祛铁药物在制备H7N9型禽流感防治药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种祛铁药物去铁胺在制备h7n9型禽流感防治药物中的应用。

背景技术：

h7n9型禽流感是一种禽流感病毒，属正粘病毒科甲型流感病毒属。h7n9亚型禽流感病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于h9n2禽流感病毒。该病毒主要的传染源是活禽，人接触该病毒传染源以后会发生禽流感感染，在感染h7n9禽流感病毒后出现急性呼吸道传染病症状，主要表现为发热、咳嗽、咳痰、胸痛、呼吸困难等，目前针对h7n9型禽流感尚无特效疫苗，其发病机制仍有待进一步探索。

铁是人体必需的微量元素之一，铁代谢平衡紊乱会导致严重的疾病。铁也是细菌病毒生长的必需元素，这些微生物从周围环境中摄取铁来维持自身的生长繁殖。宿主机体通过铁缺乏阻止感染部位的铁活性反应并抑制病原微生物的生物活性，该方式称为营养免疫，在机体天然免疫中发挥着重要的作用。

目前已知机体铁稳态与多种病毒感染有关，比如hiv、乙肝病毒等有关。

去铁胺能清除铁蛋白和含铁血黄素中的铁离子，但对转铁蛋白中的铁离子清除作用不强，更不能清除血红蛋白、肌球蛋白和细胞色素中的铁离子。主要用于急性铁中毒的解救药。由于本品与其他金属的亲和力小，故不适于其他金属中毒的解毒。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供祛铁药物去铁胺在制备h7n9型禽流感防治药物中的应用，为h7n9型禽流感防治疗法提供基础。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种祛铁药物在制备h7n9型禽流感防治药物中的应用，该祛铁药物为去铁胺。

作为本发明的祛铁药物在制备h7n9型禽流感防治药物中的应用的改进：为预防和/或治疗h7n9型禽流感。

作为本发明的祛铁药物在制备h7n9型禽流感防治药物中的应用的进一步改进：所述去铁胺降低患者的血清铁含量，从而达到防治h7n9型禽流感的作用。

在发明过程中，本发明人发现感染h7n9型禽流感患者体内的血清铁含量低于正常不患病群体。为了确定铁代谢在h7n9型禽流感中是否发挥作用，发明人收集了42例h7n9型禽流感患者的血清和83例正常人的血清，结果显示，h7n9型禽流感患者血清中自由铁含量较低，受试者工作曲线显示自由铁含量与h7n9型禽流感患病情况高度相关。由此可见，血清铁降低在机体对抗h7n9禽流感感染中发挥着重要的作用。

本发明人进一步发现在小鼠体内低铁能有效地保护机体免受到h7n9型禽流感病毒的侵扰，通过诱导野生型小鼠机体内铁失衡后发现，去铁胺注射组小鼠能明显抵抗h7n9型禽流感病毒的感染，表现为体重变化较少，生存率较高，病毒滴度较低，肺部没有明显的病理改变等生理现象。

进一步地通过小鼠模型证实：机体内铁含量降低有助于抵抗h7n9型禽流感病毒的感染。该研究结果为低铁在防治h7n9型禽流感中的作用提供了理论依据，特别是对预防h7n9型禽流感的药物研发提供了基础。

综上所述，本发明公开了祛铁药物在制备h7n9型禽流感防治药物中的应用，该祛铁药物为去铁胺；所述h7n9型禽流感防治药物用途为预防和/或治疗h7n9型禽流感；去铁胺降低患者的血清铁含量，达到防治h7n9型禽流感防治药物的作用。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了h7n9型禽流感患者体内血清铁降低的依据，并通过小鼠实验进一步证实了机体铁水平降低有助于抵抗h7n9型禽流感病毒的感染，为h7n9型禽流感的防治提供了理论依据和预防药物研发提供了基础。

本发明在发明过程中，还同时采用口服祛铁剂地拉罗司灌胃处理小鼠，在有效剂量超过本发明的前期下，结果发现其对h7n9型禽流感的预防感染效果远远没有本发明的去铁胺明显。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为人群样本血清铁含量分析图；

图1中，

a是h7n9型禽流感患者体内的血清铁和正常对照组体内的血清铁的含量示意图；

b是受试者工作曲线，其中曲线面积越大，表明血清铁降低作为判断h7n9型禽流感患病的价值越大，以误判度为横坐标(1-specificity)，以灵敏度为纵坐标(sensitivity)。

图2为小鼠机体的各项生理参数的测试结果图；

图2中，

a为小鼠铁稳态失衡造模示意图，搭建去铁胺注射组，高铁组以及对照组；

b为小鼠未感染病毒前及感染病毒5天后，小鼠肝脏、肺脏、血清中非血红素铁含量；

c为铁稳态失衡以及正常膳食喂养的小鼠感染病毒20天内小鼠的体重变化曲线，其中去铁胺注射组以及所述高铁组小组均为铁稳态失衡小组；

d为铁稳态失衡以及正常膳食喂养小鼠感染病毒20天内小鼠的生存曲线；

e为铁稳态失衡以及正常膳食喂养小鼠感染病毒后小鼠体内的病毒滴度情况；

f为铁稳态失衡以及正常膳食喂养小鼠感染病毒后小鼠的肺脏he染色情况；

图2的数据表明降低铁有助于抵抗h7n9型禽流感的感染。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

去铁胺：desferrioxamineb，为一种螯合剂，主要与三价离子和三价铝离子络合形成复合物，其复合物形成常数分别为1031和1025；但对二价离子如亚铁(fe++)、铜(cu++)锌(zn++)及钙(ca++)等的亲和力很低，其复合物形成常数为1014或更低。螯合作用以1：1克分子的基础上进行。

实验1、感染h7n9型禽流感患者体内的血清铁含量低：

1.1血清样本

血清样本选自：42例h7n9型禽流感患者的血清和83例正常人的血清样本。

这些血清样本均来自浙江大学医学院附属第一医院，其中h7n9型禽流感患者的患者经病毒培养确定感染病毒类型，正常人血清来源于正常体检者。

1.2检测方法：

将患者血清以及正常人血清分别用iron/tibc/17504-60/pointescientificinc试剂盒检测，检测方法依据说明书说明。

1.3数据结果分析：

检测数据结果图如图1a、b所示：

图1a为42例h7n9型禽流感患者的血清(patient)和83例正常人的血清(control)血清铁含量测量结果；

由图可知，图1a中，竖坐标为自由铁含量，单位为ug/dl，patien为h7n9禽流感患者组，control为正常人组，其中patient组的自由血清铁的含量远远低于control组的自由血清铁的含量，也就是说，所述h7n9型禽流感患者的血清铁含量远低于正常人的血清铁含量，也表明血清铁降低和机体对抗h7n9禽流感感染有着密切关系。

图1b图为受试者的工作曲线，该工作曲线为图1a中基于h7n9患者的病理数据得到的统计曲线，其中弯曲线表示自由铁含量，直线表示参考曲线，而在所述工作曲线当中，误判度为横坐标(1-specificity)，以灵敏度为纵坐标(sensitivity)，曲线下面积越大，表明血清铁降低作为判断h7n9型禽流感患病的价值越大，进一步地表情血清铁降低在机体对抗h7n9禽流感感染中发挥着重要的作用。

实验2、建立小鼠模型，证明小鼠体内低铁能有效地保护机体免受到h7n9型禽流感病毒的侵扰。

2.1实验动物：

选择6周龄spf级balb/c雄性小鼠，小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，在spf环境饲养。用标准饲料ain-76a(铁含量50mg/kg，researchdiets,inc)适应喂养一周后，按体重随机分组，每组6～8只，设置为对照组(mid)，高铁组(high)，以及治疗组(low)。

2.2病毒感染：

根据实验设计，对照组小鼠用基础饲料喂养5周；

高铁组小鼠先用基础饲料喂养2周，再用高铁饲料(铁含量8.3g/kg，researchdiets,inc)喂养3周；

治疗组小鼠用去铁胺腹腔注射5周(隔天一次，每次100mg/kg)；且所用饲料为正常基础饲料；

所述对照组，所述高铁组以及所述治疗组的小鼠在最后2周(即，第21天)均在通过鼻腔吸入的方式感染病毒一次，该病毒来源于浙江省疾病预防与控制中心，小鼠铁稳态失衡造模的情况如图2a所示。

2.3样本提取：

针对对照组，高铁组以及治疗组三组小鼠，均用5％水合氯醛腹腔麻醉后，心脏采血，分离出小鼠血清并收集小鼠的肝肺组织，其中肝肺组织用液氮保存，以备检测所需。

在本实验中，在小鼠未感染病毒前，即造模的第20天，以及在小鼠感染病毒5天后，即造模的第26天分别分离小鼠血清，肝脏以及肺脏的血清。

2.4测定与结果：

2.4.1血清铁、组织非血红素铁以及血清储铁蛋白测定

血清铁和组织非血红素铁含量用iron/tibc/17504-60/pointescientificinc试剂盒检测，检测方法依照说明书。

其中值得注意的是，血清铁含量测试的是瞬态的铁含量，所述肝脏和肺脏非血红素铁含量测试的是稳态的铁含量。

测试结果：

如图2b所示，图中control组指的是小鼠未感染病毒的情况，h7n95dpi指的是小鼠在感染h7n9病毒5天后的情况，low指的是治疗组(去铁胺注射组)，mid指的是对照组，high指的是高铁组，liver指的是肝脏，lung指的是肺脏，serum指的是血清，图2b的竖坐标分别指的是非红血素铁含量以及血清铁的含量，单位分别为ug/gtissue以及ug/dl。

对于治疗组(low)来说，各个组织/器官中的非血红素铁以及血清铁含量在感染h7n9前后并无太大的变化；对于对照组(mid)来说，肺脏组织以及血清组织中的非血红素铁以及血清铁含量在感染h7n9前后有减少的趋势，肝脏组织中非血红素铁以及血清铁含量在感染h7n9之后有增加的趋势。对于高铁组(high)来说，肺脏组织以及血清组织中的非血红素铁以及血清铁含量在感染h7n9前后有减少的趋势，肝脏组织中非血红素铁以及血清铁含量在感染h7n9之后有增加的趋势。且不论是在感染h7n9禽流感病毒的前后，低铁组(low)中各组织/器官的非血红素铁以及血清铁含量均最低。

2.4.2体重检测

取三组小鼠检测从感染h7n9病毒起20天内的小鼠体重。

测试结果：

如图2c所示，竖坐标为原始重量比，单位为％，三组小鼠的体重变化趋势类似，但治疗组(low)小鼠体重变化趋势最小，对照组(mid)小鼠体重变化趋势适中，高铁组(high)小鼠体重变化趋势大。数据表明，感染h7n9病毒的治疗组小鼠体重较其他两组变化不明显，由此侧面反映治疗组小鼠有抵抗h7n9病毒的趋势。

2.4.3生存率检测：

统计三组小鼠在感染h7n9病毒起20天内的生存情况。

测试结果：

如图2d所示，竖坐标为生存率，单位为％，治疗组(low)小鼠在将近感染病毒10天后开始出现死亡，并且在20天内的生存率为90％。对照组(mid)小鼠在感染病毒第6天后出现死亡，并且20天内的生存率为70％，高铁组(high)小鼠在感染病毒第5日天后开始死亡，并且20天内的生存率不到60％，可明显地展示治疗组的生存率远高于所述对照组和所述高铁组，由此侧面反映治疗组小鼠有抵抗h7n9病毒的趋势。

2.4.4病毒滴度检测：

在mdck细胞中采用组织培养物(细胞)半数致死计量得到h7n9病毒的浓度。

如图2e所示，检测结果：竖坐标为log10tcid50，单位为ml,数据表明，在感染剂量同样病毒的情况下，治疗组(low)小鼠体内病毒数量下降，反映了治疗组小鼠机体抗感染能力强。

2.4.5肺部组织切片he染色：

将三组小鼠感染病毒前后的肺脏固定于10％的甲醛溶液，石蜡包埋切片，用半草酰亚胺和伊奥辛溶液(he)染色。

检测结果：

如图2f所示，control组为小鼠未感染h7n9病毒时的切片he染色情况，mid为对照组，high为高铁组，low为治疗组。如图所示，相较于control组的he染色情况，-高铁组(high)肺部炎症明显，表现为白细胞浸润，并可见明显的出血和充血病变，而治疗组(low)的肺脏未见明显病变。

2.6统计方法

本发明中统计采用spss软件分析，实验数据采用mean±sd表示。两组间比较使用student'st-test检验，多组数据之间的比较使用anova检验；生存曲线使用log-ranktest分析,受试者工作曲线使用预测分析。以p<0.05认为有统计学意义。

总结而言，最终结果显示，低铁组小鼠感染病毒后体重变化不明显图2c)，生存率较正常膳食喂养组高(图2d)，体内病毒滴度低(图2e)，肺脏病变较轻(图2f)。铁螯合剂目前常在临床上用于难治性铁过载。该研究提示，机体低铁有助于抵抗h7n9型禽流病毒对宿主的感染，基于此，为铁螯合剂在防治h7n9型禽流感中的作用提供了理论依据，特别是对预防h7n9型禽流感的药物研发提供了基础。本发明的去铁胺可被应用于制备预防h7n9禽流感的药物中，以预防和/或治疗h7n9型禽流感。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。