蛋白磷酸酶PPM1L在制备用于预防或治疗心肌梗死的药物中的用途的制作方法

本发明属于生物医学领域，涉及一种蛋白磷酸酶ppm1l，具体来说是一种蛋白磷酸酶ppm1l的用途。

背景技术

心肌梗死(myocardialinfarction，mi)即急性冠脉闭塞(acutecoronaryocclusion)，会导致心肌细胞缺血坏死【atturer.等,amjcardiol.2010；106:360-368.】。坏死的心肌细胞会触发早期炎症反应，反应细胞包括白细胞和内皮细胞，它们通过表达黏附分子、趋化因子和炎性细胞因子来进一步募集炎性细胞、调节炎症反应【liaudetl.等,frontbiosci(scholed).2013；5:86-104.】。这种炎症反应是由坏死心肌细胞释放的内源性物质激活天然免疫应答而触发，是心脏应对急性损伤的一种有效的适应性反应，对于心肌梗死后损伤的修复以及心肌功能重建均有重要意义【liaudetl.等,frontbiosci(scholed).2013；5:86-104.arslanf.等,natrevcardiol.2011；8:292-300.sfrantz.等,cardiovascres.2009；81:474-481.】。

心肌梗死后炎症反应的强度对于心肌梗死的结局有关键性影响【liaudetl.等,frontbiosci(scholed).2013；5:86-104.arslanf.等,natrevcardiol.2011；8:292-300.】。强度过强或者过弱的炎症反应对心肌梗死后心脏重构都有不利影响。过度的炎症反应会加剧细胞外基质降解，导致心脏破裂；持续的炎症反应会减少胶原沉积，导致形成瘢痕的张力强度减弱，从而增加心室扩张；过度表达的炎症介质也会活化凋亡信号通路，导致心肌细胞凋亡而数量减少；相反，过弱的炎症反应会导致炎症蔓延至非梗死心肌组织，从而造成心肌纤维化和心肌舒张功能减弱【frangogiannisng.circres.2012；110:159-173.】。总之，心肌梗死后炎症反应的失调会导致心肌梗死面积持续性增加，心肌细胞纤维化以及反应性心肌肥大和心室扩张，统称为不良心脏重构(adversecardiacremodeling)，结局就是功能性心衰^[2,5]【liaudetl.等,frontbiosci(scholed).2013；5:86-104.frangogiannisng.circres.2012；110:159-173.】。因此心肌梗死后炎症反应受到严格的调控，然而，目前对于其分子调控机制尚不是很清楚。

天然免疫系统的活化是触发心肌梗死后炎症反应的主要原因。内源性的危险信号会被天然免疫应答系统在第一时间迅速捕捉，进而激活非特异性的炎症反应。天然免疫系统的活化有着敏锐的“感受器”，称之为模式识别受体(patternrecognitionreceptors,prrs)，包括toll样受体(toll-likereceptors，tlrs)和nod样受体(nod-likereceptors)，正是它们负责识别危险信号、活化下游炎症信号通路【lao'neill.等,natrevimmunol.2007；7:353-364.kschroder.等,cell.2010；140:821-832.】。

心肌梗死所产生的坏死心肌细胞以及细胞外基质会释放多种内源性危险信号分子，包括hmgb1(theproteinhighmobilitygroupbox-1)【mandrassy.等,circulation.2008；117:3216-3226.】、热休克蛋白(heatshockproteins，hsps)【yli.等,jbiolchem.2011；286:31308-31319.nzou.等,amjphysiolheartcircphysiol.2008；294:h2805-2813.】以及细胞自身核酸、核糖核蛋白【farslan.等,natrevcardiol.2011；8:292-300.qzhang.等,nature.2010；464:104-107.】等。这些内源性危险分子又称为损伤相关模式分子(damage-associatedmolecularpatterns，damps)，可以被免疫细胞以及内皮细胞表达的模式识别受体识别^[11]【farslan.等,natrevcardiol.2011；8:292-300.】，进而激活胞内nf-κb、mapks信号通路和炎性复合体(inflammasome)形成，从而活化炎性细胞因子、趋化因子、生长因子以及黏附分子的表达，募集炎性细胞到损伤局部，清除损伤组织和死亡细胞，促进血管生成和纤维细胞增殖，最终促进瘢痕形成和心脏重构。随着损伤组织和死亡细胞被逐步吞噬清除，一些炎症抑制介质释放，导致炎症反应终止【liaudetl.等,frontbiosci(scholed).2013；5:86-104.arslanf.等,natrevcardiol.2011；8:292-300.rgill.等,freeradicbiolmed.2010；48:1121-1132.】。

tlr信号通路受到严格的调控，多种调控机制参与tlr触发的天然免疫应答的调控【xingguangliu,等,natimmunol；2011；12(5):416-24.jimmunol；2010；185:7244-7251】。其中，信号蛋白的磷酸化过程在tlr信号转导途径中至关重要，因为它能够对信号蛋白的活性和功能进行调控，而磷酸酶即是这些信号转导途径中控制信号蛋白磷酸化水平所必需的【o’neillla.immunity.2008；29:12-20.】。已有文献报道酪氨酸磷酸酶shp-1(srchomologyphosphatase-1)可以通过直接调控nf-κb以及mapks的磷酸化水平而抑制tlr触发的炎性细胞因子的产生，还可以通过抑制irak-1(interleukin-1receptorassociatedkinase-1)的活化而抑制tlr触发的炎性细胞因子的产生【anh,houj.等,natimmunol.2008；9:542-550.】；shp-2(sh2-containingproteintyrosinephosphatase2)可以通过抑制trif途径中tbk1(tank-bindingkinase1)的活化，抑制细胞因子产生【anh.等,immunity.2006；25:919-928.】。

ppm1l，又称pp2cε，其包含pp2cc(serine/threoninephosphatases,family2c,catalyticdomain)功能域，是一种属于pp2c亚家族的丝/苏氨酸磷酸酶。小鼠ppm1l编码360个氨基酸，在小鼠组织中广泛表达【limg.等,jbiolchem.2003；278:12013-12021.】。到目前为止，ppm1l在炎症中的调控作用知之甚少，并且其在心肌梗死后炎症中的调控功能仍未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种蛋白磷酸酶ppm1l的用途，所述的这种蛋白磷酸酶ppm1l的用途要解决现有技术中的药物预防和治疗心肌梗死的效果不佳的技术问题。

本发明提供了蛋白磷酸酶ppm1l在制备用于预防或治疗心肌梗死的药物中的用途。

进一步的，所述心肌梗死的表现因素为心肌梗死后炎症因子的过量产生、心室壁破裂或者心脏功能衰竭。

进一步的，所述心肌梗死是由冠状动脉闭塞引起的。

进一步的，所述炎症因子选自tnfα、il-1、il-6或者il-12。

进一步的，所述蛋白磷酸酶ppm1l选自

(a)seqidno：2的氨基酸序列；

(b)与seqidno：2氨基酸序列同源，其具有抑制损伤相关模式分子(damp)诱发相关疾病和/或症状活性的蛋白；

(c)(a)或(b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有预防或治疗心肌梗死相关疾病和/或症状活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质或多肽。

进一步的，所述蛋白磷酸酶ppm1l的编码基因选自:

(i)seqidno：1的序列；或

(ii)在严格条件下与(i)限定的序列杂交且具有预防或治疗心肌梗死相关疾病和/或症状的分子。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含：

(a)治疗有效量的蛋白磷酸酶ppm1l或者编码序列；以及

(b)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。

进一步的，所述药物组合物中蛋白磷酸酶ppm1l及其编码序列占药物组合物总重量的0.001～99.9wt％。

进一步的，所述药物组合物中蛋白磷酸酶ppm1l及其编码序列占药物组合物总重量的1～95wt％，优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。

本发明提供了蛋白磷酸酶ppm1l蛋白或其编码序列在有效抵抗心肌梗死、抑制炎性因子产生中的新用途。

本发明的蛋白磷酸酶ppm1l在心肌梗死早期心梗边缘区心肌组织中表达显著降低；此外，本发明的蛋白磷酸酶ppm1l能抑制心肌梗死早期的炎症反应，从而发挥抗炎、提高心功能及降低心肌损伤的作用。本发明的蛋白磷酸酶ppm1l可用于制备抑制心肌梗死早期炎症以及病程发展的药物。

我们通过在小鼠心肌梗死模型中研究ppm1l对心肌梗死后炎症反应的调控作用，实验结果显示，结扎小鼠心脏左冠状动脉构建心肌梗死模型，其心肌组织缺血/梗死区的ppm1lmrna表达较未缺血/梗死区组织以及假手术对照小鼠心肌组织显著降低；同时，ppm1l过表达显著抑制心肌梗死诱导的心肌组织中炎症因子的表达；ppm1l转基因小鼠巨噬细胞对tlr内源性配体hmgb1诱导的炎性细胞因子产生较对照小鼠显著降低；ppm1l转基因小鼠心梗后的心功能较野生型小鼠显著改善，心肌缺血损伤坏死显著减少。

本发明人通过大量的研究和动物模型试验，发现ppm1l在心肌梗死中，能有效抑制心肌梗死后所导致的炎性因子的产生、改善心脏功能状态、提高生存率。在此基础上本发明人完成了本发明。

具体而言，针对炎症相关基因进行应用研究是炎症分子生物学和细胞生物学研究的热点，将炎症抑制基因的核苷酸和蛋白质应用于炎症的预防和治疗是人工干预心肌梗死的有效技术，因此无论是在功能基因组研究，还是炎症相关地基因治疗方面均具有广阔地应用前景。

发明人通过研究发现：稳定过表达ppm1l则能使炎性因子的产生减少。在结扎前降支诱导的小鼠心肌梗死模型中，观察到过表达的ppm1l能显著降低结扎后心肌梗死面积以及血清及组织中炎症因子的表达，减轻心肌损伤，保护心功能，提示ppm1l可能具备治疗心肌梗死等疾病的应用前景。由此，本发明提供了将ppm1l分子应用于心肌梗死性疾病的预防和治疗中的方法和策略

本发明针对具有抗炎作用的抗炎分子ppm1l，对免疫细胞中巨噬细胞在内源性危险因子作用下的炎症因子的产生进行了研究，并且验证了应用该分子的序列对心肌梗死动物的治疗和保护作用。实验证明1)小鼠心肌梗死后心肌组织中ppm1l表达显著降低；2)在ppm1l转基因小鼠中过表达的ppm1l显著抑制组织炎症因子的产生；3)ppm1l转基因小鼠来源的腹腔巨噬细胞中过表达的ppm1l显著抑制damps诱导的炎症因子产生；4)ppm1l转基因小鼠心梗后的心功能较野生型小鼠显著改善，心肌缺血损伤坏死显著减少。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的抗炎分子蛋白磷酸酶ppm1l可以应用于心肌缺血导致的心肌梗死、心衰的预防和治疗。本发明证实了蛋白磷酸酶ppm1l在体内、体外均能够抑制心肌梗死及相关因素造成的炎症增加，发挥心肌梗死早期抗炎作用，保护心功能，提高心肌梗死后机体的存活率，保护心脏在心肌梗死后免于炎症损伤。

附图说明

图1：小鼠心肌梗死后心肌组织中ppm1l的表达情况(结果显示为平均值±标准差，n≥3；*，p＜0.05；**，p＜0.01)

图2：ppm1l转基因小鼠及野生型小鼠心肌梗死后心肌组织中炎症因子mrna水平的表达情况(结果显示为平均值±标准差，n≥3；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001)

图3：damps诱导的ppm1l转基因小鼠及野生型小鼠来源的巨噬细胞炎症因子蛋白水平的变化(结果显示为平均值±标准差，n≥3；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001)

图4：ppm1l转基因小鼠和野生型小鼠心肌梗死后心功能变化及梗死面积和对比情况(结果显示为平均值±标准差，n≥3；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***,p＜0.001)

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：小鼠心肌梗死后心肌组织中ppm1l的表达下调

小鼠(c57品系，雄性，8-10周龄，上海西普尔-必凯实验动物有限公司购买)按照文献报道方法建立心肌梗死模型【tarnavski,o.等，physiolgenomics.2004；16；349-360】，假手术组小鼠在建立心肌梗死模型时只穿线不结扎前降支。分别在心肌梗死后1天、3天、5天、7天、14天取小鼠心梗边缘区和正常区心肌组织。

采用实时定量反转录pcr(qrt-pcr)方法对心梗边缘区心肌组织中ppm1l的表达进行了分析。组织总rna使用trizol(invitrogen公司)抽提。qrt-pcr使用sybrgreenrt-pcr试剂盒(toyobo公司)并在abi7900(appliedbiosystems公司)实时定量pcr仪上完成。

ppm1l定量pcr引物为：5’-cgcggatccgatgatagaggatacaatgactttgc-3’(上游)5’-cggggtaccgagtgctcttctgttttgctacta-3’(下游)

内参gapdh定量pcr引物为5’-aggtcggtgtgaacggatttg-3’(上游)和5’-tgtagaccatgtagttgaggtca-3’(下游)。

mrna的相对定量使用2-δδct法计算(gapdh为内参)【livak，kj.等，analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe2-δδctmethod.methods.2001；25：402-408】。

小鼠梗死后心梗边缘区和正常区心肌组织中ppm1l的表达情况如图1所示。结果显示：小鼠梗死后心梗边缘区和正常区心肌组织中ppm1l的表达在1天、3天、5天时显著降低，且随时间推移逐步恢复至初始水平。

实施例2：ppm1l过表达抑制小鼠心梗边缘区心肌组织中的炎性细胞因子的产生

构建ppm1l转基因小鼠(委托华东师范大学构建)，使其过表达ppm1l基因。ppm1l转基因小鼠构建心肌梗死模型，假手术组小鼠在建立心肌梗死模型时只穿线不结扎前降支。分别在心肌梗死后1天、3天取小鼠心梗边缘区和正常区心肌组织。

采用实时定量反转录pcr(qrt-pcr)方法对心梗边缘区心肌组织中ppm1l的表达进行了分析。组织总rna使用trizol(invitrogen公司)抽提。qrt-pcr使用sybrgreenrt-pcr试剂盒(toyobo公司)并在abi7900(appliedbiosystems公司)实时定量pcr仪上完成。

il-1β定量pcr引物为：5’-ggtgtgtgacgttcccattagac-3’(上游)5’-catggagaatatcacttgttggttga-3’(下游)

il-6定量pcr引物为：5’-tagtccttcctaccccaatttcc-3’(上游)5’-ttggtccttagccactccttc-3’(下游)

tnf-α定量pcr引物为：5’-aagcctgtagcccacgtcgta-3’(上游)5’-ggcaccactagttggttgtctttg-3’(下游)

il-12b定量pcr引物为：5’-accctgaccatccaagtcaaa-3’(上游)5’-ttggcctcgcatcttagaaag-3’(下游)

结果如图2所示：ppm1l转基因心梗小鼠边缘区心肌组织中炎症因子的水平较野生型小鼠显著降低。该结果说明：ppm1l转基因可以抑制心梗后心肌组织中炎症因子产生。

实施例3：ppm1l转基因小鼠来源的腹腔巨噬细胞中过表达的ppm1l显著抑制damps诱导的炎症因子产生

野生型和ppm1l转基因小鼠腹腔内分别注射2ml肉汤(购自sigma)，2天后以无血清rpmi1640(购自corning公司)冲洗腹腔获得巨噬细胞。然后用0.1mg/ml重组小鼠hmgb1或hsp60刺激细胞0、3、6小时后，收集细胞上清做elisa(购自r&d公司)分析。

ppm1l转基因对小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子产生的影响试验结果如图3所示。结果显示：ppm1l转基因小鼠腹腔巨噬细胞在受到damps刺激后表达的炎症因子的蛋白水平明显下降。该结果表明：ppm1l转基因可以抑制小鼠来源的腹腔巨噬细胞炎症因子的产生。

实施例4：ppm1l过表达可显著改善小鼠心梗后心功能并降低心肌梗死面积

ppm1l转基因小鼠构建心肌梗死模型，假手术组小鼠在建立心肌梗死模型时只穿线不结扎前降支。

通过小动物超声(vevo2100,visualsonics)分别在心肌梗死后3天、7天、14天检测小鼠心功能值。另外在心梗一周时取转基因及野生型心脏，并进行ttc染色作心肌梗死面积检测。

心功能及ttc染色结果如图4a及4b所示：心肌梗死后，ppm1l转基因小鼠心功能明显好于野生型小鼠，并且ppm1l转基因小鼠心梗面积显著小于野生型小鼠。该结果表明：ppm1l过表达可显著改善心梗后心功能，并降低心肌梗死面积。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海市东方医院

<120>蛋白磷酸酶ppm1l在制备用于预防或治疗心肌梗死的药物中的用

<141>2018-09-19

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>10945

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>1

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