一种黄酮类化合物在制备抗骨质疏松药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种黄酮类化合物，更具体地说，是涉及一种黄酮类化合物在制备抗骨质疏松药物中的应用。

背景技术：

骨质疏松症是多种原因引起的一种以骨组织含量减少，骨的微观结构退化为特征，致使骨的脆性增加、强度降低而导致易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。随着人类社会逐渐进入老龄化，骨质疏松症的患病率逐年增加。骨质疏松不仅严重威胁着人们的健康，由此带来的骨折也给人们带来了沉重的负担。目前，临床上治疗骨质疏松症的药物种类有限，且部分品种如雌激素长期使用毒副作用较大。因此，急需开发新型的抗骨质疏松症药物。

骨骼是一个动态活性组织，它通过持续的重塑来维持其矿化平衡及自身的结构完整。骨重塑是一个复杂的生物学过程，在这一过程中，破骨细胞(oc)完成骨的吸收功能，成骨细胞(ob)主导骨的形成功能，二者生成及活性的协调是骨重塑过程维持骨骼结构完整的关键。健康骨骼处于ob骨形成与oc骨吸收动态平衡的状态，这种平衡一旦被打破可导致骨质疏松、骨硬化病等多种骨代谢性疾病。

黄酮类化合物是自然界中含量丰富的一类化合物，越来越多的研究表明，黄酮具有植物雌激素、抗氧化、抗炎等作用，而这些特性与抗骨质疏松活性密切有关。2-[6-(2,4-二羟基苯甲酰基)-5-(2,4-二羟基苯基)-3-甲基环己-2-烯-1-基]-1,3,8,10a-四羟基-5a-异戊烯基-[1]苯并呋喃骈[3,2-b]色原酮，是一种黄酮类化合物，研究表明该化合物具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用，但未见其抗骨质疏松方面的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的是：发现黄酮类化合物在制备抗骨质疏松药物中的应用。

本发明是这样实现的：黄酮类化合物在制备抗骨质疏松药物中的应用，中文名称为：2-[6-(2,4-二羟基苯甲酰基)-5-(2,4-二羟基苯基)-3-甲基环己-2-烯-1-基]-1,3,8,10a-四羟基-5a-异戊烯基-[1]苯并呋喃骈[3,2-b]色原酮，分子式为：c40h36o12，分子量为：708.7，该化合物具体结构如下式(ⅰ)。

所述的化合物为2-[(1s,5s,6r)-6-(2,4-二羟基苯甲酰基)-5-(2,4-二羟基苯基)-3-甲基环己-2-烯-1-基]-1,3,8,10a-四羟基-5a-异戊烯基-[1]苯并呋喃骈[3,2-b]色原酮，即桑根酮c(ii)；其结构式(ii)如下：

所述的化合物为2-[(1r,5s,6r)-6-(2,4-二羟基苯甲酰基)-5-(2,4-二羟基苯基)-3-甲基环己-2-烯-1-基]-1,3,8,10a-四羟基-5a-异戊烯基-[1]苯并呋喃骈[3,2-b]色原酮，即桑根酮d(iii)；其结构式(iii)如下：

为了明确“2-[6-(2,4-二羟基苯甲酰基)-5-(2,4-二羟基苯基)-3-甲基环己-2-烯-1-基]-1,3,8,10a-四羟基-5a-异戊烯基-[1]苯并呋喃骈[3,2-b]色原酮”的抗骨质疏松活性，发明人进行了如下实验：

培养mc3t3-e1subclone14细胞，采用mtt法研究该化合物对成骨细胞增殖的影响。从乳兔胫骨和股骨中分离出破骨细胞及骨髓细胞，用1α,25-(oh)2vitd3对兔骨髓细胞进行诱导，采用此原代分离构建的破骨细胞模型，研究该化合物对破骨细胞活性的作用。结果表明该化合物能促进mc3t3-e1subclone14细胞的增殖，并对破骨细胞具有抑制作用。

随机选取3dpf野生型ab品系斑马鱼于6孔板中，给予泼尼松处理建立骨质疏松症模型。28℃培养箱处理5天后，用0.2％钙黄绿素对斑马鱼进行染色，染色后拍照并采集数据，以斑马鱼前三节脊椎骨的荧光强度评价该化合物对斑马鱼骨质疏松症的治疗作用。结果显示，该化合物能显著增加斑马鱼的骨密度，对泼尼松诱导的骨质疏松症具有显著的治疗作用。

本发明首次公开了该化合物对成骨细胞、破骨细胞的活性作用，并对斑马鱼骨质疏松症的治疗作用进行了研究，说明此化合物可用于防治骨质疏松等骨丢失性疾病。

附图说明

附图1：化合物结构图；

附图2：正常对照组，未给予泼尼松处理；

附图3：模型对照组，给予泼尼松处理；

附图4：阳性对照组，给予泼尼松+依替膦酸二钠处理；

附图5：实验组，给予泼尼松+桑根酮c处理；

附图6：实验组，给予泼尼松+桑根酮d处理。

具体实施方式

本发明通过下面的实施例予以进一步说明，但实施例并不限定本发明的范围。

实施例1：桑根酮c对成骨细胞活性作用的研究

将mc3t3-e1subclonel4细胞以5000个/孔的密度接种到96孔板中，24h后换含药培养基，48h后每孔加入10μlmtt(5mg/ml)，继续孵育4h后，吸弃各培养孔上清液，分别加入150μl二甲基亚砜，振荡10min，用酶标仪在490nm波长处测定od值，计算增殖率，结果见表1。

表1桑根酮c对mc3t3-e1subclone14细胞增殖的影响(n＝5)

与空白组比较，*p<0.01

结果表明，10^-5～10^-8mol/l桑根酮c与空白对照组相比，吸光度有所增加且具有显著性差异(p<0.01)，10^-5mol/l桑根酮c增殖率达25.96％，说明桑根酮c能促进mc3t3-e1subclonel4细胞的增殖。

实施例2：桑根酮d对成骨细胞活性作用的研究

将mc3t3-e1subclonel4细胞以5000个/孔的密度接种到96孔板中，24h后换含药培养基，48h后每孔加入10μlmtt(5mg/ml)，继续孵育4h后，吸弃各培养孔上清液，分别加入150μl二甲基亚砜，振荡10min，用酶标仪在490nm波长处测定od值，计算增殖率，结果见表2。

表2桑根酮d对mc3t3-e1subclone14细胞增殖的影响(r＝5)

与空白组比较，*p<0.01

结果表明，10^-5～10^-8mol/l桑根酮d与空白对照组相比，吸光度有所增加且具有显著性差异(p<0.01)，10^-5mol/l桑根酮d增殖率达42.34％，说明桑根酮d能促进mc3t3-e1subclonel4细胞的增殖。

实施例3：桑根酮c对破骨细胞活性作用的研究

将出生48h以内的乳兔断颈处死，75％酒精消毒，在无菌操作台中剥离后肢股骨和胫骨，置于pbs中。剥除软组织后置于含10％胎牛血清的α-mem培养基中，剪开骨干，轻刮出细胞，漩涡震荡，用200目细胞筛过筛，稀释成2×10⁶个/ml的细胞悬液，接种于48孔培养板上，置于培养箱中培养。24h后用pbs轻洗，更换为含1α,25-(oh)2vitd3的含药培养基，然后每3天换一次培养基，培养至第八天后按抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色试剂盒进行染色，显微镜下对trap阳性细胞计数。结果表明，桑根酮c能显著抑制破骨细胞的形成。

表3桑根酮c对破骨细胞trap染色阳性细胞个数的影响(n＝4)

与空白组比较，*p<0.01

实施例4：桑根酮d对破骨细胞活性作用的研究

将出生48h以内的乳兔断颈处死，75％酒精消毒，在无菌操作台中剥离后肢股骨和胫骨，置于pbs中。剥除软组织后置于含10％胎牛血清的α-mem培养基中，剪开骨干，轻刮出细胞，漩涡震荡，用200目细胞筛过筛，稀释成2×10⁶个/ml的细胞悬液，接种于48孔培养板上，置于培养箱中培养。24h后用pbs轻洗，更换为含1α,25-(oh)2vitd3的含药培养基，然后每3天换一次培养基，培养至第八天后按抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色试剂盒进行染色，显微镜下对trap阳性细胞计数。结果表明，桑根酮d能显著抑制破骨细胞的形成。

表4桑根酮d对破骨细胞trap染色阳性细胞个数的影响(n＝4)

与空白组比较，*p<0.01

实施例5：桑根酮c和桑根酮d对斑马鱼骨质疏松治疗作用评价

随机选取3dpf野生型ab品系斑马鱼于6孔板中，水溶给予泼尼松处理以建立斑马鱼骨质疏松症模型。对骨质疏松模型斑马鱼分别水溶给予10μm桑根酮c和1μm桑根酮d，阳性对照药依替膦酸二钠300μg/ml浓度，同时设置正常对照组(养鱼用水处理正常斑马鱼)和模型对照组。28℃培养箱处理5天后，用0.2％钙黄绿素对斑马鱼进行染色，染色后进行拍照并分析统计斑马鱼前三节脊椎骨累积光密度，统计学处理结果用mean±se表示。

结果表明，模型对照组的斑马鱼脊椎骨累积光密度(21702像素)与正常对照组(48195像素)比较p<0.001，提示模型构建成功；阳性对照药依替膦酸二钠组的斑马鱼脊椎骨累积光密度(45132像素)与模型对照组(21702像素)比较p<0.001，其斑马鱼骨质疏松治疗作用为88％，提示阳性药对泼尼松诱导的斑马鱼骨质疏松症具有显著的治疗作用。

桑根酮c组的斑马鱼脊椎骨累积光密度为45460像素，其斑马鱼骨质疏松治疗作用为90％，与模型对照组比较有显著性差异(p<0.001)，说明桑根酮c对泼尼松诱导的斑马鱼骨质疏松症具有显著的治疗作用；桑根酮d组的斑马鱼脊椎骨累积光密度为38686像素，其斑马鱼骨质疏松治疗作用为64％，与模型对照组比较有显著性差异(p<0.01)说明桑根酮d对泼尼松诱导的斑马鱼骨质疏松症具有显著的治疗作用。详见表5。

表5桑根酮c和桑根酮d对斑马鱼骨质疏松症的治疗作用(n＝10)

与模型对照组比较，*p<0.01，**p<0.001。