗后tnf-α与il-6含量相较于b组均显著下降。

2.10病理组织学观察

阴性对照组(图8a)无明显病理学变化，为活动期乳腺，腺泡上皮细胞排列整齐，无淋巴细胞；攻毒组(图8b)腺泡高度扩张，腺泡腔内可见分泌物，腺泡上皮脱落，腺泡壁不完整，腺泡细胞无核，腺泡内与间质中有大量炎性细胞浸润；治疗组(图8c)腺泡扩张，腺泡腔内有分泌物，偶见凋亡腺上皮细胞与炎性细胞。