一种干细胞体外富集筛选系统和方法与流程

本发明涉及干细胞治疗领域的一种干细胞体外富集筛选系统和方法。

背景技术

近年来研究发现的自体干细胞富集技术，即不经过体外培养的干细胞，直接回植，不但能避免免疫排斥反应，而且富集的自体干细胞可以利用局部的微环境实现其定向诱导盒组织再生，由此对一些疾病的治疗带来了希望。其最大的优点是无需体外培养，可在手术同期进行，避免了复杂操作的技术问题和相关的伦理学问题，这是传统方法无法替代和比拟的。随着干细胞研究的不断深入，以骨髓干细胞(bonemarrowstemcells，bmscs)作为种子细胞的细胞治疗受到越来越多的关注。bmscs促进骨修复的动物实验已获得较为肯定的效果，但进行临床治疗仍受到诸多限制。第一，单纯用自体骨髓血进行治疗时，因单位体积骨髓血中bmscs量少而使疗效降低。第二，若采用细胞体外培养扩增，则患者要等待一段时间才能进行回植手术，一般约需要3周时间，不能满足临床急诊或及时治疗的需要；且体外培养必须避免各种微生物的污染，对环境和设备的要求较高，因此增加了治疗费用；另外体外培养常以牛胎盘血清为培养基，这也带来了临床细胞治疗的伦理学争议；不用体外培养即能在术中获得高浓度的bmscs干细胞富集筛选技术得到了发展。

目前细胞富集筛选技术主要有：流式细胞仪分离法、免疫磁珠分离法、贴壁筛选法和密度梯度离心法。流式细胞仪分离法是应用特异的荧光抗体与细胞表面的抗原标志结合，然后应用流式细胞仪对干细胞进行分选。其分离细胞虽然迅速，纯度高，但是费用昂贵，对含量太低的痕量细胞难以分离，不能处理大量的细胞样品，要获得无菌的干细胞悬液也很困难。

免疫磁珠分离法是利用微磁珠既可结合蛋白质，又可被磁铁吸引的特点，将抗体包被在磁珠上,通过与干细胞表面特异性抗原结合，形成抗原-抗体磁珠免疫复合物。当该复合物通过分离柱时，在磁力作用下，即与母液分离，从而使干细胞与其他物质分离，达到筛选的目的。其对细胞的活性影响较大，回收率仅有60％-75％，可能会导致细胞完全失活，同样操作较复杂，价格昂贵。

贴壁筛选法是目前实验室最常用的骨髓基质干细胞筛选方法，通过将骨髓血在培养皿中培养，24-48h后骨髓基质干细胞贴壁，借此可将骨髓基质干细胞与其它不贴壁的骨髓细胞分离。其需要时间较长，涉及细胞的体外培养，临床使用有一定难度。

密度梯度离心法是常用的浓缩分离细胞的方法，利用不同细胞成分密度梯度的差异，通过离心可以使细胞在不同层次浓集，结合使用不同比重的分离液，将不同比重的细胞进行分层分离。其需要使用分离介质再最后需要洗去分离介质，要保持整个操作的无菌需要特殊的设备，费用昂贵。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种干细胞体外富集筛选系统和方法，其可以直接获得干细胞悬液，更能满足临床的多种需要，由于无需使用生物多孔陶瓷，可有效提高干细胞富集筛选的效率，降低干细胞富集筛选，得到干细胞悬液的成本和时间，满足急诊临床手术的要求。

实现上述目的的一种技术方案是：一种干细胞体外富集筛选系统，包括若干过滤盒和一个密封的壳体；

所述过滤盒可在所述壳体内从下至上依次串联为一个过滤盒组，所述过滤盒组可在所述壳体内与一个位于所述壳体外的蠕动泵组成闭环循环系统；

每个过滤盒内均设有用于吸附骨髓干细胞的吸附膜；

所述干细胞体外富集筛选系统还包括：

用于盛放所述过滤盒，使干细胞从所述过滤盒的吸附膜上脱落进入干细胞悬液的振荡器，以及一套可使所述过滤盒并联，用于将干细胞淋洗入干细胞悬液,并将干细胞悬液从所述过滤盒内回收的洗脱管路。

进一步的,所述过滤盒的上下两端对应设有可封闭的上密封接口和下密封接口。

再进一步的,所述过滤盒组中的任意相邻两个过滤盒之间通过连接接头串联，所述连接接头的顶端连接上方的过滤盒的下密封接口，所述连接接头的底端连接下方的过滤盒的上密封接口。

再进一步的,所述洗脱管路包括可与所述过滤盒的上密封接口连接的上洗脱管路，以及可与所述过滤盒的下密封接口连接的下洗脱管路。

进一步的,所述过滤盒为顶面面积大，底面面积小的锥形过滤盒。

进一步的,所述壳体的顶端设有顶部接口，所述顶部接口连通所述过滤盒组，并通过出血管路连通所述蠕动泵的进口；

所述壳体的底端设有底部接口，所述底部接口上设有三通阀，所述三通阀连通所述过滤盒组，并通过回血管路连通所述蠕动泵的出口。

进一步的,所述吸附膜具有由两层多孔膜组成的双层结构,每层多孔膜的孔径均为干细胞直径的5～8倍。

实现上述目的的另外一种技术方案是：一种干细胞体外富集筛选方法，包括下列步骤：

吸附步骤：将若干内置吸附膜的过滤盒串联为一个过滤盒组，并使所述过滤盒组与一个蠕动泵组成一个闭环循环系统，对骨髓血液进行循环，并在循环过程中通过所述吸附膜吸附骨髓血液中的骨髓干细胞；

振荡分离步骤：将所述过滤盒组分离为单个的过滤盒，并在每个过滤盒中加入3～5ml生理盐水，对所述过滤盒进行振荡，使骨髓干细胞从所述吸附膜上脱落，进入生理盐水中，形成干细胞悬液；

收集步骤：通过洗脱管路将各过滤盒内吸附膜上残留的干细胞，淋洗到对应过滤盒内的干细胞悬液中，并回收各个过滤盒内的干细胞悬液。

进一步的,所述生理盐水中含有0.01wt.％抗凝因子或0.01wt.％肝素。

采用了本发明的一种干细胞体外富集筛选系统的技术方案，包括若干个过滤盒串联成的过滤盒组和一个密封的用于盛放过滤盒组的壳体，每个过滤盒内均设有用于吸附骨髓干细胞的吸附膜；过滤盒组可与一个位于壳体外的蠕动泵组成闭环循环系统；干细胞体外富集筛选系统还包括：用于盛放过滤盒，使干细胞从吸附膜上脱落进入干细胞悬液的振荡器，以及一套可使过滤盒并联，用于将干细胞从吸附膜淋洗到干细胞悬液中并回收干细胞悬液的洗脱管路。其技术效果是：其能有效提高干细胞体外富集筛选的效率，通过干细胞快速黏附技术快速收集获得富集有骨髓干细胞的悬液，而不是干细胞与材料的复合物，而降低干细胞体外富集筛选的成本，满足临床只需要干细胞悬液的情况要求。

采用了本发明的一种干细胞体外富集筛选方法的技术方案，一种干细胞体外富集筛选方法，包括下列步骤：吸附步骤：将若干内置吸附膜的过滤盒串联为一个过滤盒组，并使所述过滤盒组与一个蠕动泵组成一个闭环循环系统，对骨髓血液进行循环，并在循环过程中通过所述吸附膜吸附骨髓血液中的骨髓干细胞；振荡分离步骤：将所述过滤盒组分离为单个的过滤盒，并在每个过滤盒中加入3～5ml生理盐水，对所述过滤盒进行振荡，使骨髓干细胞从所述吸附膜上脱落，进入生理盐水中，形成干细胞悬液；收集步骤：通过洗脱管路将各过滤盒内吸附膜上残留的干细胞，淋洗到对应过滤盒内的干细胞悬液中，并回收各个过滤盒内的干细胞悬液。其技术效果是：其能有效提高干细胞体外富集筛选的效率，通过干细胞快速黏附技术快速收集获得富集有骨髓干细胞的悬液，而不是干细胞与材料的复合物，而降低干细胞体外富集筛选的成本，满足临床只需要干细胞悬液的情况要求。

附图说明

图1为本发明的一种干细胞体外富集筛选系统的闭环循环系统的示意图。

图2为本发明的一种干细胞体外富集筛选系统的振荡分离器的示意图。

图3为本发明的一种干细胞体外富集筛选系统的洗脱管路的示意图。

图4为本发明的一种干细胞体外富集筛选方法的流程图。

具体实施方式

请参阅图1至图4，本发明的发明人为了能更好地对本发明的技术方案进行理解，下面通过具体地实施例，并结合附图进行详细地说明：

请参阅图1，本发明的一种干细胞富集筛选系统包括，若干个过滤盒2、一个密封的壳体1以及位于壳体1外的蠕动泵3。过滤盒2的数量通常为三至六个。过滤盒2的上端设有可封闭的上密封接口21，过滤盒2的下端设有可封闭的下密封接口22，上方的过滤盒2的下密封接口22和下方的过滤盒2的上密封接口21之间可通过医用的连接接头23串联。若干个过滤盒2可在壳体1内从下至上依次串联，形成一个过滤盒组。每个过滤盒2内均设有用于吸附骨髓干细胞的吸附膜20。

壳体1的顶部通过盖体11封闭，盖体11的中心设有顶部接口12，壳体1的底部设有底部接口13。所述过滤盒组置于壳体1内，所述过滤盒组中最顶端的过滤盒2的上密封接口21通过顶部接口12连通位于壳体1外的出血管路31，出血管路31连通蠕动泵3的进口。过滤盒组中最底端的过滤盒2的下密封接口22通过底部接口13连通位于壳体1外的三通阀14，三通阀14连通回血管路32，回血管路32连通蠕动泵3的出口。过滤盒组与蠕动泵3形成闭环循环系统，骨髓血液在所述闭环循环系统内循环10分钟后，所述过滤盒组中各个过滤盒2内的吸附膜20可以至少吸附骨髓血液中，85％的骨髓干细胞，完成骨髓干细胞的采集。同时，三通阀14还连通进血管路33，骨髓血液通过进血管路33进入所述闭环循环系统，以及从所述闭环循环系统回收骨髓血液。

吸附膜20具有由两层多孔膜组成的双层结构,每层多孔膜的孔径均为干细胞直径的5～8倍。吸附膜20材料选自β-磷酸三钙、天然型无机骨nnb、脱钙骨基质dbm、煅烧骨、聚乳酸-聚羟乙酸、胶原或冻干松质骨。上述材料对骨髓干细胞均有很好的吸附特性。

所述闭环循环系统利用吸附膜20对于骨髓干细胞快速吸附的特性，因此骨髓血液在所述闭环循环系统内循环的过程中，骨髓血液中的细胞可以被吸附膜20快速吸附，提高骨髓干细胞富集筛选的效率以及采集过程中骨髓干细胞的存活率，提高骨髓干细胞的采集量，减少患者的采血量，保障患者的安全，减轻患者的痛苦和风险，降低了干细胞富集筛选的成本，同时减少采集过程中骨髓干细胞污染的可能性。

本发明的一种干细胞富集筛选系统包括振荡器4，通过在骨髓血液循环过程中，通过吸附膜20的吸附，采集完骨髓干细胞后，过滤盒组被从壳体1内取出，医用的连接接头23与对应的过滤盒2分离，过滤盒组被拆解为单个的过滤盒2，从上密封接口21向对应的过滤盒2中加入3～5ml的生理盐水，生理盐水中可含有0.01wt.％抗凝因子或0.01wt.％肝素，或0.01wt.％的其它抗凝剂，以保证骨髓干细胞的存活率，防止骨髓干细胞在干细胞悬液中聚集。然后过滤盒2投入振荡器4，通过振荡器4的振荡，使干细胞从吸附膜20上脱落，进入生理盐水中，形成干细胞悬液。为了提高干细胞富集筛选的效率，振荡器4选用一次可以完成多个过滤盒2内骨髓干细胞与吸附膜20的分离的离心振荡器，因此过滤盒2的数量优选偶数个，且过滤盒2为顶面面积大，底面面积小的锥形过滤盒。

本发明的一种干细胞富集筛选系统还包括一套可使过滤盒2并联的洗脱管路5。洗脱管路5包括与各个过滤盒2的上密封接口21连接的上洗脱管路51，以及与各个过滤盒2的下密封接口22连接的下洗脱管路52。上洗脱管路51与各个过滤盒2的上密封接口21之间，下洗脱管路52与各个过滤盒2的下密封接口22之间均设有截止阀。上洗脱管路51用于向各个过滤盒2内注入1～2ml的生理盐水，生理盐水中可含有0.01wt.％抗凝因子或0.01wt.％肝素，或0.01wt.％的其它抗凝剂，用于对过滤盒2内的吸附膜20进行淋洗，使剩余的骨髓干细胞与吸附膜20分离，进入干细胞悬液中。干细胞悬液可以从下洗脱管路52中回收，用于后续的治疗。

对于本发明的一种干细胞富集筛选系统的操作均在无菌状态下进，其能有效提高干细胞富集筛选的效率，满足临床手术中随取随用的要求。

本发明的一种干细胞体外富集筛选方法，包括下列步骤：

吸附步骤：将若干内置用于对骨髓血液中的骨髓干细胞进行吸附的吸附膜20的过滤盒2串联为一个过滤盒组，并使所述过滤盒组与一个蠕动泵3组成一个闭环循环系统，对骨髓血液进行循环，并在循环过程中通过吸附膜20吸附骨髓血液中的骨髓干细胞，循环的时间为10min，吸附膜20可以吸附骨髓血液中85％以上的骨髓干细胞。

振荡分离步骤：将过滤盒组分将为单个的过滤盒2，并在每个过滤盒2中加入3～5ml生理盐水，对过滤盒2进行振荡，使骨髓干细胞从吸附膜20上脱落，进入生理盐水中，形成干细胞悬液；所述生理盐水中含有0.01wt.％的抗凝因子、或0.01wt.％的肝素，或0.01wt.％的其它抗凝剂，防止骨髓干细胞聚集，提高骨髓干细胞的存活率，减少患者的采血量，保障患者的生命安全。

收集步骤：通过洗脱管路将各过滤盒2内吸附膜20上残留的干细胞，淋洗到对应过滤盒2内的干细胞悬液中，并回收各个过滤盒2内的干细胞悬液，以提高骨髓干细胞的富集效率，然后去除干细胞悬液中的上层清液，回收下层的干细胞。淋洗液为生理盐水，且生理盐水中含有0.01wt.％的抗凝因子、或0.01wt.％的肝素，或0.01wt.％的其它抗凝剂，防止骨髓干细胞聚集，提高骨髓干细胞的存活率，减少患者的采血量，保障患者的生命安全。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。