氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐在预防和/或治疗肺部疾病中的应用的制作方法

本发明属于药物技术领域，特别涉及氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部疾病药物中的应用。

背景技术：

肺部疾病特别如急性肺损伤、哮喘及慢性阻塞性肺疾病等一直以来都是高发病率、高死亡率疾病，随着近年城市化建设的速度越来越快，空气质量日益堪忧，肺部疾病的发生率也随之增多，疾病本身严重影响着病人的生活质量，带给社会的医疗负担也越来越重，肺部疾病治疗药物的研发由此成为了新的热点，广泛受到人们的重视。

(一)急性肺损伤

急性肺损伤(acutelunginjury,ali)是指由非心源性的各种严重肺内、外致病因素，如创伤、休克、缺血再灌注、弥漫性肺泡损伤、中毒等导致的呼吸衰竭。病理表现为肺内皮细胞和上皮细胞损伤、肺毛细血管通透性增强、炎症细胞浸润和进行性呼吸窘迫为特征的综合征(bakowitzm,brunsb,mccunnm.scandjtraumaresuscemergmed,2012,20:54)。ali发展至严重阶段被称为急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ards)，表现为顽固性低氧血症和呼吸窘迫，可出现呼吸衰竭、多器官功能障碍甚至死亡(tsushimak,kingls,aggarwalnr,etal.internmed,2009,48(9):621-630)。ali/ards发病机制复杂，受损的靶细胞多，涉及多个环节，包括炎症细胞的活化浸润、炎性因子的释放、氧化损伤、免疫应答的失调、表面活性物质的缺失和纤溶系统的失衡等均可促进其发生发展(butty,kurdowskaa,allentc.archpathollabmed,2016,140(4):345-350,kollefmh,schusterdp.nengljmed,1995,332(1):27-37)。据流行病学研究统计，ali/ards起病急骤，预后极差，死亡率达30％-50％，目前临床上仍缺乏有效的药物治疗手段，是临床常见的危重疾病(gerardl,bidoult,castanares-zapaterod,etal.critcaremed,2018,diazjv,browerr,calfeecs,etal.critcaremed,2010,38(8):1644-1650)。

ali/ards有几个病理阶段描述：急性炎症伴中性粒细胞浸润，透明膜纤维增殖阶段，不同程度的间质纤维化等。在ali/ards相关的病理生理中，对于肺泡上皮破坏，支气管内稳态环境改变，中性粒细胞活化，细胞免疫反应和肺泡巨噬细胞募集的研究取得较好的进展。然而，在临床上随机对照试验中同样采用临床前动物模型的治疗剂量及方法却没有得到预期的治疗效果。ali/ards的临床过程是可变的，人类ali/ards的病理生理复杂。目前ali和ards的发病机制主要涉及炎症/抗炎症、氧化/抗氧化、凝血/纤溶系统和细胞凋亡等多个相互影响的层面(johnsoner,matthayma.jaerosolmedpulmdrugdeliv,2010,23(4):243-252,perlm,lomas-neiraj,venetf,etal.expertrevrespirmed,2011,5(1):115-126)。

针对ali/ards的治疗策略目前主要包括物理手段和药物治疗。物理手段主要分为：压力-容积曲线及保护性肺通气、呼气末正压通气(peep)的优化、允许性高碳酸血症、高频通气、俯卧位通气、反比通气(belonclef,lorenteja,estebana,etal.amjrespircritcaremed,2014,189(10):1187-1193)。药物治疗主要是(1)糖皮质激素的应用；(2)抗去甲肾上腺素(ne)治疗；(3)山莨菪碱的应用；(4)抗细胞因子药物；(5)表面活性物质替代治疗；(6)抗氧化治疗等(xuf,huy,zhouj,etal.jcellmolmed,2013,17(8):927-935)。

(二)慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease,copd)是以呼气气流受限不完全可逆为特征，并伴有肺炎症和肺气肿的一种疾病(footittj,malliap,durhamal,etal.chest,2015,149(1):303-6)。主要特征是通向肺组织的支气管进行性通气阻塞和(或)不可逆变窄(闭塞)，最终导致肺组织失去弹性。目前在欧美，copd是继心血管疾病，癌症和道路交通伤害之后的第四大死因。预计2020年前copd将成为全球第三大死亡原因(tama,sindd.medclinnortham.2012jul；96(4):681-98)。慢性阻塞性肺疾病是一个可以预防和治疗的重要的公众健康问题，是全世界慢性致残和致死的主要原因。

copd的发病机理涉及由空气污染物(包括香烟烟雾)引起并通过遗传因素(多态性)修饰的几种病理过程，例如炎症，细胞生长，气道和/或实质重塑，蛋白酶与抗蛋白酶(barnespj.chinicsinchestmedicine,2014,35(1):71)，细胞调亡，异常细胞修复，细胞外基质破坏和氧化应激(wadah,takizawah.recentpatentsoninflammation&allergydrugdiscovery,2013,volume7:1-11(11))，衰老和感染等。

目前，临床上常应用的copd的治疗药物主要有：(1)支气管舒张剂：β2受体激动剂、抗胆碱药、茶碱类、磷酸二酯酶抑制剂；(2)糖皮质激素；(3)免疫调节剂；(4)抗炎药；(5)抗氧化剂等。

(三)哮喘

支气管哮喘(bronchialasthma，简称哮喘)是由多种细胞，包括适应性及固有免疫系统的炎性细胞和气道自身结构细胞及其相应细胞组分相互作用共同参与的气道慢性炎症性疾病，常导致气道高反应、气道黏液高分泌以及气道壁的重塑等(lambrechtbn,hammadh.natureimmunology,2014,16(1):45-56)。这种慢性炎症导致气道高反应性，通常出现广泛多变的可逆性气流受限，并引起反复发作性的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状，多数患者可自行缓解或经治疗后缓解。哮喘不仅会对患者甚至社会造成较大的经济负担，而且也会严重影响患者的生活质量。该病的发病机制非常复杂，目前发病机制主要可概括为以下几点：气道炎症机制，气道高反应性，免疫与变态反应机制，气道重塑，以及气道的神经-受体调节机制。

目前，临床上最有效防治支气管哮喘的方法仍是药物治疗。哮喘急性期应以抗炎、解痉止咳为主以缓解症状，慢性持续期治疗应降低气道高反应性、抗炎以控制症状为主要目的。常用药物包括以下几个方面：(1)糖皮质激素；(2)β2受体激动剂；(3)白三烯受体拮抗剂(priced,musgravesd,shepstonel,etal.newenglandjournalofmedicine,2011,364(18):1695-1707)；(4)抗胆碱能制剂；(5)茶碱类药物；(6)抗过敏类药物；(7)免疫疗法。

然而，治疗肺部疾病的现有药物存在一些不良反应：(1)β2受体激动剂：对于敏感患者，刺激β2肾上腺素能受体能导致静息时窦性心动过速，并有潜在的促心律失常作用。对于大剂量使用β2受体激动剂的部份老年患者，不管是通过什么途径给药，严重的躯体震颤会造成很大的影响。(2)抗胆碱能药物：有报道慢阻肺患者常规使用异丙托溴铵能增加心血管事件的发生(micheletm,pinheiros,iyasus.nengljmed,2010,363(12):1097-9)。(3)茶碱类药物：副作用包括房性和室性心律失常(可致命)以及惊厥(不管是否有癫痫病史)。(4)糖皮质激素：全身激素应用包括口服、静脉和肌注，主要副作用有肾上腺抑制、骨骼密度减低或骨折、眼部疾病(白内障、青光眼)、皮肤(变薄和瘀斑)、二重感染等。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于公开一种式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部疾病药物中的应用。

本发明目的之二在于提供一种预防和/或治疗肺部疾病的方法，所述方法包括给予需要预防和/或治疗的患者有效量的式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐。

本发明目的之三在于提供一种预防和/或治疗肺部疾病的药物组合物，所述药物组合物包含式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的载体。

本发明目的之四在于提供了一种用于预防和/或治疗肺部疾病的试剂盒，其包含(a)至少一个单位剂量的式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物和(b)用于预防和/或治疗肺部疾病的说明书。

本发明所述的式(ι)所示的氨基金刚烷单硝酸酯类化合物具有如下结构式：

其中，r为h、直链或支链烷基，n≥1。

优选的，本发明所述的氨基金刚烷单硝酸酯类化合物的通式(i)中的r为h、直链或支链c1-c6烷基，n为1至6任意整数。

进一步优选的，本发明所述的氨基金刚烷单硝酸酯类化合物，选自下面的结构式：

最优选的，本发明所述的氨基金刚烷单硝酸酯类化合物为mn-08。进一步的，本发明所述的肺部疾病可以包括感染性肺部疾病、与空气污染有关的肺部疾病、与职业有关的肺部疾病、与免疫有关的肺部疾病、与遗传有关的肺部疾病或全身性疾病的肺部表现有关的疾病等。

进一步的，本发明所述的肺部疾病可以包括急性肺损伤、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺炎、肺结核或尘肺。

在一些实施方案中，所述的肺部疾病为急性肺损伤。所述的急性肺损伤可以为肺炎、严重脓毒症或肺挫伤等多种原因引起的损伤。

在一些实施方案中，所述的肺部疾病为哮喘。

在一些实施方案中，所述的肺部疾病为慢性阻塞性肺疾病。所述的慢性阻塞性肺疾病可以包括慢性支气管炎和肺气肿。

本发明所述的式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部疾病药物中的应用，式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐可以单独或与其它药物联合使用。

本发明所述的式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物可以以它的游离碱形式给药，也可以以其盐、水合物或前药的形式给药，该前药在体内转换成本发明所述化合物的形式。如，式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物药学上可接受的盐在本发明的范围内，可按照本领域公知的方法由不同的有机酸或无机酸产生所述的盐。

式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐可通过多种途径给药，该途径包括但不限于选自以下的途径：口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、透皮、舌下、肌内、直肠、透颊、鼻内、吸入、阴道、眼内、局部、皮下、脂肪内、关节内、腹膜内或鞘内。在一个特定的实施方案中，通过口服给药。

式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐可与任何可用的载体混合或溶解，如经皮肤、粘膜、胃肠内和胃肠外给药的可用药物载体，该药物以常规制剂的形式使用，如片剂、颗粒剂、针剂、粉剂、胶囊剂、悬浮剂。该药物中使用的可药用的赋形剂和添加剂包括无毒的可相容的填料、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、矫味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂。该药物可按各种制剂的常规工艺制备。

给予式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐的量可根据疾病的严重程度、疾病的响应、任何治疗相关的毒性、患者的年龄和健康状态来确定。在一些实施方案中，给予式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐的日剂量为5-300mg。

式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐可以每日施用一次或多次。在一些实施方案中，每天一次给予式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐。

给药的方法可根据药物的活性、毒性以及患者的耐受性等来综合确定。

本文中，所提供的方法、应用、药物组合物或试剂盒中，式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐可以作为唯一的活性成分单独给予患者；在所提供的方法、应用、药物组合物或试剂盒中，还可含有第二种药物，式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐与第二种药物同时或依照次序给予肺部疾病的患者。所述的第二种包括但不限于化疗药物。

除非另有说明，为本申请的目的，本说明书和权利要求书中所用的下列术语应具有下述含义。

“单位剂量(unitdosage或unitdose)”是指为了服用的方便，包装在单个包装中的药物组合物。例如每片片剂或者胶囊。

“患者”是指哺乳动物，优选人。

“药学上可接受的盐”包括，但不限于与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等形成的酸加成盐；或者与有机酸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、己酸、庚酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、对氯苯磺酸、对甲苯磺酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸等形成的酸加成盐。

“治疗有效量”意指化合物被给予人用于治疗疾病时，足以实现对该疾病控制的使用量。

“治疗”意指治疗上有效量的化合物的任何施用，并且包括：

(1)抑制正经历或显示出所述疾病的病理学或症状学的人体中的该疾病(即，阻止所述病理学和/或症状学的进一步发展)，或

(2)改善正经历或显示出所述疾病的病理学或症状学的人体中的该疾病(即逆转所述病理学和/或症状学)。

本发明的效果和益处是在细胞和动物实验层面上对氨基金刚烷硝酸酯的药效进行了大量实验的基础上发现的。

本发明所述的式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐如mn-08是非竞争性nmda受体阻断剂。本研究观察到尾静脉注射mn-08预处理可改善小鼠肺组织形态学改变，降低肺组织湿/干重比值，改善肺毛细血管渗透性，降低血浆中tnf-α和il-1β的含量，抑制肺内髓过氧化物酶活性和丙二醛含量，升高肺组织超氧化物歧化酶活力和谷胱甘肽含量，表明mn-08对ali、哮喘及copd小鼠具有一定的治疗作用。此外，在lps诱导的raw264.7细胞炎症模型和a549细胞损伤模型中，发现mn-08具有抑制细胞炎症反应，减轻氧化损伤，抑制细胞凋亡的作用。主要基于在raw264.7细胞炎症模型中，mn-08能够降低细胞内ros的水平，抑制细胞上清液炎症因子tnf-α和il-1β的分泌，下调tnf-α、cox-2和inos蛋白的表达量。在mapk信号通路中，mn-08有效的抑制了p38mapk、erk和jnk的磷酸化水平。在nf-κb信号通路中，mn-08有效的抑制了nf-κbp65的核转移。在nrf2/ho-1信号通路中，mn-08上调了抗氧化蛋白的表达水平。在这个细胞模型中，mn-08发挥了抗炎和抗氧化的作用。另外，在a549细胞损伤模型中，mn-08提高bcl-2/bax的比值，说明mn-08具有抑制a549细胞凋亡的作用。我们采用a549细胞模拟肺ii型上皮细胞，研究肺的通透性及水肿损伤，发现lps诱导后细胞的紧密连接结构发生了变化，渗透性发生改变，而mn-08处理后明显改善了细胞间紧密连接结构。在这个细胞模型中，mn-08发挥了保护肺上皮细胞的作用。

在lps诱导的急性肺损伤动物模型上，本发明首次发现mn-08通过拮抗nmda受体过度激活，抑制谷氨酸大量产生，减轻炎症反应和氧化损伤，改善肺水肿情况，进一步减轻肺损伤的发生发展。在lps诱导的raw264.7细胞和a549细胞模型上，首次证实mn-08可以通过抑制nf-κb/mapk信号通路和促进ho-1/nrf2信号通路发挥抗炎和抗氧化作用，从而减轻肺上皮细胞炎症细胞浸润和氧化应激造成的肺损伤。

有研究表明肺血管内皮细胞有nmda受体表达，因此氨基金刚烷硝酸酯类化合物在肺组织中聚集，可能与结合到肺血管nmda受体有关，在肺血管内释放no，扩张肺血管。这些特性不仅使氨基金刚烷硝酸酯可以在肺组织中达到有效治疗浓度，还避免了no在全身释放，使其对体循环的影响较小，与其它传统的治疗肺部疾病的药物比较安全性更高。

本发明的式(ι)所示氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐既能通过非竞争性的与nmda受体通道结合而抑制nmda受体过度激活(即发挥美金刚母核本身的作用)，发挥抗炎与抗氧化作用，又能靶向释放一氧化氮(no)，扩张肺血管，改善肺循环和肺高压的作用。因此本发明的化合物在用于包括哮喘在内的肺部疾病的研究具有一定的意义。

附图说明

图1、mn-08对肺组织湿重干重比值的影响。

图2、mn-08对支气管肺泡灌洗液中性粒细胞及支气管肺泡灌洗液总蛋白的影响。

图3、mn-08对肺组织渗透性指数的影响。

图4、mn-08对小鼠血清炎症因子的影响。

图5、mn-08对肺组织髓过氧化物酶活力及谷氨酸含量的影响。

图6、mn-08对肺组织超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、丙二醛含量的影响。

图7、mn-08对肺组织的保护作用。

图8、mn-08对肺组织紧密连接结构蛋白的影响。

图9、mn-08对肺组织nf-κb信号通路相关蛋白及mapk信号通路相关蛋白的调控作用。

图10、mn-08抑制lps诱导的raw264.7细胞上清液促炎因子tnf-α和il-1β的分泌。

图11、mn-08对lps诱导的raw264.7细胞nf-kb信号通路相关蛋白、mapk信号通路相关蛋白的调控。

具体实施例

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中如无特别说明，动物模型按照如下方式造模和给药：

雄性balb/c小鼠56只(18-22g)，随机分为7组,先用异氟烷麻醉机对小鼠进行麻醉处理，后将小鼠头向上仰卧于一块木板上，在小鼠颈部做一纵行切口，暴露气管，使用末端连有1ml注射器的静脉留置针，经气管壁插入气管内，将预先吸好的50llps溶液(1mg/kg)以及0.8ml空气(速度0.4ml/s以下为宜)滴注至小鼠肺内。气管滴注后将小鼠直立，垂直旋转小鼠，使药物在肺内均匀分布，缝合手术创口，从而复制并建立内毒素型小鼠ali模型。尾静脉给药，给药体积0.2ml/只。

实施例1、mn-08对肺组织湿重干重比值的影响。

于造模当天的1h和6h后各给药一次小鼠在给予lps12h后，用4％水合氯醛进行麻醉处理。眼眶取血后，仰卧位固定于手术台上，经腹部由会阴上方剪除皮肤直至颈部充分暴露腹部及胸部，大十字切口剪开腹部肌肉及腹膜，暴露腹腔。由肝脏膈面、膈肌处剪开进入胸腔，沿两侧胸廓弧度剪开膈肌，由胸廓两侧向上剪至颈部，去除前胸整块胸骨及胸壁，充分暴露两肺、心脏、颈部气管及左右主支气管，注意勿损伤气管及肺。取右肺上叶肺组织，称湿重，置入60℃烘箱内烘48h，达恒重量，计算肺湿重/干重比值。提前将1.5ml的离心管置于60℃烘箱中烘至恒重，记为w0。取右肺上叶肺组织，用干净滤纸吸干残余液体，置于已烘干并已称重的1.5ml离心管中，称湿重，记为w1。然后将离心管置于60℃烘箱烘至48h达恒重，记为w2。计算小鼠肺湿重/干重比值，公式＝(w1-w0)/(w2-w0)。

结果如图1所示，mn-08能显著降低lps诱导的模型小鼠肺组织湿重干重比值的增加。说明mn-08具有改善肺组织水肿的情况。

实施例2、mn-08对支气管肺泡灌洗液中性粒细胞及支气管肺泡灌洗液总蛋白的影响。

小鼠造模和给药结束后，进行肺组织取材，于左肺组织，经由颈部气管插入套管针，以丝线经由气管食管间隙绑扎气管及套管针，使其固定并密封。以血管夹夹闭右主支气管，套管针接1ml空针注入0.3mlpbs缓冲液可见左肺膨起，缓慢回抽，反复3次，回收液体。经1500rpm，4℃，离心10min。取上清液，-80℃保存，留待灌洗液蛋白及细胞因子测定，细胞沉淀用于细胞计数测定。用预冷的pbs重悬支气管肺泡灌洗液沉淀，吸取balf样品20ml加到0.38ml白细胞稀释液中，等待红细胞完全破坏，吸取混匀液10ml于血球计数板，静置2-3min，等待白细胞下沉，进行细胞计数。

用bca蛋白定量测定balf上清液蛋白浓度。配制bca工作液，按a液:b液＝50:1。取标准蛋白20μl，用于制作标准曲线；96孔板中每孔加入2.5ml样品及7.5ml水，每孔加入80ml工作液,在摇床上混匀后，置于37℃培养箱孵育30min,于多功能酶标仪570nm波长处检测od值。根据样品od值在标准曲线上可算出蛋白含量，除以样品总体积(10ml),乘以样品稀释倍数(4倍)，即样品实际浓度(mg/ml)。

结果如图2所示，经lps诱导的模型组小鼠支气管肺泡灌洗液中性白细胞数目(mean＝39.67x105)较正常对照组的小鼠(mean＝3.5x105)明显增加。mn-08治疗后，小鼠支气管肺泡灌洗液中性白细胞的数目有所降低。mn-08治疗能降低lps诱导的模型组小鼠支气管肺泡灌洗液蛋白含量的增加。

实施例3、mn-08对肺组织渗透性指数的影响。

小鼠造模和给药结束后，以balf上清液蛋白含量与血浆蛋白含量的比值表示肺通透性指数(lpi)，用bca测定蛋白含量，即lpi＝balf蛋白含量/血浆蛋白含量。数值增大表示肺毛细血管通透性增加。实验步骤见实施例2bca蛋白定量测定balf蛋白和血浆蛋白的浓度。

结果如图3所示，mn-08治疗能降低lps诱导的模型组小鼠肺组织渗透性指数(lpi)值的增加。

实施例4、mn-08对小鼠血清炎症因子的影响。

小鼠造模和给药结束后，按照南京建成生物科技有限公司小鼠血清肿瘤坏死因子tnf-α试剂盒说明书步骤严格操作。空白对照孔不加样品，生物素标记的抗tnf-α抗体，链霉亲和素hrp，只加显色剂a&b和终止，其余各步操作相同。标准品孔加入标准品50μl，链霉素hrp50μl。待测样品孔加入样本40μl，然后各加入抗tnf-α抗体(或il-1β)10μl、链酶亲和素hrp50μl，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育60分钟。将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释成1x应用液，备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。每孔加终止液50μl，终止反应。以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后10分钟以内进行。根据标准品的浓度及对应的od值计算出标准曲线的回归方程，再根据样品的od值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

结果如图4所示，mn-08能显著降低lps诱导的模型小鼠血清炎症因子tnf-α和il-1水平增高。说明mn-08具有抑制小鼠血清炎症因子tnf-α和il-1分泌的作用。

实施例5、mn-08对肺组织髓过氧化物酶活力及谷氨酸含量的影响。

小鼠造模和给药结束后，髓过氧化物酶活力的测定按照南京建成生物科技有限公司髓过氧化物酶(mpo)测定试剂盒说明书步骤严格操作。中性白细胞中存在髓过氧化物酶(mpo)，每个细胞所含的酶的含量是一定的，约占细胞干重的5％，该酶具有使过氧化氢还原的能力，利用这一特点可以分析酶的活力，并定量测定中性白细胞的数目。酶活力单位定义：每克组织湿片在37℃的反应体系中h2o2被分解1μmol为1个酶活力单位。mpo活力(u/g组织湿重)＝(测定od值-对照od值)/11.3x取样量(g)。

谷氨酸含量的检测按照南京建成生物科技有限公司谷氨酸测定试剂盒说明书步骤严格操作。按照说明书将样品与各试剂添加完成后混匀，37℃水浴40min，取出后于340nm处，1cm光径，双蒸水调零，测各管的吸光度值a2。组织匀浆的计算公式：glu浓度(μmol/gprot)＝{(测定a2值-测定a1值)-(空白a2值-空白a1值)}/{(标准a2值-标准a1值)-(空白a2值-空白a1值)}x标准品浓度(200μmol/lx样品测试前稀释倍数(4倍)/待测样品蛋白浓度(gprot/l)。

结果如图5所示，mn-08具有降低mpo的活力作用，抑制中性粒细胞的聚集，减少炎症因子的分泌，减轻炎症反应。mn-08可能通过拮抗nmda受体的作用，抑制谷氨酸的过度产生，从而减轻对肺组织的损伤作用。

实施例6、mn-08对肺组织超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、丙二醛含量的影响。

小鼠造模和给药结束后，超氧化物歧化酶(sod)的测定按照南京建成生物科技有限公司总超氧化物歧化酶(t-sod)测定试剂盒说明书操作完成。通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(o2^-.)，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含sod时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的sod活力。按照说明书将样品与各试剂添加完成后混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，双蒸水调零，比色。根据以下公式计算总sod活力：每毫克组织蛋白在1ml反应液中sod抑制率达50％时所对应的sod量为1个sod活力单位(u)。总sod活力(u/mgprot)＝(对照od值-测定od值)/对照od值/50％x反应液总体积/取样量(ml)/待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)。

谷胱甘肽(gsh)的测定按照南京建成生物科技有限公司谷胱甘肽(gsh)测定试剂盒说明书操作完成。按照说明书将样品与各试剂添加完成后混匀，静置5min，420nm处，1cm光径，双蒸水调零，测各管的吸光度值。根据以下公式计算gsh含量：gsh含量(mggsh/gprot)＝(测定od值-空白od值)/(标准od值-空白od值)x标准品浓度(20x10^-3mmol/l)xgsh分子量x样品测试前稀释倍数/待测匀浆蛋白浓度(gprot/l)。

丙二醛(mda)的测定按照南京建成生物科技有限公司丙二醛(mda)测定试剂盒说明书操作完成。过氧化脂质降解产物中的丙二醛(mda)可与硫代巴比妥酸(tba)^*缩合,形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。根据以下公式计算组织中mda含量。mda含量(nmol/mgprot)＝(测定od值-空白od值)/(标准od值-空白od值)x标准品浓度(10nmol/l)/待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)。

结果如图6所示，mn-08能明显升高lps诱导的模型组小鼠肺组织的sod活力(mean＝4.161)和gsh(mean＝0.9836)含量的降低，同时mn-08能明显降低lps诱导的模型组小鼠肺组织mod含量的升高(mean＝4.158)，具有保护肺组织不受氧化攻击的作用。

实施例7、mn-08对肺组织的保护作用。

小鼠造模和给药后，于右肺下叶取lcmxlcmxlcm肺组织，预冷的pbs浸洗后，经4％多聚甲醛溶液固定。脱水和石蜡包埋，制成切片后进行苏木素-伊红(h&e)染色。过程如下：(1)脱蜡：1)将石蜡切片放到65℃烘箱中熔蜡至石蜡全部熔解，室温冷却。2)将切片依次放入两瓶二甲苯中脱蜡，每次10分钟，脱洗2次。3)彻底脱蜡后，将切片依次放入梯度乙醇(100％、100％、90％、90％、80％、80％、70％)中水化，每个浓度水化5分钟。(2)染色：a.移入苏木素中，浸染10min。b.移入水中，洗去苏木素和浮色，约1min。c.移入分化液(1％盐酸乙醇)中分化约30秒钟,使切片褪色至淡兰红色即可。d.移入流水中，洗涤10-30秒，使组织呈鲜兰色或天兰色。e.移入伊红液中，浸染2min，如着染缓慢，可在伊红液中加入冰醋酸(100ml伊红液加1-2滴冰醋酸)以助染。f.移入水中，洗去伊红浮液，并用纱布擦净玻片上的多余染料。(3)脱水透明：经梯度乙醇(浓度由低到高)水化，二甲苯透明。(4)中性树胶封片。

结果如图7所示，mn-08有效的缓解和不同程度的改善了lps诱导的肺组织炎症细胞浸润，肺泡壁增厚、出血及水肿的情况。

实施例8、mn-08对肺组织紧密连接结构蛋白的影响。

小鼠造模和给药后，右肺下叶制成的石蜡切片进行zo-1，claudin-1,jam-1免疫组化染色。过程如下：(1)脱蜡：1)将石蜡切片放到65℃烘箱中熔蜡至石蜡全部熔解，室温冷却。2)将切片依次放入两瓶二甲苯中脱蜡，每次10分钟，脱洗2次。3)彻底脱蜡后，将切片依次放入梯度乙醇(100％、100％、90％、90％、80％、80％、70％)中水化，每个浓度水化5分钟。4)然后将切片全部浸入柠檬酸缓冲液中微波法高火5分钟，中低火10分钟进行抗原修复。5)自然冷却到室温后，将切片放入含有3％h2o2溶液中，避光孵育10分钟。6)将切片放入pbs溶液中冲洗3次，每次5分钟。7)用加了0.3％triton的马血清(10％)覆盖组织后孵育1h。8)吸掉血清，加入zo-1(1：200)，claudin-1(1：200)，jam-1(1：200)一抗，在4℃条件下孵育过夜。9)吸掉一抗，将切片轻轻放入pbs溶液中洗3次，每次5分钟。10)滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(dab试剂盒中提供)覆盖组织，室温孵育60min。11)pbs洗片3次，每次5min，按试剂盒步骤加入现配的dab显色工作液于组织切片上，显微镜下控制染色时间。然后用苏木素进行复染色增强背景对照。12)经梯度乙醇(浓度由低到高)水化，二甲苯透明，最后利用中性树胶封片。

结果如图8所示，mn-08能明显升高lps诱导的模型小鼠肺组织紧密连接结构胞质附着蛋白蛋白zo-1，连接黏附分子jam-1和闭合蛋白claudin-1表达水平的降低，具有保护肺组织紧密连接结构的作用。

实施例9、mn-08对肺组织nf-κb信号通路相关蛋白及mapk信号通路相关蛋白的调控作用。

每组8只小鼠，按照以上方法造模和给药后，每只称取20mg左右的小鼠肺组织，转于至匀浆管中，加200μlripa裂解液(1％proteaseinhibitorcocktail，1％pmsf)，匀浆后在冰上机械裂解。12000r/min，4℃离心15min，取上清。每组取40μl蛋白定量浓度，其它的立即分装后存于﹣80℃冰箱，2周内使用。westernblotting按常规实验方法进行，其中一抗按1：1000比例稀释，二抗按1：2000稀释。

westernblot结果如图9所示，经lps诱导的模型组肺组织p-iκbα和p-nf-κbp65表达量明显增高(p＜0.001),而mn-08的治疗有效的抑制了iκbα的磷酸化水平(p＜0.05),及有效抑制nf-κbp65的核转移(p＜0.001)，减轻急性炎症引起的肺水肿。mn-08的治疗明显地降低了p-jnk、p-erk(p＜0.001)和p-p38mapk(p＜0.01)的表达。

实施例10、mn-08抑制lps诱导的raw264.7细胞上清液促炎因子tnf-α和il-1β的分泌。

elisa试剂盒采用竞争法检测样本中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和白细胞介素-1β(il-1β)的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入辣根过氧化物酶标记识别抗原，在37℃下孵育1h，两者与固相抗原竞争结合形成免疫复合物，经pbst洗涤后，结合的hrp催化tmb(四甲基联苯胺)成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm波长有吸收峰，吸光度值与样本中抗原的浓度成负相关。使用elisacalc进行计算。

结果如图10所示，mn-08可抑制lps诱导的raw264.7细胞上清液促炎因子tnf-α和il-1β的分泌。

实施例11、mn-08对lps诱导的raw264.7细胞nf-κb信号通路相关蛋白、mapk信号通路相关蛋白的调控。

raw264.7细胞接种在25cm²培养瓶中加入药物作用24h后，吸走瓶内原有培养基。用试剂盒提取细胞蛋白。采用bca法蛋白定量，按1：4比例加入5×上样缓冲液后，100℃煮沸5min，冷却后电泳上样。westernblotting按常规实验方法进行，其中一抗按1：1000比例稀释，二抗按1：2000稀释。

结果如图11所示，mn-08抑制lps诱导的raw264.7细胞nf-kbp65的核转移，下调mapk信号通路p38mapk、erk和jnk蛋白的磷酸化水平。mn-08下调lps诱导的raw264.7细胞水平炎性因子inos、cox-2和tnf-α的表达。mn-08上调lps诱导的raw264.7细胞ho-1和nrf2抗氧化蛋白表达。