一种酰基辅酶a合成酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种酰基辅酶A合成酶及其应用，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。进一步构建能够分泌酰基辅酶A合成酶的基因工程菌，利用重组菌发酵生产酰基辅酶A合成酶。本发明提供的酰基辅酶A合成酶是迄今为止所发现的第一个对反式8-甲基-6-壬烯酸或8-甲基壬酸有活性的酶，可为克隆辣椒素合成酶基因提供直接底物。本发明提供的酰基辅酶A合成酶对中链脂肪酸有活性，还可用于生物柴油领域。
【专利说明】一种酰基辅酶A合成酶及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酰基辅酶A合成酶及其应用，属于酶工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]辣椒素，学名反式-8-甲基-N-香草基-壬烯酰胺，是辣胡椒(辣椒属)的一种具有刺激性味道的次生代谢产物。辣椒素是由辣椒素合成酶(CS )合成的，辣椒素合成酶是一种酰基转移酶。虽然编码CS的基因目前尚未被破译，但已知其主要作用是从8-甲基壬烯酰辅酶A上将8-甲基壬烯酰基转移到香草胺上，从而形成酰胺复合物。CS的底物，8-甲基壬烯酰是在酰基辅酶A合成酶(ACS)的作用下，由反式-8-甲基-6壬酰酸转化而来。
[0003]ACS催化羧酸转变为相应酰基辅酶A硫酯的过程共经历两个阶段。第一阶段，自由脂肪酸被转变为一种可以释放焦磷酸盐的酰基-AMP中间产物。第二阶段，活化的酰基基团被连接到辅酶A的巯基上，并释放AMP和酰基辅酶A产物(Groot et al.，1976)。ACS和一些相关蛋白被认为是具有一段高度保守的12氨基酸序列，这一序列可以形成连接AMP连接主体的核心(PR0SITTEPS00455)。在阿拉伯芥的植物模型中，约有44个假定的ACS基因已被鉴定(Shockey et al.，2003)。目前,约有一半的生物化学功能已被鉴定,其中包括长链酰基辅酶A合成酶，酰基-ACP合成酶，4-香豆酰基辅酶A连接酶，乙酰基辅酶A合成酶，0PC-8:0辅酶A连接酶，琥珀酰苯甲酰辅酶A连接酶，丙二酰辅酶A合成酶，草酰辅酶A合成酶(Shockey et al., 2003;Ko0., 2005;Koo et al., 2006;Kim et al., 2008;Lin andOliver, 2008;Chen et al.，2011 ;Foster et al.，2012)。在甜辣椒中，三种全长的假定ACS基因已被克隆(Lee et al., 2001;Mazourek et al.，2009)。然而，上述蛋白质的生物化学功能尚未得到鉴定。
[0004]由于辣胡椒的基因组序列尚不可用， 申请人:使用RNA测序技术对印度鬼椒的绿色果实进行了转录物组分析。印度鬼椒是羊草与蓬蒿菊的一种杂交体。 申请人:通过对原RNA序列数据的重叠组装获得18987重叠群，其中有33种编码与酰基辅酶A合成酶类似的蛋白质。在这些重叠群中，Comp2147-l显示了与CaSIG4能够很好地匹配。CaSIG4是一种来自甜辣椒的病原体诱导型的cDNA编码的假定酰基辅酶A合成酶(Lee et al.，2001 )。除此以外，Comp66462 和 Comp79520 能够与辣椒 ACSl (GenBank:EU616571)匹配，Compl67_c0, Comp 167_Cl和Comp46218能够与辣椒ACS2 (GenBank:EU616572)匹配。ACSl和ACS2是两种酰基辅酶A合成酶从质体中转运脂肪酸的候选物(Mazourek et al.，2009)。
[0005]在本发明中， 申请人:提供的ACSl是一种中/长链酰基辅酶A合成酶，可以将反式-8-甲基-6-壬烯酸转化到相关8-甲基壬烯基辅酶A上，是一种辣椒素生物合成途径中关键的中间产物。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种酰基辅酶A合成酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]本发明还提供了一种含有酰基辅酶A合成酶基因工程菌的构建方法，包含如下步骤:
[0008](I)利用ACSl-sumo-F和ACSl-sumo-R引物扩增印度鬼椒绿色果实的ACSl基因；
[0009](2)将步骤(1)所得基因PCR扩增并纯化后，连接到线性化的pETite N-His SUMOKan表达载体上,得到重组质粒；
[0010](3)将步骤(2)所得的重组质粒,转化至大肠杆菌H1-controllOG细胞中，得到基因工程菌。
[0011]本发明还提供了一种发酵生产酰基辅酶A合成酶的方法，是将酰基辅酶A合成酶在微生物中表达，收集发酵产物中的酰基辅酶A合成酶。
[0012]进一步，本发明提供的生产酰基辅酶A合成酶的方法，包含如下步骤:
[0013](I)利用ACSl-sumo-F和ACSl-sumo-R引物扩增印度鬼椒绿色果实的ACSl基因；
[0014](2)将步骤(1)所得基因PCR扩增并纯化后，连接到线性化的pETite N-His SUMOKan表达载体上,得到重组质粒；
[0015](3)将步骤(2)所得的重组质粒,转化至大肠杆菌H1-controllOG细胞中，得到基因工程菌；
[0016](4)利用步骤(3)所得的基因工程菌发酵生产酰基辅酶A合成酶。
[0017]本发明还提供了一种酰基辅酶A合成酶的应用，其特征在于，是将酰基辅酶A合成酶在微生物中表达，收集发酵产物中的酰基辅酶A合成酶，使底物转化为酰基辅酶A。
[0018]所述底物为中长链脂肪酸。
[0019]所述底物为反式8-甲基-6-壬烯酸或8-甲基壬酸。
[0020]本发明提供了一种新的酰基辅酶A合成酶，可为辣椒素合成酶提供底物。所述新酶也可在生物燃料工业中用于制备中等链长的脂肪酸衍生物。
[0021]ACSl 一个重要性在于，通过转基因技术可使其具有潜在的调节植物中辣椒素水平的作用。通过ACSl的过度表达实现提高辣椒植物中辣椒素含量水平。通过敲除或敲低ACSl基因，降低辣椒植物的辣椒素含量水平。
[0022]天然辣椒中除积累辣椒素，二氢辣椒素外，还生产其它许多不同侧链长度的辣椒素类似物(7-11个碳原子)。ACSl可以为辣椒素合成酶(CS)提供不同链长的酰基辅酶A，从而控制辣椒素类似物的结构。在当今的生物燃料工业中，中链酰基辅酶A合成酶有广泛的应用。因此，ACSl具有在生物燃料工业中应用的前景。
[0023]所述酰基辅酶A合成酶基因可以通过细菌或酵母的细胞体系表达。所述ACS基因可以来自鬼椒ACSl、拟南芥的LCAS4和LCAS5基因，或其他来源。
[0024]本发明有益效果:本发明所提供的酰基辅酶A合成酶对中链脂肪酸有活性可用于生物柴油领域，是迄今为止所发现的第一个对反式8-甲基-6-壬烯酸或8-甲基壬酸有活性的酶，可为克隆辣椒素合成酶基因提供直接底物。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1 为 His-SUMO-ACSl 在 BL21 (DE3)细胞中表达的 SDS-PAGE 图；
[0026](0,20分别代表1PTG诱导前和诱导20小时后的总蛋白；C为IPTG诱导20小时后可溶性粗蛋白提取物；E1-E4为N1-NTA柱的分离组分)。
[0027]图2为ACSl对不同羧酸的活性；[0028](C2，乙酸；C4, 丁酸；C6,己酸；C8,辛酸；C10,羊蜡酸；C12,月桂酸；C14,豆蘧酸；C16，棕榈酸；C18，硬脂酸)。
[0029]图3为反式8-甲基-6-壬烯酸或8-甲基壬酸作为底物的酶反应产物的HPLC谱图。
[0030]图4为阴离子模式下对纯化后的反式8-甲基-6壬烯基辅酶A的MS/MS分析。
[0031]图5为阴离子模式下对纯化后的8-甲基壬基辅酶A的MS/MS分析。
[0032]图6为-不同pH缓冲液对ACSl活性的影响；
[0033](- -:Acetate ；- -:Phosphate -:Tris ;_X_:Glycine)0【具体实施方式】
[0034]本发明公开了一种酰基辅酶A合成酶及其应用，具体实施方案包括构建含有酰基辅酶A合成酶的基因工程菌，微生物体系中酰基辅酶A合成酶的表达，以及在反应体系中加入酶作用底物，利用重组蛋白将底物转化为酰基辅酶A。
[0035]底物为中/长链羧酸，其中长链羧酸一般为含有16或18个碳原子的羧酸，中等链则为含有10或12个碳原子的羧酸。
[0036]实施例1印度鬼椒ACSl基因工程菌的构建与表达
[0037]利用ACSl-sumo-F和ACSl-sumo-R引物扩增印度鬼椒绿色果实的cDNA的ACSl基因，上述两个引物的序列分别为:CGC GAA CAG ATT GGA GGT GCAACAGATAAAITTATTATTG和GTG GCG GCC GCT CTA TTA TCACTTGGTACCCTTGTACAT。PCR 扩增产物用 1% 的琼脂糖凝胶纯化，并与线性化的pETite N-His SUMO Kan表达载体混合(Lucigen, Middleton, WI )。通过热冲击方法将DNA混合物转化至大肠杆菌H1-controllOG细胞中(Lucigen)。对插入后的基因进行测序，保证其序列正确。其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。将pETiet N-HisSUMO-鬼椒 ACSI 基因转化至 H1-ControI BL21(DE31)细胞(1^(^8611)中，把8-5.0-4051 的表达使用0.5mM的IPTG在16°C下，诱导20小时。混合蛋白质通过N1-NTA柱进行纯化(见图1)。ACSl 的分子量约为 73.5KDa,His-SUMO tag 的约为 12KDa。His-SUMO-鬼椒的 ACSl混合蛋白质在SDS-PAGE中的迁移接近预测(85KDa，见图1)。
[0038]实施例2ACS1活性测定
[0039]利用HPLC测定鬼椒ACSl的活性(Chen et al.，2011)。具体为，反应混合体系(400yL)包括 0.1M 的 Tris-HCl，pH7.5，2mM 的 DTT，5mM ATP, IOmM MgC12, 0.5mM CoA，0.1%的三硝基甲苯和200 μ M羧酸。反应通过添加20 μ L的纯化酶开始，反应30分钟后添加20 μ L 乙酸终止反应。HPLC 使用 Dioncx-UkiMatc1<:.3000LC 系统(Thermo Scientific),采
用 Acclaim? 120C18 反相色谱柱(Thermo Scientific ；3 μ , 120A, 150x3mm)。移动相的组成
有溶剂A (0.1%的三氟乙酸)和溶剂B (乙腈)。梯度洗脱的程序如下:0到5分钟，5%溶剂B ；5到9分钟，溶剂B浓度从5%到80%线性增加；9到11分钟，溶剂B浓度80% ;11到12分钟，溶剂B浓度5%。流速为0.6mL/min。二极管阵列检测器的检测范围为200到400nm。底物和产物的定性定量通过计算257nm下谱峰的面积获得。结果显示:ACS1酶当以8-甲基壬酸为底物时的Km值为0.57mM，Vmax值为0.14 μ mol/min/mg; ACSl酶当以(6E)_8_甲基-6-壬烯酸为底物时的Km值为0.49mM, Vmax值为0.1214 μ mol/min/mg。
[0040]实施例3ACS作用底物的选择[0041]在酶反应体系中分别添加5mM乙酸、丁酸、己酸、辛酸、羊蜡酸、月桂酸、豆蘧酸、棕榈酸和硬脂酸。
[0042]如图2所示，在不同底物中，印度鬼椒ACSl最高活性是羊蜡酸。相反地，ACSl对乙酸和丁酸没有任何活性。
[0043]实施例4酰基辅酶A的生产
[0044]利用辣椒素生物合成途径中内生的中间产物反式-8-甲基-6壬酸(6E)和8_甲基壬酸(8M)，作为底物，生产酰基辅酶A。
[0045]如图3所示，ACSl在以上述两物质为底物的测量中，对6E的活性较高。收集了相应的HPLC分离峰，利用SpeedVac集中器干燥后，用MS/MS做进一步分析。
[0046]每个干燥样品使用40 μ L甲醇:水:乙腈比例为1: 1:2的缓冲溶液。用TriVersa Nanomatcli (Advion, Ithaca, NY)直接注入 10 μ L。质谱仪(LTQ-QrbitrapVelo (Thermo Fisher Scientif ic, Waltham, MA))采用阴离子模式进行。质量扫描的范围是300-2000m/zo分辨率设为60000@400m/z。CID破碎采用MS/MS，检测采用分离窗口 1.5m/z的分离阱。破碎用归一化碰撞能量的35%。如图4和图5所示，质谱数据与反式-8-甲基-6-壬烯基辅酶A和8-甲基壬基辅酶A的分子量相吻合。
[0047]实施例5酰基辅酶A合成酶的pH稳定性
[0048]采用乙酸盐，磷酸盐，Tris和甘氨酸/NaOH缓冲溶液，调节pH4.0至10.5，测定生产的酰基辅酶A合成酶的p H稳定性。结果如图6所示，ACSl的最适pH为9.5。
【权利要求】
1.一种酰基辅酶A合成酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种含有权利要求1所述酰基辅酶A合成酶基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下: (1)利用ACSl-sumo-F和ACSl_sumo-R引物扩增印度鬼椒绿色果实的ACSl基因； (2)将步骤(1)所得基因PCR扩增并纯化后，连接到线性化的pETiteN-His SUMO Kan表达载体上，得到重组质粒； (3)将步骤(2)所得的重组质粒，转化至大肠杆菌H1-controllOG细胞中，得到基因工程菌。
3.—种权利要求1所述酰基辅酶A合成酶的生产方法，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的酰基辅酶A合成酶在微生物中表达，收集发酵产物中的酰基辅酶A合成酶。
4.权利要求3所述方法，其特征在于，步骤如下: (1)利用ACSl-sumo-F和ACSl_sumo-R引物扩增印度鬼椒绿色果实的ACSl基因； (2)将步骤(1)所得基因PCR扩增并纯化后，连接到线性化的pETiteN-His SUMO Kan表达载体上，得到重组质粒； (3)将步骤(2)所得的重组质粒，转化至大肠杆菌H1-controllOG细胞中，得到基因工程菌； (4)利用步骤(3)所得的基因工程菌发酵生产酰基辅酶A合成酶。
5.权利要求1所述酰基辅酶A合成酶的应用，其特征在于，是将酰基辅酶A合成酶在微生物中表达，收集发酵产物中的酰基辅酶A合成酶，使底物转化为酰基辅酶A。
6.权利要求5所述方法，其特征在于，所述底物为中长链脂肪酸。
7.权利要求5所述方法，其特征在于，所述底物为反式8-甲基-6-壬烯酸或8-甲基壬酸。
【文档编号】C12N15/70GK103725652SQ201310728420
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】陈辉, 王泓雪, 余晓丹 申请人:无锡新和源发酵技术研究院有限公司