一种用于防治流感的药物及其制剂和制备方法与流程

本发明属于医药技术领域，涉及防治流感的药物及其制备方法，涉及一种倍半萜化合物的医药新用途，具体而言，是指臭灵丹二醇在制备防治流感药物中的应用。

背景技术：

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病，具有高度传染性。人流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中甲型流感对人类威胁最大，h1n1是最主要的季节性甲型流感病毒。全球每年流感发病率在成人中约为5％-10％，在儿童中约为20％-30％，在高危人群如婴幼儿、老年人或慢性病患者中易造成住院和死亡。全世界每年流感造成约300万至500万例严重疾病和约25万至50万例死亡，严重威胁人类的生命健康，并造成巨大经济损失。预防及控制流感传播的最有效方法是接种疫苗，但是由于流感病毒的抗原变异能力强，疫苗的生产仅针对已流行流感亚型毒株，对于抗原漂移和变异产生新型流感病毒感染不产生机体的保护作用，且对高危人群如老人与免疫力低下儿童的保护作用低下。因此，流感疫苗预防流感具有一定的滞后性，保护率也有限。目前用于流感治疗的化学药物主要有两类：金刚烷胺类(金刚烷胺和金刚乙胺)和神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦和扎那米韦)，通常需在疾病早期(症状出现后48小时内)给药，且由于作用靶点单一已出现耐药，极大影响了疗效。因此，临床迫切需求具有不同靶点的新型抗流感药物。

在流感病毒感染过程中，宿主启动固有免疫反应产生抗病毒因子(如干扰素)和炎症反应以抑制入侵的病毒，适度的炎症反应有利于流感病毒的清除。但过度炎症反应会引起“炎症因子风暴”，导致机体严重的组织损伤，这是流感导致死亡的主要原因之一。因此，以抑制流感病毒诱发宿主产生过度炎症反应为靶标的药物研发已成为研究热点。该类药物调控宿主固有免疫反应相关的信号通路及炎症因子的分泌，不针对病原体，故不易产生耐药。

臭灵丹二醇(pterodondiol)是一种倍半萜化合物，其结构式为

存在于菊科草本植物臭灵丹中，资源丰富。已知该成分具有抗菌生物活性[药学学报,2007,42(5):511-515]。

技术实现要素：

本发明的任务是提供一种抗流感药物。

本发明的另一个任务是提供一种臭灵丹二醇的制备方法。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的抗流感药物是臭灵丹二醇(pterodondiol)，即臭灵丹二醇在制备用于预防或治疗流感引起炎症药物中的应用，

臭灵丹二醇(pterodondiol)是一种倍半萜化合物，存在于菊科草本植物臭灵丹中，资源丰富。已知该成分具有抗菌生物活性[药学学报,2007,42(5):511-515]。本发明揭示臭灵丹二醇(pterodondiol)具有下调流感病毒介导炎症应答的作用。

通过对大量天然产物的随机筛选，发明人首次发现，臭灵丹二醇可抑制流感病毒介导的炎症应答，能成为一种安全有效的新型抗流感药物，能够在制备用于预防或治疗流感引起炎症药物中的应用。

本发明提供的抗流感药物可制成药学上允许的任意剂型，包括消化道、呼吸道和注射给药剂型，包括但不限于胶囊剂、片剂、软胶囊、滴丸、颗粒剂、糖浆、口服液、吸入剂、喷雾剂、乳膏、霜剂、凝胶剂、注射剂等。根据临床用药所需，上述药物含有适当剂量的臭灵丹二醇，其在药剂中的份量为0.1％～99.9％(w/w)，亦可配伍其他药用许可的活性物质；制剂载体或辅料包括但不限于填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、助溶剂等。其中，填充剂具体可选择淀粉、糊精、糖粉、预胶化淀粉、乳糖、葡萄糖、微精纤维素、碳酸钙、硫酸钙、碳酸氢钙等一种或多种；黏合剂具体可选择羟丙甲纤维素、聚维酮、淀粉浆、糊精浆、胶浆、糖浆、聚乙二醇、海藻酸钠、阿拉伯胶、桃胶等一种或多种；崩解剂具体可选择交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羟丙基淀粉、羧甲淀粉钠、酒石酸、柠檬酸、碳酸氢钠、碳酸钠、酸酐等一种或多种；润滑剂可选滑石粉、硬脂酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇等一种或多种；助溶剂可选吐温、植物油等一种或多种。

采用qrt-pcr检测发现，不同剂量臭灵丹二醇(31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml)能够明显抑制h1n1病毒感染a549细胞诱导的炎症因子(tnf-α、ip-10、mcp-1)的异常表达，并呈剂量依赖关系。采用免疫印迹方法检测发现，不同剂量臭灵丹二醇(62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml)可抑制h1n1病毒诱导的与病毒复制相关的信号通路cox-2、nf-κb、erk1/erk2mapk的活化，并呈剂量依赖关系。实验结果均证实，臭灵丹二醇对流感病毒介导的炎症反应有明显的抑制活性。

本发明提供的臭灵丹二醇的制备方法，包括以下步骤：

取臭灵丹干燥药材用90％酒精渗漉提取得浸膏；浸膏加水搅拌使混悬，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂；将石油醚提取物加硅胶适量拌样，干法装柱(200～300目)，常压下用石油醚-醋酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，溶剂配比依次为1:0、20:1、10:1和5:1；分别接收，浓缩；石油醚-醋酸乙酯10:1洗脱段继续用硅胶柱层析分离，以石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱(20:1、10:1、5:1、2:1)，用tlc指导合并，10:1洗脱部分经醋酸乙酯重结晶纯化得到白色结晶即为臭灵丹二醇。

附图说明

图1采用westernblot技术检测臭灵丹二醇对流感病毒h1n1感染诱导的与病毒复制相关的信号通路活化的调节作用。

图2采用实时定量pcr(qrt‐pcr)技术检测臭灵丹二醇对流感病毒h1n1感染介导的炎症因子tnf-α、ip-10、mcp-1表达的影响。

具体实施方式

实施例1:臭灵丹二醇的制备

取臭灵丹干燥药材(采自昆明市近郊)1kg，通过90％酒精渗漉提取得浸膏135g；浸膏加800ml水搅拌使混悬，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取(各5×500ml)，回收溶剂；将石油醚提取物加硅胶适量拌样，干法装柱(200～300目，650g)，常压下用石油醚-醋酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，溶剂配比依次为1:0、20:1、10:1和5:1；分别接收，浓缩；石油醚-醋酸乙酯10:1洗脱段，重约2.5g，继续用硅胶柱层析分离，以石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱(20:1、10:1、5:1、2:1)，用tlc指导合并，10:1洗脱部分经醋酸乙酯重结晶纯化得到白色结晶(0.15g)，经nmr鉴定为臭灵丹二醇。

¹h-nmr(400mhz,cdcl3)ppm：0.92(3h,s,h-14),1.11(3h,s,h-15),1.27(3h,s,h-12),1.28(3h,s,h-13)。¹³c-nmr(100mhz,cdcl3)ppm：41.78(c-1、9),20.31(c-2),43.78(c-3),72.55(c-4),49.48(c-5),20.92(c-6),42.08(c-7),21.21(c-8),34.31(c-10),74.74(c-11),29.40(c-12),29.86(c-13),18.92(c-14),22.10(c-15).上述数据与文献值一致[云南植物研究,1993,15(3):303-305；中国药学杂志,1995,30(5):264-265].

实施例2：臭灵丹二醇抑制流感病毒介导的宿主信号通路的活化

1.材料、仪器

药物：臭灵丹二醇，自制。

细胞、病毒：人肺腺癌549细胞株(humanalveolarepithelialcell,a549)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库、甲型h1n1流感病毒(a/pr/8/34,h1n1)，以reed-muench法测定其感染复数(m.o.i)，以m.o.i＝0.1作为病毒滴度感染细胞。

试剂：dmem/f12(1:1)培养基(批号：8114176)、pbs(批号：20150122),胎牛血清(批号：10099)均购自gibco公司；trisbase购自ameresco公司；氯化钠(nacl)购自广州化学试剂厂；氯化钾(kcl)购自广州化学试剂厂；磷酸二氢钾(kh2po4)购自广州化学试剂厂；磷酸氢二钠(na2hpo4·12h2o)购自广州化学试剂厂；甘氨酸glycine购自广州化学试剂厂；十二烷基磺酸钠(sds)购自美国sigma公司；吐温tween-20购自广州化学试剂厂；bca蛋白浓度测定试剂盒购自美国thermo公司；ripa裂解液购自美国thermo公司；easyseewesternmarker(20-90kda)购自中国transgenbiotech公司；blueplusiiproteinmarker购自中国transgenbiotech公司；过硫酸胺(aps)购自美国ameresco公司；pvdf膜购自美国lifescience公司；cocktail(蛋白酶抑制剂)购自美国sigma公司；脱脂奶粉购自gibco公司；temed(n,n-亚甲基双丙烯酰胺)购自美国bio-rad公司；兔抗人p-p65抗体购自美国cst公司；兔抗人p65抗体购自美国cst公司；兔抗人p-perk抗体购自美国cst公司；兔抗人erk抗体购自美国cst公司；兔抗人cox-2抗体购自美国cst公司；兔抗人gapdh抗体购自美国cst公司；羊抗兔二抗购自美国earthox公司。

仪器：

heracell150i恒温co2培养箱，美国thermo公司

bhc-1300iia/b3二级生物安全柜，苏州净化设备有限公司

leicadm3000倒置显微镜，徕卡公司

tgl-16m高速台式冷冻离心机，德国eppendorf公司

avantij-26高速冷冻离心机，美国beckmancoulter公司

sigmaj-26冷冻离心机，德国sigma公司

垂直电泳仪、powerpac^tm通用型电源，bio-rad公司

bs115-eshk01水平摇床，太仓科教器材厂

xmark^tm酶标仪,bio-rad公司

2.药物毒性实验(mtt法)

按每孔约2.5×10⁴a549细胞接种到96孔板，24h后待细胞长成单层,弃去培养液,加入不同稀释度的药物100μl/孔，空白对照和正常细胞对照孔加入100μl/孔mem，37℃,5％co2继续培养36-48小时,每孔加mtt溶液(5mg/ml)20μl,置37℃,5％co2温箱中继续孵育4小时。吸弃培养上清液，每孔加100μl二甲基亚砜(dmso)低速振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。按照下列公式计算抑制率，并用reed-muench法计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(tc50)。抑制率＝[(正常组平均od值-空白组平均od值)-(给药组平均od值-空白组平均od值)]/(正常组平均od值-空白组平均od值)×100％。

3.western-blot实验方法

(1)用胰酶将t75瓶中的a549细胞进行消化，待细胞全部脱落后，加入适量含10％fbs(体积比)的dmem/df12(1:1)培养基进行终止胰酶的作用；

(2)将消化下来的细胞转移到15ml的离心管中，进行离心1000rpm×5min；

(3)加入适量含10％fbs(体积比)的dmem/df12(1:1)培养基将细胞重悬，调整细胞的密度将细胞铺于6孔板中，放置于培养箱中，培养12h细胞贴壁后待用；

(4)进行实验组的设置，包括：正常组；流感病毒组，低剂量药物组(流感病毒+臭灵丹二醇(62.5μg/ml)),中剂量药物组(流感病毒+臭灵丹二醇(125μg/ml))，高剂量药物组(流感病毒+臭灵丹二醇(250μg/ml)),单独药物组(流感病毒+臭灵丹二醇(125μg/ml))。将a549细胞取出，弃去原有的培养基，加入pbs洗涤两次，然后加入含流感病毒a/pr8/3/4(h1n1)(moi＝0.1)无血清的dmem/df12(1:1)培养基吸附细胞2h；

(5)用pbs将细胞洗涤除去未吸附的病毒，药物干预组加入不同浓度的臭灵丹二醇(62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml)。继续培养24小时后；将细胞6孔板置于冰上，弃去细胞培养上清，并用冷的pbs洗涤两次；洗涤完毕，迅速加入130μl细胞裂解液ripa(含有蛋白酶抑制剂cocktail,其与细胞裂解液ripa体积比(v/v)为1：100加入及终浓度为10μm的pmsf)，进行提取细胞总蛋白。

(6)将1.5mlep管进行标记并它们置于冰上，将细胞裂解物转移至标记好各组的ep管，并在摇床上摇30min，让蛋白充分裂解；

(7)将细胞裂解物移至4℃预冷的离心机，进行13000rpm×15min离心；

(8)离心毕，将裂解物的沉淀弃去，并将上清进行分装保存在-80℃；对细胞总提取物的蛋白浓度进行测定，按bca蛋白检测试剂盒说明书进行配置标准品，取96孔板，加入10μl/孔的标准品及样品(2复孔)，然后逐孔加入bca检测工作液200μl/孔(配置工作液a:b＝1:50)，混匀后37℃孵育30min，取出96孔板冷却至室温，于酶标仪于吸光度572nm测定od值。绘制标准曲线，将样品od值转换为浓度。

(9)sds聚丙烯酰胺凝胶的准备：根据配方先配置10％sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶：4mlddh2o+3.3ml30％acr(丙烯酰胺)+2.5ml1.5mtris·hcl(ph＝8.8)+0.1ml10％sds+0.1ml10％aps(过硫酸铵)+0.004mltemed，充分混匀后在分离玻璃板间灌注分离胶，灌注完毕在最上层加入ddh20封住分离胶液面，等待30min，分离胶凝结完好；根据配方先配置5％sds聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶：3.4mlddh2o+0.83ml30％acr(丙烯酰胺)+0.63ml1mtris.hcl(ph＝6.8)+0.05ml10％sds+0.05ml10％aps(过硫酸铵)+0.005mltemed，充分混匀后在分离玻璃板间灌注浓缩胶，灌注毕插入梳子，等待30min，浓缩胶凝结完好，可以使用。

(10)加样：用5xsds聚丙烯凝胶加样缓冲液(5xloadingbuffer)与样品(20μg)按体积比(v/v)(1:4)混合，95℃变性10min，立即转至冰上冷却5min防止蛋白复性。离心3000rpm×1min，逐孔加样；

(11)电泳：用bio-rad垂直电泳仪，90v恒压电泳约(1-1.5)h，待溴酚蓝指示剂到达分离胶底部时停止电泳；

(12)蛋白质转膜：pvdf膜先在甲醇浸泡15min。电泳结束后取下凝胶，切除多余的空白凝胶，修剪后按其大小裁剪6张whatman3m滤纸。按3张滤纸-凝胶-pvdf膜-3张滤纸的顺序叠放整齐后置于湿转负极板上，用干净玻璃棒排去凝胶与pvdf膜间的气泡，在冷库中，以380ma的恒电转膜2h。转膜结束后，取出膜并加入5％脱脂奶粉(5％milk/tbst)封闭pvdf膜并于室温摇床上轻摇1h；

(13)配置5％bsa/tbst，按购自cst公司的抗体cox-2、nf-κb、erk1/2mapk说明书相应的比例稀释cox-2、nf-κb、erk1/2mapk抗体，加入到已转膜完毕的pvdf膜上，置于4℃冷库中过夜孵育；

(14)第二天，取出pvdf膜并恢复至室温，移去一抗并用洗液tbst洗膜3次，5min/次。随后加入按体积比(v/v)1:1000进行稀释的与辣根过氧化物酶(hrp)偶联的羊抗兔二抗,室温孵育1h。移去二抗并用洗液tbst洗膜3次，5min/次；

(15)取出膜，滤纸上滴干水分，加入ecl免疫荧光化学发光显色剂；

(16)于暗室中进行压片，并在显影液显影及定影液固定胶片；

(17)结果分析与整理。

4.实验结果

臭灵丹二醇的细胞毒性：利用mtt法测得受试药物的半数有毒浓度(tc50)为282.06μg/ml。

结果如图1所示，流感a/pr8/3/4(h1n1)感染a54924h后，细胞信号通路cox-2、nf-κb、erk1/2mapk明显活化。臭灵丹二醇明显抑制流感a/pr8/3/4(h1n1)诱导人a549细胞信号通路cox-2、nf-κb、erk1/2mapk信号通路的活化。

实施例3:臭灵丹二醇抑制流感病毒介导的炎症反应

1.材料、仪器

药物：臭灵丹二醇，自制。

细胞、病毒：人肺腺癌549细胞株(humanalveolarepithelialcell,a549)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库、甲型h1n1流感病毒(a/pr/8/34,h1n1)，以reed-muench法测定其感染复数(m.o.i)，以m.o.i＝0.1作为病毒滴度感染细胞。

试剂：dmem/f12(1:1)培养基(批号：8114176)；pbs(批号：20150122),胎牛血清(批号：10099)均购自gibco公司；tpck(批号：20140220)购自广州捷倍斯公司。reat-timepcr试剂购买自takarra公司，cat^#rr390a。ripa裂解液购自美国sigma公司。mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2)购自genebase。

仪器：

heracell150i恒温co2培养箱，美国thermo公司

bhc-1300iia/b3二级生物安全柜，苏州净化设备有限公司

leicadm3000倒置显微镜，徕卡公司

tgl-16m高速台式冷冻离心机，德国eppendorf公司

avantij-26高速冷冻离心机，美国beckmancoulter公司

sigmaj-26冷冻离心机，德国sigma公司

bs115-eshk01水平摇床，太仓科教器材厂

al201电子天平，梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司

du800紫外及可见光分光亮度计，美国beckman公司

jy-1000m型电热恒温鼓风干燥箱，吴江市志胜烘箱设备厂

multiscanmk3型酶标仪，美国thermo公司

real-timepcr仪，abi7500

荧光显微镜

2.实时荧光定量pcr实验方法

a549细胞以每孔5×10⁴个/ml接种于96孔板，待细胞长成单层，弃去培养液，用pbs润洗一遍。用不含血清的dmem将甲型流感病毒h1n1(a/pr/8/34(h1n1)(moi＝0.2)、h9n2(a/chicken/guangdong/1996)(moi＝0.2)分别感染细胞，于37℃孵箱吸附细胞2小时。用不含胎牛血清的dmed/f12将药物(臭灵丹酸)稀释成不同浓度(100、25、6.25μg/ml)加入细胞干预，24h后分别收集细胞上清液，用trizol(invitrogen)提取rna，随后用反转录试剂盒将500ng的rna反转录成cdna，使用定量pcr(abi7500real-timepcr)进行炎症因子的分析。qpcr反应条件：变性95℃、30s；退火95℃、5s(40个循环)；延伸60℃、40s。本实施例中进行实时定量pcr反应时所用的炎症因子的引物序列及探针序列如下:

引物名称引物序列(5'--3')

ip-10(human)-f：gaaattattcctgcaagccaattt

ip-10(human)-r：tcacccttctttttcat-tgtagca

ip-10(human)-probefam-tccacgtgttgagatca-3'tam

tnf-α(human)-faacatccaaccttcccaaacg

tnf-α(human)-rgaccctaagcccccaattctc

tnf-α(human)-probefam-ccccctccttcagacaccctcaacc-tam

mcp-1(human)-fcaagcagaagtgggttcaggat

mcp-1(human)-ragtgagtgttcaagtcttcggagtt

mcp-1(human)-probefam-catggaccacctggacaagcaaacc-tam

3.实验结果

结果见附图2所示，臭灵丹二醇(31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml)干预后明显抑制了h1n1流感病毒诱导的炎症因子(ip-10,tnf-α,mcp-1)的基因转录水平，呈剂量依赖关系。该实验结果表明，臭灵丹二醇可抑制流感病毒诱导的过度炎症应答，有望用于制备防治流感的药物。