专利名称:富集干细胞骨修复材料及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学修复重建领域，具体涉及用作临床上的骨修复材料的富集干细胞骨修复材料及其制备方法。该新型骨修复材料采用多孔支架材料通过聚赖氨酸等表面修饰剂采用冷冻干燥法修饰制得，使原材料获得网孔结构和表面粘附性能优化，能选择性结合手术中抽取的红骨髓中的干细胞和促成骨因子，从而提高骨修复材料的成骨活性，用作临床上的骨修复材料。
背景技术：
严重创伤、肿瘤切除、骨关节结核及感染、先天性骨关节疾病和骨性关节炎等原因所致的各种骨缺损以十分常见，而脊柱融合、人工假体固定等手术对骨移植材料的需求量也十分巨大。
自体骨移植是目前临床治疗骨缺损较有效的方法，但来源有限且会造成供区新的骨缺损，对病人造成新的生理和心理创伤，是一种创伤性修复模式；异体骨、珊瑚及人工替代材料如三磷酸钙(TCP)、生物陶瓷或高分子材料等成骨能力较差，应用受限。
干细胞富集技术的原理是通过基质材料适当的网孔结构和良好的表面粘附性能，在骨髓流经时选择性的结合表达丰富粘附分子的干细胞，使其得以富集；而红细胞和淋巴系细胞等成分则较少被保留，富集的骨髓基质干细胞和其它干细胞协同促进成骨，如造血干细胞(HSC)能促进骨修复材料的血管化)。另一方面，骨髓流经基质材料时的凝固过程中会释放出促成骨因子，如血小板在凝血时释放的血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子(TGF)，在体内它们可以促进成骨前体细胞的增殖并向成骨细胞转化。
总的说来，骨髓干细胞富集技术具有快速、简单、有效的促成骨作用，根据此技术能开发出能随取随用、成本低廉、便于批量生产和储存运输的骨修复材料，适合各类型骨缺损，尤其适合战创伤及急诊患者的救治。
发明的内容本发明的目的是提供一种采用表面修饰剂用冷冻干燥法对多孔支架材料进行表面修饰后制得的富集干细胞骨修复材料，该材料能快速选择性结合手术中抽取的红骨髓中的干细胞和促成骨因子，从而改善支架材料的成骨活性。
本发明另一个目的是提供一种生产上述富集干细胞骨修复材料的方法。
实现本发明的目的之一而采用的技术方案是这样的，即一种富集干细胞骨修复材料，由多孔支架材料与表面修饰剂复合构成。
上述表面修饰剂为聚合材料或蛋白质成分时，当表面修饰剂为聚合材料时，在产品干重中的质量百分比为0.01-2％，当表面修饰剂为蛋白质成分时，在产品干重中的质量百分比为0.1-20％。
上述多孔支架材料选自异体脱钙骨基质(DBM)、TCP、医用珊瑚中的一种，采用冷冻干燥法与表面修饰剂进行表面修饰后制得。
上述聚合材料表面修饰剂选自聚赖氨酸、聚乳酸、聚乙二醇、聚硅氧烷、聚氧化乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸(酯)、聚氨酯、聚磷酸酯、聚羟基乙酸(酯)、聚羟基丁酸(酯)、聚(酸)酐、聚己内酰胺、聚氨基酸、聚羟乙基甲基丙烯酸(酯)及上述多聚物间的共聚物。上述蛋白质成分表面修饰剂选自纤维蛋白、骨胶原、医用生物蛋白胶、明胶及上述材料表面修饰剂的混合物。
所述富集干细胞骨修复材料的制备方法步骤如下1、表面修饰剂的配制；2、支架材料与表面修饰剂的复合；3、支架材料的冷冻干燥；4、产品验证(1)大体和组织学观察外观呈白色或淡黄色海绵状外观，无肉眼可见杂质。显微镜下观察材料为网孔样结构，孔隙内清洁或为蛛丝样外观。(2)干细胞富集效率检测抽取健康志愿者新鲜红骨髓100毫升，肝素抗凝，以10-200毫升/分钟的速度均匀流经5克干细胞富集支架材料(干重)，反复3次，比较开始前和最末次后骨髓中有核细胞密度和其中的CD44、CD105阳性细胞率及CD34、CD45阴性细胞率的变化比率。上述5项指标均应不低于30％。(3)体内检测抽取大动物新鲜红骨髓100毫升，肝素抗凝，以10-200毫升/分钟的速度均匀流经5克干细胞富集支架材料(干重)，反复3次，最终产品用于修复大动物20％去骨膜大段骨缺损模型。
附图1富集干细胞骨修复材料的大体观察图。A图可见脱钙骨基质(DBM)支架材料表面覆盖了多聚-L-赖氨酸层；B图可见β-TCP富集基质材料大小空隙散在分布。
附图2富集干细胞骨修复材料的扫描电镜图。A图可见脱钙骨基质(DBM)支架材料原有的网孔结构中形成了更细小的多聚-L-赖氨獭网孔。B图可见网孔结构中散在的纤维蛋白网孔。
附图3不同富集干细胞骨修复材料干细胞富集倍数统计表。如该统计表所示，不同支架材料和不同浓度的表面修饰剂配比后制成的富集干细胞骨修复材料对骨髓中的干细胞富集效率有显著影响。
附图4富集干细胞骨修复材料修复猪股骨X线片。A图为对照组，术后当日图片见猪股骨20％骨缺损模型及植入的TCP空白支架材料；术后1月见骨缺损区域X线密度略升高，术后3月骨缺损区域X线检查见少量新骨形成，骨缺损区域仍为骨不连。B图为实验组，术后当日图片见猪股骨20％骨缺损模型及植入的TCP富集干细胞骨修复材料；术后1月可见骨缺损区域X线密度升高，较对照组密度高；术后3月骨缺损区域X线检查可见明显新骨形成，已修复骨缺损区域。
具体实施方式实施例1聚赖氨酸修饰的脱钙骨基质(DBM)支架材料制备过程1、表面修饰剂溶液的配制将多聚-L-赖氨酸配成0.05％的水溶液。
2、支架材料与表面修饰剂的复合将脱钙骨基质(DBM)支架材料浸泡于步骤1的溶液中，置于4℃环境8～12小时。
3、支架材料的冷冻干燥取出步骤2中的支架材料在-60℃～-80℃，真空度80～100N，12～24小时，冷冻干燥，使终产品的水分含量≤6％。该步骤可使用Savant冷冻干燥机实现；4、产品验证(1)大体和组织学观察呈白色或淡黄色海绵状外观，无肉眼可见杂质(见图1)。显微镜下观察材料为网孔样结构，孔隙内清洁或为蛛丝样外观(见图2)。(2)干细胞富集效率检测抽取健康志愿者新鲜红骨髓100毫升，肝素抗凝，以100毫升/分钟的速度均匀流经5克干细胞富集支架材料(干重)，反复3次，骨髓中有核细胞密度由3.70×10E6减低到2.37×10E6，干细胞富集率为12.95倍(见图3)，CD44阳性细胞率由94.6％降低到54.3％，CD105阳性细胞率由95.4％降低到56.7％，CD34阴性细胞率由97.6％降低到54.3％，CD45阴性细胞率由95.8％降低到59.3％。(3)体内检测抽取贵州小香猪新鲜红骨髓100毫升，肝素抗凝，以100毫升/分钟的速度均匀流经5克干细胞富集支架材料(干重)，反复3次，最终产品用于修复贵州小香猪自体20％去骨膜大段骨缺损模型，剩余骨髓用过滤回收装置处理后静脉回输给实验动物，术后3个月骨缺损修复处X片可见明显新骨形成。
实施例2生物蛋白胶修饰的三磷酸钙(TCP)支架材料制备过程1、表面修饰剂溶液的配制将生物蛋白胶中的主体胶(纤维蛋白原浓缩液)与激化剂(凝血酶及钙离子溶液)分别和双蒸水配成20％的溶液。所述生物蛋白胶为市售产品。
2、支架材料与表面修饰剂的复合将磷酸三钙(TCP)支架材料浸泡于步骤1中的主体胶稀释液中，置于4℃环境半小时后捞起，沥干5分钟放入激化剂稀释液中静置半小时。
3、取出步骤2中的支架材料在-60℃～-80℃，真空度80～100N，12～24小时，冷冻干燥，使终产品的水分含量≤6％即得。
4、产品验证大体观察、组织学观察和干细胞富集效率检测方法见实施例一。体内检测抽取贵州小香猪新鲜红骨髓100毫升，肝素抗凝，以100毫升/分钟的速度均匀流经5克干细胞富集支架材料(干重)，反复3次，最终产品用于修复贵州小香猪自体20％去骨膜大段骨缺损模型，剩余骨髓用过滤回收装置处理后静脉回输给实验动物，术后当天、1月、3月拍骨缺损修复处X片(见图4)A图为对照组，术后当日图片见猪股骨20％骨缺损模型及植入的TCP空白支架材料；术后1月见骨缺损区域X线密度略升高，术后3月骨缺损区域X线检查见少量新骨形成，骨缺损区域仍为骨不连。B图为实验组，术后当日图片见猪股骨20％骨缺损模型及植入的TCP富集干细胞骨修复材料；术后1月可见骨缺损区域X线密度升高，较对照组密度高；术后3月骨缺损区域X线检查可见明显新骨形成，已修复骨缺损区域。
实施例3富集干细胞骨修复材料干细胞富集效果观察采用DBM及TCP支架材料分别采用0.01％、0.05％、0.1％、0.15％和0.2％浓度的多聚-L-赖氨酸溶液修饰处理后在体外检测干细胞富集效率(方法同实施例1)，结果表明不同支架材料和不同浓度的表面修饰剂配比后制成的富集干细胞骨修复材料对骨髓中的干细胞富集效率有显著影响。DBM支架材料较TCP支架材料富集效率更高，经0.01％-0.05％多聚-L-赖氨酸溶液修饰处理形成的富集干细胞骨修复材料富集浓度可为骨髓中干细胞浓度的20-23倍。
本发明的特点是采用聚赖氨酸、纤维蛋白或生物蛋白胶等材料对DBM等现有的骨支架材料进行表面修饰，制备成适当网孔结构和表面性能优化的骨移植材料。采用该材料可在手术中穿刺抽取患者红骨髓，与上述基质材料即刻复合构建成具有高效成骨活性的骨缺损修复材料，避免了长时间体外培养过程。该骨修复材料具备高效的成骨活性和抗感染效能、随取随用、成本低廉、便于批量装备、便于储存运输等优点，较现有的生物衍生骨、组织工程骨有显著不同的技术特点，可用于临床各类骨缺损修复。
权利要求
1.一种富集干细胞骨修复材料，其特征是由多孔支架材料与表面修饰剂复合构成。
2.根据权利要求
1所述的富集干细胞骨修复材料，其特征是所述表面修饰剂为聚合材料或蛋白质成分时；当表面修饰剂为聚合材料，时在产品干重中的质量百分比为0.01-2％；当表面修饰剂为蛋白质成分时，在产品干重中的质量百分比为0.1-20％。
3.根据权利要求
1所述的富集干细胞骨修复材料，其特征是所述多孔支架材料选自异体脱钙骨基质、磷酸三钙、医用珊瑚中的一种。
4.根据权利要求
1所述的表面修饰剂，其特征是所述表面修饰剂选自聚赖氨酸、聚乳酸、聚乙二醇、聚硅氧烷、聚氧化乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸(酯)、聚氨酯、聚磷酸酯、聚羟基乙酸(酯)、聚羟基丁酸(酯)、聚(酸)酐、聚己内酰胺、聚氨基酸、聚羟乙基甲基丙烯酸(酯)及上述多聚物间的共聚物；所述蛋白质成分表面修饰剂选自纤维蛋白、骨胶原、医用生物蛋白胶、明胶及所述材料表而修饰剂的混合物。
5.一种制备如根据权利要求
1所述的富集干细胞骨修复材料的方法，其特征是制备方法步骤如下(1)、表面修饰剂溶液的配制；(2)、支架材料与表面修饰剂的复合；将支架材料浸泡于步骤(1)的溶液中，置于4℃环境8～12小时；(3)、支架材料的干燥；取出步骤(2)中的支架材料在-60℃～-80℃，真空度80～100N，冷冻干燥12～24小时，使终产品的水分含量≤6％。
专利摘要
本发明涉及用作临床上的骨修复材料的富集干细胞骨修复材料，由多孔支架材料与表面修饰剂复合构成；其中表面修饰剂为聚合材料时，在产品干重中的质量百分比为0.01－2％，当表面修饰剂为蛋白质成分时，在产品干重中的质量百分比为0.1－20％。本发明使原材料获得网孔结构和表面粘附性能优化，能选择性结合手术中抽取的红骨髓中的干细胞和促成骨因子，从而提高骨修复材料的成骨活性，用作临床上的骨修复材料。本发明还涉及制备所述富集干细胞骨修复材料的方法。
文档编号A61L27/38GK1994479SQ200610095345
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月25日
发明者许建中, 王序全, 周强, 罗飞, 何清义 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan