桂皮醛在制备抗应激剂中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及天然活性成分桂皮醛在制备抗应激剂中的应用，所述抗应激剂可用于预防和治疗应激引起的行为学异常、肾脏损害、生殖损害以及代际遗传子代行为学异常风险。

背景技术

桂皮醛(cinnamaldehyde，cas号104-55-2)，是一种天然活性成分，来源于天然药材和调料如肉桂、桂枝等。

现代社会压力巨大，长期社会、心理、环境应激引发一系列亚健康状态和疾病(nagaraja,a.s.,etal.snapshot:stressanddisease.cellmetabolism2016；23(2):388)。下丘脑-垂体-肾上腺轴过度激活导致高水平糖皮质激素是应激引起机体系列病理改变的重要原因(martocchia,a.,etal.targetsofanti-glucocorticoidtherapyforstress-relateddiseases.recentpatcnsdrugdiscov2013；8(1):79-87)。应激水平糖皮质激素诱发行为学异常(chen,j.,etal.effectsofchronicmildstressonbehavioralandneurobiologicalparameters-roleofglucocorticoid.hormbehav2016；78:150-9；mcewen,b.s.glucocorticoids,depression,andmooddisorders:structuralremodelinginthebrain.metabolism2005；54:20-3)、肾脏功能和组织学损害(mcdonald,a.t.,etal.glucocorticoid-inducedpolycystickidneydisease-athresholdtrait.kidneyint1990；37(3):901-8；smets,p.,etal.cushing'ssyndrome,glucocorticoidsandthekidney.gencompendocrinol2010；169(1):1-10)、生殖异常(chen,y.,etal.stressinducesglucocorticoid-mediatedapoptosisofratleydigcellsinvivo.stress2012；15(1):74-84；whirledge,s.andcidlowskij.a.glucocorticoidsandreproduction:trafficcontrolontheroadtoreproduction.trendsendocrinolmetab2017；28(6):399-415)甚至以代际遗传模式影响子代行为(short,a.k.,etal.elevatedpaternalglucocorticoidexposurealtersthesmallnoncodingrnaprofileinspermandmodifiesanxietyanddepressivephenotypesintheoffspring.translpsychiatry2016；6(6):e837；redfern,j.c.,etal.effectsofmaternalcortisoltreatmentonoffspringsize,responsestostress,andanxiety-relatedbehaviorinwildlargemouthbass(micropterussalmoides).physiolbehav2017；180:15-24)。

针对上述应激引发的健康问题，亟待开发安全有效的抗应激剂(anti-stressagentgarabadu,d.,etal.eugenolasananti-stressagent:modulationofhypothalamic-pituitary-adrenalaxisandbrainmonoaminergicsystemsinaratmodelofstress.stress2011；14(2):145-55)，包括从预防保护的角度开发可被利用在食品和保健品中的抗应激剂。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种桂皮醛在制备抗应激剂中的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种桂皮醛在制备抗应激剂中的应用。

其中，所述抗应激剂为可预防和治疗应激引起的行为学异常、应激引起的肾脏损害、应激引起的生殖损害、应激引起代际遗传子代行为学异常风险的抗应激剂。

作为优选，所述抗应激剂利用桂皮醛配以辅料制成针对抗应激的剂型。

进一步地，所述辅料为赋形剂、助溶剂或者控释剂。

其中，所述剂型为口服液、注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂或者微囊剂。

进一步地，所述桂皮醛应用在制备应激引起的行为学异常、肾脏损害、生殖损害以及代际遗传子代行为学异常风险的预防剂或治疗剂。

本发明以桂皮醛为主料，配以药用辅料(赋形剂、助溶剂、控释剂等)，用常规的制剂方法制成常规的剂型(包括口服液、注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、微囊剂等)，制备用于应激引起的行为学异常、肾脏损害、生殖损害以及代际遗传子代行为学异常风险的预防剂或治疗剂(保健品或药物)。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明提供了活性作用确切的桂皮醛制备的抗应激剂，用于预防和治疗应激引起的行为学异常、肾脏损害、生殖损害以及代际遗传子代行为学异常风险。本发明：1、活性成分明确(桂皮醛)；2、调控目标明确(应激引起的行为学异常、肾脏损害、生殖损害以及代际遗传子代行为学异常风险)；3、调节作用明确(确切的预防和治疗作用)。

本发明在应激高水平糖皮质激素处理动物模型上科学地评价并证明了桂皮醛对模型动物行为学异常、肾脏损害、生殖损害以及代际遗传子代行为学异常风险的保护和治疗作用。

本发明所涉及的桂皮醛对正常对照动物存活率、肝肾功能指标以及组织结构无明显影响，具有很好的安全性。

附图说明

图1为桂皮醛对皮质酮模型小鼠行为学异常的保护和改善作用示意图(结果用均值±标准误表示。#p<0.05，##p<0.01，####p<0.0001与正常对照组比较；*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001，与模型对照组比较)；

图2为桂皮醛对皮质酮模型小鼠肾功能损害的保护和改善作用示意图(结果用均值±标准误表示。#p<0.05，##p<0.01与正常对照组比较；*p<0.05与模型对照组比较。)；

图3为桂皮醛对皮质酮模型小鼠肾组织结构损害的保护和改善作用示意图；(比例尺＝50μm)

图4为桂皮醛对皮质酮模型父代小鼠睾丸组织结构损害的保护和改善作用示意图((a)正常对照组；(b)模型对照组；(c)氟西汀组；(d)桂皮醛低剂量组；(e)桂皮醛中剂量组；(f)桂皮醛高剂量组)；

图5为桂皮醛给药对皮质酮模型小鼠子代强迫游泳试验行为学异常的保护和改善作用示意图(结果用均值±标准误表示。*p<0.05与正常对照组子代比较；#p<0.05与模型对照组比较)。

具体实施方式

实施例1

桂皮醛对皮质酮模型小鼠行为学异常以及肾脏损害的保护改善作用。

实验动物：c57bl6/j小鼠(体重18-22g，6周龄)，200-220克，雄性。

药物配制：桂皮醛超声分散于生理盐水中，灌胃给药，给药剂量为桂皮醛10、20、40mg/kg，氟西汀15mg/kg。

实验仪器：冷冻离心机，组织切片机，酶标仪，光学显微镜，透射电子显微镜等。

实验方法：

1、模型建立：动物适应环境1周后，随机分成模型组和正常组，模型组皮下注射20mg/kg皮质酮(生理盐水内含0.1％(v/v)的dmso和0.1％(v/v)的tween-80)造模，持续4周。

2、造模同时设立桂皮醛给药组，每天灌胃给予桂皮醛(10、20、40mg/kg)，持续4周。

3、行为学评价

糖水偏好试验：评价动物快感缺失行为。动物分单笼饲养，给予1％蔗糖水两瓶24h使其适应糖水后，将其中1瓶糖水换成普通水，给予24h，间隔12h换位减少位置偏好引起的误差。断水断粮24h后，给予1％(g/ml)蔗糖水和普通水各一瓶(约200ml)24h，分别称重，间隔12h换位。结束后取出两瓶水称重。实验完毕正常给予动物正常水粮，休息48h。

开场试验：评价动物焦虑行为。架设开场设备，调试各通道明场灯光强度、摄像画面清晰度、软件跟踪识别参数等项目，设置中央和四周区域。将动物放置于中央区域，计时10min，软件录像记录和分析其行动轨迹图、总路程、各区域路程及停留时间。实验过程中及时清理粪便和尿液以减少气味交叉干扰，实验完毕后取出动物休息24h。

强迫游泳和悬尾试验：评价动物绝望行为。实验前一天进行游泳训练，将动物放入深15-20cm的25±2℃水中预游泳15min，取出动物擦干并放回预热过的笼中。实验当天架设强迫游泳设备，调试摄像机高度、摄像画面清晰度、软件识别参数等项目。将小鼠置于25±2℃深15-20cm的水中游泳5min，利用软件进行录像和数据统计，每只动物游泳完毕后换水以减少交叉干扰。实验结束将动物取出擦干，放回预热过的笼中，休息24h。架设悬尾设备，调试摄像机高度、摄像画面清晰度、软件识别参数等项目。在距小鼠尾巴末端约1/3处粘上胶带，悬挂于仪器上5min，利用软件进行录像和数据统计。实验结束后取下动物，休息24h。

4、代谢笼收集尿液、眼眶采集血液样本，用于检测血肌酐、血尿素氮和尿白蛋白与尿肌酐。

5、动物处死后于冰台上分离肾脏皮质组织，经甲醛固定，常规切片he染色，镜检观察肾脏组织学改变。

实验结果：

如图1所示，模型组动物对糖水偏好性显著低于正常组，而桂皮醛给药组动物糖水偏好性得到改善，其中桂皮醛中剂量组和高剂量组的糖水偏好性与模型对照组比较显著回升。桂皮醛呈剂量依赖趋势地改善皮质酮模型动物的快感缺失症状，优于阳性药氟西汀。

开场实验模型组动物的中央区停留时间显著低于正常组，而桂皮醛给药组的中央区停留时间高于模型对照组，其中桂皮醛中剂量组和高剂量组的中央区停留时间显著高于模型对照组并接近正常组。桂皮醛可有效改善皮质酮模型动物的焦虑行为，优于阳性药氟西汀。

强迫游泳实验和悬尾实验中模型对照组动物不动时间显著高于正常组，而桂皮醛和氟西汀给药组不动时间均有所降低。桂皮醛可有效改善皮质酮模型动物的绝望行为。

如图2显示，模型对照组动物血清肌酐合尿素氮水平显著高于正常组、尿液肌酐水平显著低于正常组；而桂皮醛给药组动物血清肌酐和尿素氮水平降低、尿液肌酐水平升高。

如图3显示，肾脏组织学检测结果显示桂皮醛给药可显著改善模型动物肾皮质中肾小管上皮细胞轻度水肿现象。

上述肾功能指标和组织学检测结果表明，桂皮醛对于皮质酮模型小鼠肾脏功能和组织结构损害有明显的保护改善作用。

实施例2

桂皮醛对皮质酮模型小鼠生殖损害及子代行为学异常风险的保护改善作用。

实验动物：c57bl6/j小鼠，20-22克，雄性+雌性。

药物配制：桂皮醛超声分散于生理盐水中，用于灌胃给药，给药剂量为10,20,40mg/kg。

实验方法：

1、同实施例1建立皮质酮小鼠模型以及给药。

2、为研究桂皮醛对皮质酮模型小鼠生殖以及行为学代际遗传的影响，在父代各组选取了一定数量小鼠与正常雌性小鼠交配，记录子代出生情况并对子代开展行为学评价。

3、行为学评价实施例1

4、对参与繁殖的父代雄性小鼠睾丸和附睾取样，常规固定切片和he染色，镜检观察生殖系统的组织学改变。

实验结果：

如表1所示，分析雌鼠受孕率发现，皮质酮模型父代雄鼠受孕率均低于正常对照组，而桂皮醛高剂量组的受孕率较高，阳性药氟西汀组受孕率则为0。氟西汀组受孕率低的原因是氟西汀引起的5-羟色胺再摄取阻滞对生殖系统存在副作用，临床研究报道使用该药物的患者存在一定比例的性功能障碍。与之相反，桂皮醛可能对生殖系统副作用较低，在一定剂量下甚至存在保护和改善作用，这可能会成为桂皮醛相对于氟西汀的优势。

表1各组子代出生情况统计

如图4显示，与正常对照组比较，模型对照组父代雄性小鼠睾丸组织的曲细精管内生精细胞相对减少；氟西汀组父代雄性小鼠睾丸组织生精细胞显著减少，结构紊乱，异常圆形精子数量增加；而给予桂皮醛治疗的父代雄性小鼠睾丸上述组织结构病理变化得到显著改善，并且给予高剂量桂皮醛治疗的父代雄性小鼠睾丸组织曲细精管腔的面积显著增大，提示睾丸的生精功能增强。由此可见氟西汀对于睾丸组织有明显的损害作用，而桂皮醛对于睾丸组织的副作用较低，甚至在高剂量下可增强睾丸的生精功能。

如图5显示，皮质酮模型组成年子代在强迫游泳试验中的不动时间显著高于正常对照组成年子代，而桂皮醛给药的皮质酮模型组成年子代不动时间降低。根据以上结果可知，皮质酮造模引起的绝望行为在其子代成年期显示出一定的代际遗传效应；皮质酮模型父代小鼠给予桂皮醛对其成年子代的行为学异常具有保护和改善作用。

综上所述，桂皮醛制备的抗应激剂，可以用于预防和治疗应激引起的行为学异常、肾脏损害、生殖损害以及代际遗传子代行为学异常风险，并且桂皮醛对正常对照动物存活率、肝肾功能指标以及组织结构无明显影响，具有很好的安全性。

实施例3：

将桂皮醛按照药典2015版四部口服溶液剂常规制法，助溶剂选用聚乙二醇400，溶解、分装、灭菌，制备成桂皮醛含量为20mg/ml的抗应激口服液；

将桂皮醛按照药典2015版四部胶囊剂软胶囊常规制法，软胶囊材质选用明胶和山梨醇，制备成桂皮醛含量为20mg/粒的抗应激胶囊；

将桂皮醛按照药典2015版四部片剂常规制法，加入赋形剂环糊精，混合均匀、制粒、压片，制备成桂皮醛含量为20mg/片的抗应激片剂。