格拉司琼在制备防治脓毒症器官损伤的药物中的应用的制作方法

本发明涉及含有机有效成分的医药制品，具体涉及含杂环化合物格拉司琼的药物。

背景技术：

脓毒症是指由细菌、病毒或真菌感染诱发的全身炎症反应，可以导致休克、多器官功能障碍综合征(mods)，甚至死亡。脓毒症发生率高，全球每年有超过1800万严重脓毒症病例，而且这一数字还以每年1.5％～8.0％的速度上升。近年来，尽管抗感染治疗(抗生素)、重症监护和器官功能支持技术已取得显著进步，但其住院死亡率仍高达15％～50％。脓毒症时,大量的炎症介质与抗炎介质同时释放入血,导致多器官功能损伤、淋巴细胞凋亡、免疫麻痹，而机体炎症反应和抗炎反应失衡被认为是脓毒症发生的主要机理。目前，临床尚未成功开发出有针对性的治疗脓毒症的有效药物，是重症医学面临的严峻挑战。

格拉司琼为白色至微黄白色的结晶性粉末，无臭，易溶于水，难溶于甲醇，极难溶于乙醇，在乙醚中几乎不溶，熔点为290～292℃，其分子式为c18h24n4o，化学结构如下式(ⅰ)所示。格拉司琼注射液为无色的澄明液体，是一种高选择性的5-ht3受体拮抗剂，放疗、化疗及外科手术等因素可引起肠嗜铬细胞释放5-ht，引起呕吐反射。格拉司琼通过拮抗中枢化学感受区及外周迷走神经末梢的5-ht3受体，从而抑制恶心、呕吐的发生。本品选择性高，无锥体外系反应、过度镇静等副作用。

格拉司琼主要是治疗癌症化疗引起的呕吐和肠易激综合症。目前研究表明，5-ht3拮抗剂具有镇痛和抗炎作用，在单核细胞中能够通过抑制p38信号通路激活，发挥抗炎的作用。另外，5-ht3受体拮抗剂托烷司琼在大鼠脓毒症模型发挥其抗炎作用的同时，伴随着对自主神经功能的影响。但是关于格拉司琼在治疗脓毒症器官损伤中的作用目前尚无报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是格拉司琼的新用途，即在制药中的新应用。

上述格拉司琼在制药中的新应用具体为，格拉司琼在制备防治脓毒症器官损伤的药物中的应用，其中所述的脓毒症器官损伤为脓毒症肺及肾损伤。

上述应用中，所述的药物为注射液，该注射液中格拉司琼的浓度为1mg/ml。

本发明所述的用途，其中所述格拉司琼能够明显抑制炎症因子的表达，对炎症反应有一定的缓解作用，可明显改善脓毒症小鼠肾及肺组织损伤。

本发明所述的应用，其中所述格拉司琼对脓毒症器官损伤的减缓作用，通过以下实验方法进行验证。

附图说明

图1是格拉司琼改善脓毒症模型小鼠肾及肺组织损伤病理结果图；图1中，a图为各组肾组织形态学变化he染色图，b图为各组肾小管上皮细胞损伤定量评分结果，c图为各组肺组织形态学变化he染色图，d图为各组肺组织损伤定量评分结果，图片标尺为100μm；图1中，标注符号的含义是：数据采用t检验分析，*表示与clp组比较差异具有统计学意义p<0.05。

图2是格拉司琼减缓脓毒症模型中小鼠肾损伤统计结果的条形图；图2中，标注符号的含义是：数据采用t检验分析，*表示与clp组比较差异具有统计学意义p<0.05。

图3是格拉司琼抑制脓毒症模型小鼠炎症因子的mrna表达水平统计结果的条形图；图3中，a图为各组肾组织中炎症因子mrna表达结果图，b图为各组肺组织中炎症因子mrna表达结果图；图3中，标注符号的含义是：数据采用t检验分析，*表示与clp组比较差异具有统计学意义p<0.05。

具体实施方式

实验一：格拉司琼减缓脓毒症模型小鼠肾、肺组织的病理形态学变化

1实验材料

1.1实验动物实验选取5-8周龄雄性c57bl/6j小鼠，体重16～22g，购买于广东省实验动物中心。

1.2试剂和仪器格拉司琼注射液(福安药业集团宁波天衡制药有限公司)；磷酸盐缓冲液(pbs，博士德生物工程有限公司)；he染液(北京雷根生物公司)；无水乙醇(广东光华科技股份有限公司)；二甲苯(广东光华科技股份有限公司)；石蜡(莱卡)；4％多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)；石蜡切片机(湖北伯纳医疗科技有限公司)。

2实验方法和结果

2.1动物实验

将24只c57bl/6j小鼠随机均分为2组，分别为盲肠结扎穿孔组(clp组)、盲肠结扎穿孔+格拉司琼组(clp+ga组)。进行盲肠结扎重度实验之后，盲肠结扎穿孔组腹腔注射pbs，盲肠结扎穿孔+格拉司琼组腹腔注射格拉司琼，剂量1mg/kg，注射体积350μl。于术后18h，分离小鼠肾、肺组织，进行病理形态学变化检测。

2.2肾、肺组织形态学变化检测

1、石蜡切片：

⑴固定：将新鲜的肾组织放入4％多聚甲醛浸泡固定24h。

⑵脱水：按照如下的脱水程序进行脱水：70％乙醇1.5h、85％乙醇1.5h、95％乙醇1.5h、95％乙醇1h、100％乙醇1h、100％乙醇1h、100％乙醇1h、二甲苯1h、二甲苯1h、石蜡1h、石蜡3h。

⑶包埋：在石蜡切片包埋机上进行包埋。

⑷切片：在石蜡切片机上进行切片，厚度为3μm，为he染色和tunel凋亡检测实验做准备。

2、he染色：苏木精-伊红染色。苏木精染液为碱性，使细胞核内染色质呈紫蓝色，伊红为酸性染料，使细胞质和细胞外基质呈红色。染色所用试剂和时间如下：

表2-1he染色试剂和时间

用中性树胶进行封片，在显微镜下观察肾、肺组织病理形态学变化。

2.3实验结果

图1a-b肾组织he染色及评分结果显示，clp模型组肾小管扩张，间质充血，注射格拉司琼之后鼠肾组织上述病变显著改善。图1c-d肺组织he染色结果及评分结果表明，clp模型组中肺间隔增厚，肺间质细胞大量增生，肺泡腔可见炎症细胞浸润，注射格拉司琼之后鼠肺组织上述病变显著改善。上述数据说明格拉司琼能够减缓脓毒症模型小鼠肾、肺组织的病理形态学变化。

实验二：格拉司琼能够减缓脓毒症模型小鼠器官损伤

1实验材料

1.1实验动物实验选取5-8周龄雄性c57bl/6j小鼠，体重16～22g，购买于广东省实验动物中心。

1.2试剂和仪器肌酐检测试剂盒(南京建成)；多功能酶标仪(美国moleculardevices)。

2实验方法和结果

2.1动物实验

将24只c57bl/6j小鼠随机均分为2组，分别为盲肠结扎穿孔组(clp组)、盲肠结扎穿孔+格拉司琼组(clp+ga组)。进行盲肠结扎重度实验之后，盲肠结扎穿孔组腹腔注射pbs，盲肠结扎穿孔+格拉司琼组腹腔注射格拉司琼，剂量1mg/kg，注射体积350μl。术后18h，下腔静脉取血，用肌酐检测试剂盒对其含量进行测定。

2.2实验结果

图2clp+ga组血清中肌酐的含量与clp组相比明显减少(p<0.05)，数据说明格拉司琼能够减缓脓毒症模型中小鼠肾损伤。

实验三：格拉司琼抑制脓毒症模型小鼠肾、肺组织中炎症因子的表达

1实验材料

1.1实验动物实验选取5-8周龄雄性c57bl/6j小鼠，体重16～22g，购买于广东省实验动物中心。

1.2试剂和仪器trizol裂解液(invitrogen)；异丙醇(广东光华)；氯仿(广东光华)；无水乙醇(广东光华)；depc水(sigma)；sybrgreen荧光染料(东洋纺)；revertraaceqpcrrtkit(东洋纺)；pcr仪(德国eppendorf公司)；荧光定量pcr仪(美国应用生物系统ab公司)。

2实验方法和结果

2.1动物实验将24只c57bl/6j小鼠随机均分为2组，分别为盲肠结扎穿孔组(clp组)、盲肠结扎穿孔+格拉司琼组(clp+ga组)。进行盲肠结扎重度实验之后，clp组腹腔注射pbs，clp+ga组腹腔注射格拉司琼，剂量1mg/kg，注射体积350μl。术后18h，分离小鼠肾、肺组织，提取其rna，检测炎症因子mrna表达水平。

2.2炎症因子mrna表达

1、rna提取方法：

⑴取20-50mg的肾、肺组织置于2ml无rna酶ep管中，加入500μltrizol裂解液后匀浆。

⑵匀浆液中加入100μl的氯仿，摇晃15-20次，室温静置1-2min。

⑶12,000rpm,4℃离心15min，吸取上层水相至新的无rna酶的1.5mlep管中。

⑷加入等体积的异丙醇，摇匀15-20次，室温静置10min。

⑸12,000rpm,4℃离心10min，弃上清，加入1ml80％乙醇(用depc水配制)，摇晃振荡之后7500rpm,4℃离心5min。

⑹弃上清，7500rpm,4℃离心1min，吸干残留的乙醇，室温放置5-10min，加入50-100μl的depc水重悬。rna产物置于-80℃冰箱保存备用。

2、提取的rna进行逆转录反应：

⑴取1μl提取的rna加入到6μl的nuclease-freewater中，在pcr扩增仪上65℃变性5min。

⑵变性后立即取出冰上冷却，向反应体系中加入5×reactionbuffer2μl、rtenzymemix0.5μl、primemix0.5μl，轻微震荡后离心3-5s。

⑶将反应体系置于pcr扩增仪上，37℃15min逆转录,98℃5min使酶失活。

⑷反应结束后加入190μl的无菌水，得到cdna溶液。

3、real-timepcr反应：

⑴反应体系中加入6μlsybrgreen、1μl炎症因子引物及5μlcdna溶液后置于荧光定量pcr仪中。

⑵real-timepcr反应条件：cycling：stage95℃15s；60℃1min，40个循环；meltcurestage：95℃15s；60℃1min；95℃30s；60℃15s。

2.3实验结果

图3aclp+ga组肾组织中炎症因子tnfα、ccl2mrna的表达水平与clp相比明显下调(p<0.05)，图3bclp+ga组肺组织中炎症因子tnfα、ccl3、cxcl2、ccl4、il-1βmrna的表达水平与clp相比明显下调(p<0.05)。实验结果说明格拉司琼能够抑制脓毒症模型小鼠肾、肺组织中炎症因子的表达。