一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

肿瘤是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率疾病。血管生成是原发和转移性肿瘤的生长的必要条件，早在30～40年代就有学者发现肿瘤组织中血管生长绝对数急剧增多。一旦肿瘤体内有新生血管时，肿瘤细胞迅速增生，瘤体快速生长，且易发生浸润和转移。

继手术、放射治疗和化学治疗后，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗的重要手段。当前，肿瘤生物治疗策略有肿瘤相关基因或肿瘤抑制基因的靶向治疗、肿瘤相关抗原的免疫治疗等，但均由于技术成熟性、有效性、安全性和经济性等问题，在实际应用中受到很大限制。

近年来研究发现，单纯抑制肿瘤血管生成在肿瘤治疗中仍存在一定局限性，若同时联用针对肿瘤细胞的治疗手段，将会产生更加理想的抗瘤效果。因此，以肿瘤新生血管内皮细胞靶标和肿瘤细胞(细胞凋亡靶标)为双靶标的治疗策略成为肿瘤治疗的新方向。

最近有学者研究结果表明，g蛋白偶联受体(gpr124)在血管生长过程中对内皮细胞有迁移和分化作用，gpr124是一种粘附的g-蛋白偶联受体含有一个神秘的rgd序列在其胞外结构域。最近研究表明gpr124缺失导致血管的发育障碍，而过表达则引起血管增多畸形。rgd域(arg，gly，asp)在ecm的几种蛋白质发现，通过结合到细胞表面上的特定的整合素受体介导细胞粘附。gpr124也包含了一个神秘的rgd序列。cullenmike等人利用凝血酶直接切割可溶性gpr124，暴露gpr124的rgd序列，并发现该rgd序列可以与整合素αvβ3结合。在mmp9的水解作用下，可溶性gpr124片段可以与整合素αvβ3调节huvec的黏附与存活，并可能进一步调节血管的生成。这表明gpr124参与血管的生长。

以细胞内物质为靶标的药物(大分子、蛋白质、多肽及核酸)只有穿透细胞膜才能进一步发挥其药效。细胞穿透多肽(穿膜肽)是由少于30个氨基酸残基组成的小肽,它们能够通过与细胞膜相互作用而穿透细胞膜这一天然屏障。穿膜肽大致分为宿主防御肽、基于信号序列的穿膜肽和富含精氨酸的穿膜肽；穿膜肽进入细胞的机制尚未完全阐明,存在倒置微团模型、地毯式模型及打孔模型等假说。穿膜肽能够携带各种物质进入细胞的特性受到人们的关注。

线粒体促凋亡蛋白即smac(thesecondmitochondrialactivatorofcaspase/directiapbindingproteinwithlowpismac/diablo)是一种存在于线粒体并且调节细胞凋亡的蛋白质，通过其n端avpi四肽序列与iaps结合，解除iaps对caspase-9的抑制作用，进而激活caspase－3及csapase级联系统，具有促进细胞凋亡的作用。

综上可知，研发一种更有效、更安全的，可在体内激发有效的特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)应答，同时发挥抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用的双靶标肿瘤疫苗显得尤为重要。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种双靶标肿瘤疫苗，该疫苗既保留了多肽疫苗安全、易于制备纯化的优点，又克服了多肽分子小、免疫原性弱、在体内不易被抗原递呈细胞(apc)摄取等不足，可在体内激发有效的特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)应答，同时发挥抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

由肿瘤血管内皮标志物gpr124重组真核表达质粒和融合肽通过静电作用结合，所述肿瘤血管内皮标志物gpr124重组真核表达质粒由gpr124基因和真核表达载体连接组成，所述gpr124基因具有如seqidno.2所述的核苷酸序列,所述seqidno.2的序列为gpr124全长编码基因，genban的k登录号为nm_054044.2；所述融合肽由穿膜肽与avpi肽连接组成，具有如seqidno.1所述的氨基酸序列。

进一步的，所述真核表达载体为pcdna3.5。

进一步的，所述肿瘤疫苗靶向肿瘤血管内皮标志物gpr124基因和线粒体促凋亡蛋白。

进一步的，所述融合肽由穿膜肽具有如seqidno.3所述的氨基酸序列。

穿膜肽为带正电荷的短肽，可通过电性中和作用与质粒dna聚合形成致密颗粒，显著增强质粒dna在体内外的转染效率。而且，穿膜肽为天然活性肽，可携带多肽、蛋白、寡核苷酸甚至脂质体等大颗粒物质以非内吞的方式进入胞浆，并促进其进入主要组织相容性复合体(mhc)ⅰ类抗原呈递途径，从而激活细胞免疫应答。

本发明的目的之二在于提供了一种双靶标肿瘤疫苗的制备方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1)构建所述肿瘤血管内皮标志物gpr124重组真核表达质粒；

2)制备所述穿膜肽与avpi肽的融合肽；

3)制备所述肿瘤疫苗：于室温、混旋条件下，向含有所述肿瘤血管内皮标志物gpr124重组真核表达质粒的等渗电解质溶液中，滴加所述穿膜肽与avpi肽的融合肽溶液，滴加完毕后，室温下继续混旋60-120分钟，再静置60-120分钟，即得所述肿瘤疫苗。

进一步的，步骤1)先克隆得到gpr124基因，再将其插入真核表达载体pcdna3.5的xbi和ecor1多克隆位点之间，构建肿瘤血管内皮标志物gpr124基因重组真核表达质粒pcdna3.5/gpr124。

进一步的，步骤2)所述融合肽用固相合成法制备，所述融合肽具有如seqidno.1所述的氨基酸序列。

进一步的，步骤3)中所述重组真核表达质粒的浓度为0.5-2.0mg/ml，所述融合肽的浓度为0.5-2.0mg/ml,重组真核表达质粒和融合肽为等体积比滴加。

优选的，步骤3)中所述重组真核表达质粒的浓度为1.0mg/ml，所述融合肽的浓度为1.0mg/ml,重组真核表达质粒和融合肽为等体积比滴加。

进一步的，步骤3)中所述等渗电解质溶液包括pbs、生理盐水、0.9％nacl溶液和5％葡萄糖溶液。

优选的，步骤3)中所述室温下继续混旋的时间为90分钟，静置时间为90分钟。

本发明的目的之三在于提供了一种双靶标肿瘤疫苗的用途。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种双靶标肿瘤疫苗在用于制备抗肿瘤药物中的用途。

所述双靶标肿瘤疫苗靶向肿瘤血管内皮标志物gpr124基因和线粒体促凋亡蛋白，肿瘤血管内皮标志物gpr124基因可以与整合素αvβ3调节huvec的黏附与存活，并可能进一步调节血管的生成。这表明gpr124参与血管的生长。线粒体促凋亡蛋白通过其n端avpi四肽序列与iaps结合，解除iaps对caspase-9的抑制作用，进而激活caspase－3及csapase级联系统，具有促进细胞凋亡的作用。因此，该双靶向肿瘤疫苗具有抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，大大提高肿瘤治疗的有效性和安全性。所述肿瘤包括肺癌、胃癌、肝癌、结肠/直肠癌、食管癌、膀胱癌、胰腺癌、白血病、淋巴瘤、脑肿瘤等。

本发明的有益效果在于：融合肽带正电荷，可以与带负电荷的gpr124基因重组真核表达质粒通过静电相互作用聚缩形成与天然病毒大小相近的致密颗粒。因具有颗粒性和穿膜肽的穿膜活性，在体内易于被apc摄取，gpr124基因重组真核表达质粒在apc细胞内表达gpr124，穿膜肽可有效促进gpr124进入mhc-ⅰ类抗原呈递途径，从而激发有效的针对肿瘤新生血管内皮细胞的特异性ctl应答。同时，其表面的avpi肽可以被肿瘤新生血管内皮细胞及肿瘤细胞表面的整合素受体介导摄取，从而抑制肿瘤新生血管内皮细胞的粘附和迁移，并且促进caspase-3及csapase级联系统，促进肿瘤细胞的凋亡。

因此，1)本发明的双靶向肿瘤疫苗既保留了多肽疫苗安全、易于制备纯化等优点；2)又克服了多肽分子小、免疫原性弱以及不易被apc摄取等不足；3)可以发挥同时抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，大大提高肿瘤治疗的有效性和安全性，在肿瘤治疗领域具有良好的应用前景。

附图说明

附图1为gpr124基因pcr产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

附图2为gpr124基因重组真核表达质粒双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

附图3为穿膜肽与avpi肽的融合肽的高效液相色谱鉴定图；

附图4为穿膜肽与avpi肽的融合肽的质谱鉴定图。

附图5为肿瘤疫苗抑制肿瘤血管生成活性的检测，图5a为绘制肿瘤生长曲线，图5b为小鼠生存率检测。

附图6为肿瘤疫苗诱导肿瘤细胞凋亡活性的检测。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1gpr124基因重组真核表达质粒pcdna3.5/gpr124的制备

(1)gpr124全长编码基因的克隆

根据genbank登录号为nm_054044.2的gpr124基因序列，设计并合成pcr引物以扩增gpr124全长编码基因；以人胎盘cdna文库为模板进行pcr，pcr条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒、56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸5分钟；pcr产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与载体pgem-t连接，连接产物转化大肠杆菌jm109感受态细胞，用含有amp、iptg、x-gal的培养基进行蓝白斑筛选，挑取白斑培养，提取质粒，委托上海生工公司测定基因序列，将序列正确的阳性克隆质粒命名为pgem-t/gpr124；

pcr产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图如附图1所示，其中m泳道为dna分子量标准，1泳道为pcr产物，可见1泳道在约1000bp处呈单一特异性条带，与预期结果相符；质粒的测序结果显示插入基因序列与gpr124全长编码基因序列(seqidno.2)一致。

(2)gpr124基因重组真核表达载体的制备

根据gpr124全长编码基因序列和真核表达载体pcdna3.1的多克隆位点，设计并合成pcr引物以扩增包含gpr124全长编码基因、5’端xbi酶切位点和3’端ecor1酶切位点的cdna片段；以pgem-t/gpr124为模板进行pcr，pcr条件与步骤(1)相同；pcr产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，用限制性内切酶xbi和ecor1进行双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经xbi和ecor1双酶切的pcdna3.5在t4dna连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌top10感受态细胞，用含有amp、iptg、x-gal的培养基进行蓝白斑筛选，挑取白斑培养，提取质粒，用xbi和ecor1进行双酶切鉴定，并委托上海生工公司测定基因序列，将序列和阅读框架正确的阳性克隆质粒命名为pcdna3.5/gpr124；

重组真核表达质粒双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图如附图2所示，其中m泳道为dna分子量标准，1泳道为双酶切产物，可见1泳道在约3500bp和1000bp处出现两条电泳带，与预期结果相符；质粒的测序结果显示插入基因序列无突变，阅读框架正确，无移码。

实施例2穿膜肽与avpi肽的融合肽的制备

融合肽由穿膜肽的羧基端与avpi肽的氨基端直接连接而成，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

融合肽在ab-431a型多肽合成仪上固相合成，采用标准芴甲氧羰基(fmoc)方案，以0.25mmol的对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(hmp)树脂为起始树脂，按照seqidno.1的氨基酸序列，使肽链自羧基端向氨基端逐个延伸，肽链合成完毕后，将含有肽链的树脂转移至切割液(由酒石酸乙二胺0.25ml、三氟乙酸9.5ml和去离子水0.25ml组成)中，室温下搅拌反应使肽链从树脂上裂解下来，反应液用g6玻砂漏斗过滤，收集滤液，室温下低压蒸干，残余物用去离子水溶解后，用explorer100型中压液相色谱仪进行纯化，色谱柱为c18柱，流动相a为质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相b为质量分数为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相b的体积分数在0～15分钟内由10％上升至50％，流速为1ml/min，收集融合肽的洗脱液，冷冻干燥，即得融合肽，用去离子水溶解制成浓度为3mg/ml的溶液，用孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤除菌，-70℃冻存备用。

融合肽的洗脱液用delta600型反相高压液相色谱仪进行纯度鉴定，色谱柱为symmetryc18柱，流动相a为质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相b为质量分数为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相b的体积分数在0～15分钟内由10％上升至60％，流速为1ml/min，所得高效液相色谱鉴定图如附图3所示，经峰面积归一化法计算，融合肽的纯度为99％。

融合肽的洗脱液用api2000lc/ms/ms型质谱仪进行分子量鉴定，所得质谱鉴定图如附图4所示，融合肽的分子量测定值与理论值相符。

实施例3肿瘤疫苗的制备

于室温、混旋条件下，向1体积份含有浓度为1mg/ml的pcdna3.5/gpr124和浓度为1mg/ml的pbs的水溶液中，滴加1体积份浓度为1mg/ml的融合肽融合肽溶液，滴加完毕后，继续混旋60分钟，再静置60分钟，即得肿瘤疫苗。

实施例4肿瘤疫苗的制备

于室温、混旋条件下，向1体积份含有浓度为1.5mg/ml的pcdna3.5/gpr124和浓度为1mg/ml的pbs的水溶液中，滴加1体积份浓度为1.5mg/ml的融合肽融合肽溶液，滴加完毕后，继续混旋120分钟，再静置120分钟，即得肿瘤疫苗。

实施例5肿瘤疫苗的制备

于室温、混旋条件下，向1体积份含有浓度为0.5mg/ml的pcdna3.5/gpr124和浓度为1.0mg/ml的pbs的水溶液中，滴加1体积份浓度为0.5mg/ml的融合肽溶液，滴加完毕后，继续混旋90分钟，再静置90分钟，即得肿瘤疫苗。

实施例6抑制肿瘤血管生成活性的检测

将荷瘤裸鼠随机分为三组：对照组ⅰ、对照组ⅱ和实验组，对照组ⅰ尾静脉注射生理盐水；对照组ⅱ尾静脉注射融合肽与pcdna3.5的复合物；实验组尾静脉注射本发明所述肿瘤疫苗；观察60天内各组小鼠的生存率和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；60天后，取小鼠体内肿瘤组织进行病理切片检查，并用免疫组化法检测肿瘤新生血管密度(以抗cd31单克隆抗体为一抗)。

结果：与对照组ⅰ和对照组ⅱ相比，实验组小鼠生存率高(附图5b)，肿瘤生长缓慢且肿瘤新生血管密度降低(附图5a)。

实施例7诱导肿瘤细胞凋亡活性的检测

实验随机分为三组：对照组ⅰ、对照组ⅱ和实验组，对照组ⅰ用pbs处理ct-26细胞(小鼠结肠癌细胞)；对照组ⅱ用融合肽与pcdna3.5的复合物处理ct-26细胞；实验组用本发明所述肿瘤疫苗处理ct-26细胞，共培养48小时后，pbs洗涤，再加入浓度为250μg/ml的异硫氰酸荧光素(fitc)标记的磷脂结合蛋白v(annexinv)5μl和浓度为250μg/ml的碘化丙啶(pi)5μl，冰浴避光孵育10分钟，pbs洗涤，用facscalibur流式细胞仪检测细胞凋亡情况：正常活细胞annexinv和pi均低染；凋亡细胞annexinv高染而pi低染；坏死细胞annexinv和pi均高染。

结果：对照组ⅰ的细胞凋亡率为6.8％，对照组ⅱ的细胞凋亡率为7.2％，实验组的细胞凋亡率为62.1％，表明本发明所述肿瘤疫苗能够有效诱导肿瘤细胞的凋亡(如附图6)。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>重庆医科大学附属永川医院

<120>一种双靶标肿瘤疫苗及其制备方法和应用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<213>人工序列

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