专利名称:结核分枝杆菌琥珀酰辅酶a合成酶基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域：
，涉及结核分枝杆菌琥珀酰辅酶A合成酶基因及其用途，尤其是在琥珀酰辅酶A合成酶活性调控分子筛选、利用琥珀酰辅酶A合成酶的结核病预防性疫苗和结核病诊断试剂方面的用途。
背景技术：
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)耐药性日趋严重，结核菌和HIV病毒联合感染，严重威胁人类健康。因此，开发新的抗结核药物迫在眉睫。结核菌H37Rv和CDC1551基因组序列的测定和注释工作的完成，加速了结核菌致病机理的研究，由此发现了大量与结核菌致病相关的因子，这为抗结核药物的开发提供了大量的候选药物靶标。本实验室的前期研究，利用双向电泳技术，对猫爪草提取物作用前后的结核分枝杆菌临床分离株的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析，结果表明琥珀酰辅酶A合成酶基因(Rv0951)在药物处理前后表达下调，并首次报道了其参与结核分枝杆菌的重要生理活动。
从琥珀酰辅酶A合成酶出发，有可能开发治疗潜伏性结核病的新药，以及以其作为预防性疫苗，或者作为潜伏性结核病的诊断试剂的组分。
发明内容本发明的目的在于提供，1.一种重组表达结核菌琥珀酰辅酶A合成酶的工程菌；2.获得大量纯化的琥珀酰辅酶A合成酶，进行抗体制备；3.利用含有琥珀酰辅酶A合成酶的工程菌作为药物靶标研发新的药物的模型；4.含有琥珀酰辅酶A合成酶的DNA疫苗或者亚单位疫苗的构建及其应用。
本发明的技术方案如下采用本领域技术人员熟知的技术，从结核菌基因组扩增琥珀酰辅酶A合成酶基因，在大肠杆菌等适宜的宿主表达，纯化表达产物，进行抗体制备，亚单位疫苗制备以及DNA疫苗制备并检测效果。
实现上述目的的基本技术路线为总体技术方案是克隆包括提取结核菌基因组，利用合适的载体和限制性内切酶片段，构建转化载体，将基因组DNA克隆到合适的大肠杆菌宿主细胞。
1.基因模板提取将待克隆菌株在LB培养基或YE培养基或者Middlebrook 7H9、sauton等分枝杆菌能够生长的培养基中，培养到合适的菌体浓度，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法提取菌体DNA。
2.工程菌的构建按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法，将基因组DNA克隆到适当的载体，转化适当的宿主菌，通过一定的选择标记，收集获得的工程菌。
3.功能基因的筛选按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、完全可以从商业途径获得的载体、限制性内切酶和方法，将目标基因克隆到载体，转化宿主细胞，筛选转化子。分别根据已知的结核菌入侵人体和动物模型可能遭遇的不利环境，进行人工模拟，从基因组表达文库筛选相应的转化子，并进一步验证。
4.利用含有功能基因的重组菌，进行功能基因抑制剂或激活剂的筛选。
发明效果利用本技术方案涉及的方法，得到了1.一种重组表达结核菌琥珀酰辅酶A合成酶的工程菌；2.获得大量纯化的琥珀酰辅酶A合成酶，进行抗体制备；3.利用含有琥珀酰辅酶A合成酶的工程菌作为药物靶标研发新的药物的模型；4.含有琥珀酰辅酶A合成酶的DNA疫苗或者亚单位疫苗的构建及其应用。
图1.结核分枝杆菌琥珀酰辅酶A合成酶PCR产物。
图2.重组表达的结核分枝杆菌琥珀酰辅酶A合成酶产物。
具体实施方式1材料和方法1.1材料1.1.1菌株与载体结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，以下简称MTB)H37Rv(重庆市肺科医院提供)；大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)和载体pET-32a(+)由本实验室保存。
1.1.2主要试剂Taq DNA Polymerase，DNA marker DL2000购自北京天为时代科技有限公司；DNA纯化试剂盒为BioFlux产品；限制性内切酶(EcoRI和HindIII)，T4DNA连接酶和dNTP购自TaKaRa公司；IPTG购自北京鼎国生物技术有限公司；氨苄西林购自BBI公司；其余化学试剂均为分析纯。
1.1.3仪器电泳槽DYCP-31D和DYCZ-24D，电泳仪DYYU-8C为北京六一仪器厂产品；PCR仪为Bio-Rad产品；Ni Sepharose和KTAprime为Amersham Biosciences公司产品；全波长扫描仪SpectraMax190为Molecular Device公司产品。
1.2方法1.2.1SCS-beta基因的系统进化分析在NCBI上调取Aspergillus、candida、E.coli、homo sapiens、legionella、neurospora、shigella、yeast、Mycobacterium属菌株的SCS-beta基因序列，通过ClustalX(1.83)软件进行了分析。
1.2.2目的基因PCR扩增根据GenBank登录的MTB H37Rv sucC编码序列(GeneID885434)设计引物(Invitrogen公司合成)，序列以及酶切位点如下f-primer；5′-GGGGAATTCATGGATCTTTTCGAGT-3′(下划线为EcoRI酶切位点)；r-primer5′-TGTTCGAATGAGTCATGGGTCCTTTC-3′(下划线为HindIII酶切位点)PCR反应体系及条件PCR反应体系(25μl)10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μl，dNTP 2μl，引物P(10μM)各1.5μl，模板2μl，Taq 0.5μl。
PCR反应条件95℃ 5min；95℃ 1min，56℃ 45s，72℃ 2min，35个循环；72℃ 10min。电泳检测，纯化PCR产物。
1.2.3目的基因的克隆与鉴定用EcoRI和HindIII双酶切PCR产物和pET32a(+)载体，琼脂糖电泳纯化，回收酶切的基因片段和载体，然后用T4DNA连接酶16℃连接过夜，产物转化E.coli DH5α(CaCl2法)，涂布于LB平板(含100μg/ml氨苄青霉素)上，37℃培养。挑取阳性克隆培养并抽提质粒，PCR和酶切鉴定重组质粒。将获得的重组质粒pSCS-pET32a(+)送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.2.4目的基因的表达与鉴定从含pSCS-pET32a(+)质粒的DH5a菌株中抽提质粒，转化E.coliBL21(DE3)(CaCl2法)，涂布于LB平板(含100μg/ml氨苄青霉素)上，37℃培养。挑取阳性克隆培养菌落PCR鉴定重组质粒。
将原核表达重组克隆接种于5mL(含100μg/mL氨苄青霉素)的LB培养基中，37℃200rpmin培养过夜。取400ul接种于20mL LB培养基中，37℃200 rpmin培养至OD600为0.1，加IPTG至1mmol/L诱导表达，4小时后取样。以同样的方法诱导含空质粒pET32a(+)的E.coliBL21(DE3)作对照。
1.2.5SDS-PAGE分析取菌液1.0mL，12000rpm离心2min，沉淀菌体中加入90μL 5×SDS louding buffer和10ulβ-巯基乙醇，，混匀后，于沸水中煮沸5min，12000rpmin离心10min，取上清15μL进行10％SDS-PAGE。
权利要求
1.结核分枝杆菌琥珀酰辅酶A合成酶基因，其特征是表达结核菌琥珀酰辅酶A合成酶的重组工程菌、纯化的重组酶以及利用纯化的酶或工程菌进行结核分枝杆菌琥珀酰辅酶A合成酶调节分子的筛选。
2.权利要求
1所述的结核分枝杆菌琥珀酰辅酶A合成酶在结核病诊断和药物治疗效果监控中的用途，其特征是利用重组表达的琥珀酰辅酶A合成酶的抗体或者抗体类似分子进行免疫检测。
3.权利要求
1所述的结核分枝杆菌琥珀酰辅酶A合成酶在DNA疫苗或者亚单位疫苗中的应用，其特征是利用结核分枝杆菌琥珀酰辅酶A合成酶及其产物，作为疫苗组分，预防结核病。
专利摘要
本发明属于生物技术领域：
，涉及结核分枝杆菌琥珀酰辅酶A合成酶基因及其用途，尤其是在琥珀酰辅酶A合成酶活性调控分子筛选、利用琥珀酰辅酶A合成酶的结核病预防性疫苗和结核病诊断试剂方面的用途。利用本技术方案涉及的方法，得到了一种重组表达结核菌琥珀酰辅酶A合成酶的工程菌；获得大量纯化的琥珀酰辅酶A合成酶，进行抗体制备；利用含有琥珀酰辅酶A合成酶的工程菌作为药物靶标研发新的药物的模型；含有琥珀酰辅酶A合成酶的DNA疫苗或者亚单位疫苗的构建及其应用。
文档编号C40B30/04GK1995354SQ200610095344
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月25日
发明者谢建平, 杨文秀, 王洪海 申请人:西南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan