一种野扇花生物碱的应用的制作方法

本发明涉及一种野扇花生物碱的应用，特别是一种野扇花生物碱在癌症治疗药物中的应用。

背景技术：

根据世界卫生组织的最新实况报道，肿瘤即癌症是世界第二大死因（心血管疾病为第一大死因）。2015年因罹患癌症而死亡的案例高达880万，就全球范围而言，近六分之一的死亡是由癌症造成的。世界死亡率最高的癌症类型依次为：肺癌（2015年死亡人数接近169万）、肝癌（78.8万）、结肠直肠癌（77.4万）、胃癌（75.4万）及乳腺癌（57.1万）。其发病率和死亡率不仅与性别有关，发达地区和欠发达地区在此也表现出了明显的差异。在我国，肿瘤发病率逐年攀升，以每年10%的速度增长，每一分钟就有6人被诊断为恶性肿瘤，5人死于癌症。而且，值得关注的是我国癌症发病人数约占世界发病的五分之一；癌症死亡人数约占全球总数的四分之一。因此，对抗癌药物的深入研究具有十分重要的意义并成为国内外的一个研究热点。在恶性肿瘤的治疗中，药物治疗占有重要的地位。在合成化学类抗肿瘤药物中绝大多数都以天然抗肿瘤活性成分为先导化合物，以天然产物为来源的抗肿瘤药物具有活性显著、结构独特、作用机制不同于一般的小分子化学治疗药物的优势。据报道，临床使用的抗癌药物中超过60％来源于天然，包括植物、海洋生物、微生物。在2003年销售最好的20种抗肿瘤药物中，天然产物及其衍生物占37％，如紫杉醇，多西他赛，羟基喜树碱等，由此可见，天然产物是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化合物的重要来源。从药用植物中寻找新的具有选择性细胞毒活性单体化学成分成为研制新型抗肿瘤药物的重要途径。

野扇花属(srcococc)黄杨科(buxcee)植物，常绿灌木，本属约有20种，分布于亚洲南部及东部。在我国现知的有8种及几个变种分别为:羽脉野扇花(s.hookerinbill)、双蕊野扇花(变种)(s.hookerinvr.digyn)、野扇花(s.rucifoli)、柳叶野扇花(s.slign)、东方野扇花(s.orintlis)、长叶柄野扇花(s.longipotiolt)、长叶野扇花(s.longifoli)、云南野扇花(s.wllichii)、海南野扇花(s.vgns)、聚花野扇花(s.confertiflor)。贵州省主要产2种，野扇花和羽脉野扇花，且为贵州苗族民间习用草药，常混用，又名三两金、胃友，收录于《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003年版（db52/yc328-2003）。药用根、果。治胃痛、风寒湿痹、跌打损伤，每用根3～5钱，水煎服或研末，日服三次。治头晕、心悸、视力减退，每用果3～5钱，水煎服。结合该属植物在民间用药的传统，开展深入的化学成分和药理活性研究有利于充分挖掘该属植物药用价值，具有特别的现实意义。申请人经过大量的实验，成功从野扇花中分离出野扇花碱，并经过药理研究证实其对癌症具有治疗作用，且有望成为新的治疗癌症的药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种野扇花生物碱的应用。本发明拓展了新的野扇花生物碱的应用，对于野扇花生物碱的进一步应用开发和寻找新的癌症治疗药物具有重要意义。

本发明的技术方案：一种野扇花生物碱在癌症治疗药物中的应用；所述野扇花生物碱的分子式为c24h39no，结构式如图1所示。

前述的野扇花生物碱的应用，所述野扇花生物碱通过如下方法制备：将干燥的野扇花根茎粉碎成粗粉，用95%的甲醇超声提取3次，每次24小时，合并提取液，浓缩得浸膏，浸膏用1%的硫酸溶液溶解后用乙酸乙酯萃取得非生物碱部分，剩余的酸水层用饱和的碳酸钠溶液调节ph到9，再用二氯甲烷萃取得总生物碱，总生物碱用硅胶拌样后进行柱层析分离，用二氯甲烷-甲醇-二乙胺100:1:0、50:1:0、20:1:0、10:1:0和5:1:1梯度洗脱,合并相同组分依次得5个部分a-e，a部分经石油醚-二氯甲烷-二乙胺100:1:1、50:1:1、20:1:1、10:1:1和5:1:1梯度洗脱依次得a1-a5五个部分，a2部分经二氯甲烷-甲醇10:1系统反复柱层析后,二氯甲烷重结晶即得。

制得的野扇花生物碱为无色细针状晶体，易溶于氯仿，难溶于石油醚、甲醇。改良碘化铋钾显色剂显色呈橘红色。¹hnmr(cdcl3,400mhz)δ:5.35(m,1h,h-6),3.61(s,1h,h-16),3.35(s,3h,ome),3.06(tt,j=11.3,4.5hz,1h,h-3),2.89(d,j=6.4hz,1h,h-20),2.28(s,6h,nme2),1.01(s,3h,h-19),0.91(s,3h,h-18),1.17(d,j=6.7hz,3h,h-21).¹³c-nmr(cdcl3,100mhz)δ:141.1(c-5),121.4(c-6),80.3(c-3),73.6(c-17),61.1(c-16),56.0(c-20),55.8(ome),50.5(c-9),45.6(c-14),43.2(nme2),42.1(c-13),38.8(c-4),37.2(c-10),37.2(c-1),32.9(c-12),31.7(c-7),30.4(c-8),28.1(c-2),27.4(c-15),20.8(c-11),19.5(c-19),15.8(c-18),13.6(c-21).

¹hnmr显示3个角甲基质子信号δ1.01(s,3h,h-19),0.91(s,3h,h-18),1.17(d,j=6.7hz,3h,h-21)，两个连在氮上的甲基质子信号δ2.28(s,6h,nme2)，一个连在氮上的次甲基质子信号δ2.89(d,j=6.4hz,1h,h-20)，两个连氧次甲基质子信号δ3.61(s,1h,h-16)，3.06(tt,j=11.3,4.5hz,1h,h-3)，一个连在氧上的甲基质子信号δ3.35(s,3h,ome)，一个连在双键上的次甲基质子信号δ5.35(m,1h,h-6)。¹³cnmr显示了3个角甲基信号δ19.5(c-19),15.8(c-18),13.6(c-21)，两个连在氮上的甲基信号δ43.2(nme2)，一个连在氮上的次甲基信号δ56.0(c-20)，两个连氧次甲基信号δ80.3(c-3),61.1(c-16)，一个连氧甲基信号δ55.8(ome)，一个双键上的碳信号δ141.1(c-5),121.4(c-6)，与氢谱数据互相应证。以上光谱数据与文献中(20s)-20-(n,n-dimethylamino)-16α,17α-epoxy-3β-methoxy-pregn-5-ene的数据基本一致，故鉴定其为3（20s）-20-（n,n二甲胺基）-16,17-环氧-3β-甲氧基-孕甾-5(6)-烯。

前述的野扇花生物碱的应用，所述野扇花为聚花野扇花、羽脉野扇花、双蕊野扇花、长叶野扇花、长叶柄野扇花、东方野扇花、野扇花、柳叶野扇花、海南野扇花或云南野扇花。

一种治疗癌症的药物，所述药物包括野扇花生物碱。

前述的治疗癌症的药物，所述药物主要由野扇花生物碱制成。

上述药物的给药途径为口服，皮下、静脉或肌肉注射。

细胞毒活性研究

1.实验材料

1.1受试品：（20s）-20-（n,n二甲胺基）-16,17-环氧-3β-甲氧基-孕甾-5(6)-烯(20s)-20-(n,n-dimethylamino)-16α,17α-epoxy-3β-methoxy-pregn-5-ene。配制本发明的化合物：称取一定量化合物，加入适量dmso，配制为100mm的化合物溶液，此为母液。用完全培养基将母液依次配制成200、60、20、6、2、0.6μm的工作液。

1.2阳性对照药：顺铂（ddp），批号：sjjmi-ie，东京化成工业株式会社；5-氟尿嘧啶（5-fu），批号：hfbm160120325008，amresco公司。阳性对照药配制：称取ddp或5-fu约2mg，用新鲜完全培养基配制成100mm的母液，再用新鲜完全培养基将母液依次配制成200、60、20、6、2、0.6μm的工作液。

1.3主要材料：人结肠腺癌细胞（sw480）、人肝癌细胞（smmc-7721）、人前列腺癌细胞（pc3）、人乳腺癌细胞（mcf-7）、人慢性髓原白血病细胞（k562）。高糖dmem培养基（规格：500ml/瓶，批号：ab10201637，hyclone公司），fbs（规格：500ml/瓶，批号：m048-6，美国sciencell公司），cck-8（规格：100ml/瓶，批号：b34304，美国bimake公司）。

1.4主要仪器：3111型co2培养箱（编号：024，美国thermo公司），dmil型倒置显微镜（编号：027，德国leica公司），cj-1f型医用净化工作台（编号：058，苏州冯氏实验动物设备有限公司），spectramax-i3x型酶标仪（编号：525，美国moleculardevices公司）。

2试验方法

2.1细胞培养

取已长满的sw480、smmc-7721、pc3、mcf-7、k562细胞，采用含10%fbs的高糖dmem完全培养基，于37℃、5%co2培养箱中培养，根据细胞生长情况，1～2d传代或换液，至对数生长期备用。

2.2cck-8法检测化合物对癌细胞的细胞毒性试验

取对数期生长的sw480、smmc-7721、pc3、mcf-7、k562细胞以每孔3×10³个细胞接种于96孔细胞培养板中，待12h细胞贴壁后，设置正常对照组、阳性对照药（ddp）组、阳性对照药（5-fu）组、本发明的化合物组（100、30、10、3、1、0.3μm），每组3个复孔。正常对照组以新鲜完全dmem培养基孵育细胞，化合物组分别以含终浓度为100、30、10、3、1、0.3μm化合物的新鲜完全dmem孵育细胞，ddp和5-fu组分别以含终浓度为100、30、10、3、1、0.3μm化合物的新鲜完全dmem孵育细胞。按上述处理方式孵育细胞72h后在每孔中加入cck-810μl，继续培养1h后在450nm处测量各孔的吸光度。以正常对照组od值为100%细胞活力，其余各组od值与正常对照组od值的比值为相对活力。以相对活力评价化合物对sw480、smmc-7721、pc3、mcf-7、k562细胞的毒性。

3结果评价

显微镜下观察不同的化合物处理细胞后，出现细胞增殖速度减慢，细胞碎片增多、细胞间隙增大、细胞出现沙粒状空泡，且具有剂量-效应关系。结果详见下表：

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

通过上述实验例证实，本发明的化合物对于癌细胞的增值具有抑制作用，使用该化合物后，细胞增殖速度变慢，细胞碎片增多、细胞间隙增大、细胞出现沙粒状空泡。同时，结合实验数据指标来看，本发明化合物对治疗癌症具有较好的效果。

化合物体外药物筛选实验

1.实验材料

1.1受试品：hs-2、hs-4、hs-5、hs-6、hs-8、hs-15、hs-22、hs-25、hs-26、hs-27、hs-30、hs-42、hs-45、hs-50、hs-56、hs-57、hs-62（备注：其中hs-6为本发明所述的野扇花生物碱，其他化合物为同类化合物）。配制本发明的化合物：称取一定量化合物，加入适量dmso，配制为100mm的化合物溶液，此为母液。用完全培养基将母液依次配制成200、60、20、6、2、0.6μm的工作液。

1.2阳性对照药：顺铂（ddp），批号：sjjmi-ie，东京化成工业株式会社；5-氟尿嘧啶（5-fu），批号：hfbm160120325008，amresco公司。阳性对照药配制：称取ddp或5-fu约2mg，用新鲜完全培养基配制成100mm的母液，再用新鲜完全培养基将母液依次配制成200、60、20、6、2、0.6μm的工作液。

1.3主要材料：人结肠腺癌细胞（sw480）、人肝癌细胞（smmc-7721）、人前列腺癌细胞（pc3）、人乳腺癌细胞（mcf-7）、人慢性髓原白血病细胞（k562）。高糖dmem培养基（规格：500ml/瓶，批号：ab10201637，hyclone公司），fbs（规格：500ml/瓶，批号：m048-6，美国sciencell公司），cck-8（规格：100ml/瓶，批号：b34304，美国bimake公司）。

1.4主要仪器：3111型co2培养箱（编号：024，美国thermo公司），dmil型倒置显微镜（编号：027，德国leica公司），cj-1f型医用净化工作台（编号：058，苏州冯氏实验动物设备有限公司），spectramax-i3x型酶标仪（编号：525，美国moleculardevices公司）。

2试验方法

2.1细胞培养

取已长满的sw480、smmc-7721、pc3、mcf-7、k562细胞，采用含10%fbs的高糖dmem完全培养基，于37℃、5%co2培养箱中培养，根据细胞生长情况，1～2d传代或换液，至对数生长期备用。

2.2cck-8法检测化合物对癌细胞的细胞毒性试验

取对数期生长的sw480、smmc-7721、pc3、mcf-7、k562细胞以每孔3×10³个细胞接种于96孔细胞培养板中，待12h细胞贴壁后，设置正常对照组、阳性对照药（ddp）组、阳性对照药（5-fu）组、本发明的化合物组（100、30、10、3、1、0.3μm），每组3个复孔。正常对照组以新鲜完全dmem培养基孵育细胞，化合物组分别以含终浓度为100、30、10、3、1、0.3μm化合物的新鲜完全dmem孵育细胞，ddp和5-fu组分别以含终浓度为100、30、10、3、1、0.3μm化合物的新鲜完全dmem孵育细胞。按上述处理方式孵育细胞72h后在每孔中加入cck-810μl，继续培养1h后在450nm处测量各孔的吸光度。以正常对照组od值为100%细胞活力，其余各组od值与正常对照组od值的比值为相对活力。以相对活力评价化合物对sw480、smmc-7721、pc3、mcf-7、k562细胞的毒性。

3结果评价

显微镜下观察本发明的化合物hs-6以及hs-4处理细胞后，出现细胞增殖速度明显减慢，细胞碎片增多、细胞间隙增大、细胞出现沙粒状空泡的效果，而其他化合物则没有明显的抑制作用。结果详见下表：

附图说明

附图1为本发明的野扇花生物碱的结构示意图；

附图2为本发明的孕甾烷型野扇花生物碱的碳谱；

附图3为本发明的孕甾烷型野扇花生物碱的氢谱；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

本发明的实施例

实施例1

工艺：取野扇花生物碱100g，与40g的淀粉混合，装入胶囊，制成1000粒，即得。

野扇花生物碱通过如下方法制备：将干燥的野扇花根茎粉碎成粗粉，用95%的甲醇超声提取3次，每次24小时，合并提取液，浓缩得浸膏，浸膏用1%的硫酸溶液溶解后用乙酸乙酯萃取得非生物碱部分，剩余的酸水层用饱和的碳酸钠溶液调节ph到9，再用二氯甲烷萃取得总生物碱，总生物碱用硅胶拌样后进行柱层析分离，用二氯甲烷-甲醇-二乙胺100:1:0、50:1:0、20:1:0、10:1:0和5:1:1梯度洗脱,合并相同组分依次得5个部分a-e，a部分经石油醚-二氯甲烷-二乙胺100:1:1、50:1:1、20:1:1、10:1:1和5:1:1梯度洗脱依次得a1-a5五个部分，a2部分经二氯甲烷-甲醇10:1系统反复柱层析后,二氯甲烷重结晶即得。

用法用量：口服，一日3次，每次使用剂量以海南野扇花碱d计为3mg。

功能与主治：抑制癌细胞增殖，治疗癌症。

实施例2

工艺：取野扇花生物碱，加注射用水溶解并灌封于相应容器内，115℃热压灭菌30分钟，冷却后，抽滤，滤液加注射用水稀释，垂熔滤球过滤，灌封，115℃再热压灭菌30分钟，制备成注射液。

野扇花生物碱通过实施例所述方法制备。

用法用量：肌肉注射，静脉注射或静脉滴注，每日使用量以野扇花生物碱计为2mg。

功能与主治：抑制癌细胞增殖，治疗癌症。

实施例3

工艺：取野扇花生物碱，加注射用水溶解，加入2%的甘露醇，干燥，制备成注射用冻干粉针剂。

野扇花生物碱通过实施例所述方法制备。

用法用量：肌内注射、静脉注射或静脉滴注，每日使用量以野扇花生物碱计为3mg。

功能与主治：抑制癌细胞增殖，治疗癌症。

实施例4

工艺：取野扇花生物碱，与药物制成量7%的淀粉混匀，制丸，干燥，包糖衣，即得丸剂。

野扇花生物碱通过实施例所述方法制备。

用法用量：口服，每日2次，每次使用剂量以野扇花生物碱计为4mg。

功能与主治：抑制癌细胞增殖，治疗癌症。