一种靶向聚合物制备方法、靶向脂质体、脂质体靶向制剂的制备方法及应用与流程

本发明涉及一种靶向药物系统、具体涉及一种用于靶向药物系统中的靶向聚合物、靶向聚合物的制备方法、靶向脂质体、脂质体靶向制剂及其制备方法。

背景技术：

肝细胞癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。化疗是肝癌临床治疗的主要策略之一。然而，各种临床研究表明，传统的细胞毒性化疗药物，如阿霉素、紫杉醇等，由于全身毒性、缺乏选择性和耐药性，临床疗效有限。所以，寻找一种新的治疗方案以解决此类问题的需求是非常迫切的。在临床上，两种或两种以上药物通过不同的抗肿瘤方法联合治疗的效果越来越明显，抗血管生成是一种很有前途的抗肿瘤策略，通过阻断肿瘤血管的发展。因此，将化疗药物与抗血管生成药物联合使用，可以更有效地提高治疗效果。

姜黄素(cur)是一种从姜黄根茎中提取出来的二酚类化合物，具有抗前列腺癌、乳腺癌和结肠癌的强效作用，被认为是第三代抗癌药物。它可以通过抑制增殖来调控信号通路，从而抑制癌细胞生长并诱导细胞凋亡。亲水性药物康普瑞汀磷酸二钠是一种以血管为靶点的新型抗肿瘤化合物，是可溶性磷酸盐康普瑞汀的前体药物。康普瑞汀磷酸二钠((ca4p)主要作用于肿瘤的血管内皮细胞，引起肿瘤血管收缩功能障碍，导致肿瘤细胞因供血不足而死亡。但是二者在临床应用上均具有一定的局限性，如：姜黄素属于脂溶性药物，在水中溶解度低，康普瑞汀磷酸二钠在体内的半衰期较短，影响疗效的发挥。还存在着多药耐药、系统性毒性以及非特异性的缺点。所以，寻求一种新的药物剂型，对于实现提高两药联用的治疗效果得同时降低系统性毒副作用方面是非常必要的。

药物递送系统(dds)提供了一个可以实现有效地共同递送多种药物的机会，且已有多种纳米载药系统上市和进行临床实验阶段。在不同的纳米载体中，脂质体(liposomes，lps)受到越来越多的关注，其结构包含亲水核和疏水壳，对亲水、疏水和两性药物具有显著的包封强度，解决药物的溶解性问题。此外，脂质体相对于其他药物传递载体具有显著的优势，包括能降低全身毒性，适当的粒径可增强实体肿瘤的特异性积累，结构的灵活性可增强药物的持续释放等。再者，脂质体具有被动靶向性，很容易被巨噬细胞所代表的单核细胞吞噬。静脉给药可选择性聚焦于单核吞噬细胞系统，70％～89％聚焦于肝脾，所以对于治疗肝肿瘤和预防肿瘤转移比较有优势。

技术实现要素：

发明目的：本发明提供了一种靶向聚合物制备方法。本发明的另一目的是提供了利用靶向聚合物制备的靶向脂质体。本发明还提供了脂质体靶向制剂的制备方法及应用。

技术方案：为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种靶向聚合物制备方法，包括以下步骤：(1a)将甘草次酸溶于有机溶剂，加入缩合剂，搅拌1-2h，去除有机溶剂，将所得固体加入到乙二胺中，室温搅拌12-24h，去除乙二胺，提纯得到经乙二胺改性的甘草次酸；(1b)将dspe-peg-nhs与步骤(1a)得到的改性的甘草次酸，按照摩尔比为1:1-10溶于有机溶剂中，氮气保护下反应室温反应36-48h，反应结束后，进行反应物提纯，得到靶向聚合物二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-甘草次酸(dspe-peg-ga)。

优选地，步骤(1a)中，所述缩合剂为dmt-mm，所述甘草次酸、缩合剂与乙二胺的质量比为1-1.5:0.5-1.5:5-30。

优选地，步骤(1b)中，在所述有机溶剂中加入ph调节剂和催化剂，所述ph调节剂为三乙胺，所述催化剂为edc。本发明中的靶向聚合物的反应原理如图(1)所示，本发明的靶向聚合物的制备包括以下步骤：

如图1a所示，先将甘草次酸(ga)溶于有机溶剂甲醇中，加入缩合剂4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmt-mm)，置于反应容器中反应，室温下搅拌，旋蒸除去甲醇，将所得的固体缓慢加入到乙二胺中，室温搅拌过夜，旋蒸除去乙二胺，旋蒸后的固体用乙醇溶解，超声，加入硅胶粉，旋蒸除去乙醇，得到粉末状固体，经分离纯化后得到经过乙二胺修饰的甘草次酸(ga-n)粉末，分离纯化的具体步骤为：将硅胶粉溶解在乙酸乙酯中，导入柱子，使硅胶沉积，形成致密的硅胶柱；上样：将ga-n粉末缓缓倒入柱内，加乙酸乙酯，使得液面不低于粉末；洗脱：将体积比为2:1的乙酸乙酯和乙醇作为展开剂，加入柱内进行洗脱；收集：样品加入时开始收集，收集过程中进行tlc检测，待出现样品点为止。

如图1b所示，将修饰后的甘草次酸溶于二甲基亚砜，随后加入dspe-peg-nhs粉末，可视反应情况，加edc催化反应，在反应体系中加入少量ph调节剂三乙胺以调节ph，氮气保护下反应，将所得的反应产物透析，冷冻干燥得dspe-peg-ga固体。

本发明第二方面提供了上述制备的靶向聚合物在肝脏靶向给药系统中的应用。

本发明第三方面提供了利用上述制备的靶向聚合物制备的靶向脂质体，所述靶向脂质体包含质量比为1-10:3-30:2-20的靶向聚合物、磷脂和胆固醇。ga分子的引入增强了整个脂质体体系的主动靶向性，肝细胞膜上存在ga的特异性受体，与ga特异性结合。因此，与未修饰的脂质体相比，ga修饰的脂质体对肝癌细胞和组织有更理想的主动靶向作用，这将有利于进一步提高其抗肿瘤疗效。

本发明中的磷脂可选自天然磷脂，也可选自合成磷脂，优选地，所述磷脂选自大豆磷脂、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的一种或多种。

进一步地，本发明中的磷脂可全部选自天然磷脂，如大豆磷脂、卵磷脂中的一种或几种；本发明的磷脂也可全部来自合成磷脂，如二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)中的一种或多种。

本发明的靶向脂质体采用薄膜分散法制备，优选地，制备靶向脂质体采用的介质为ph＝7.4的pbs缓冲液，其作用为乳化磷脂和胆固醇以形成纳米脂质体。

本发明第四方面提供了脂质体靶向制剂，具体为在上述靶向脂质体中负载药物姜黄素和康普瑞汀二钠；所述脂质体靶向制剂包含脂质体、姜黄素和康普瑞汀二钠；所述姜黄素与所述磷脂的质量比为1:20-60；所述姜黄素与所述康普瑞汀二钠的质量比为10-1:1-10。

本发明第五方面提供了脂质体靶向制剂的制备方法，具体为包含以下步骤：(2a)将磷脂、胆固醇，dspe-peg-ga，溶解于有机溶剂中，加入姜黄素溶解，旋蒸除去有机溶剂，待形成一层均匀的薄膜时，加入康普瑞汀二钠水溶液进行水化，水化时间为30-60min；(2b)将步骤(2a)中经过水化的溶液超声处理，超声时间为5-10min，随后除去未包封的游离药物，得脂质体靶向制剂。

步骤(2a)中，所述dspe-peg-ga、磷脂和胆固醇质量比为1-10:3-30:2-20；所述姜黄素与所述磷脂的质量比为1:20-60；所述姜黄素与所述康普瑞汀二钠的质量比为10-1:1-10。

进一步地，步骤(2a)中的有机溶剂可选用三氯甲烷(氯仿)或者乙醚，旋蒸仪旋蒸的条件可为：转速为15-60rpm，水浴温度为30-40℃。待形成均匀的薄膜后，加入康普瑞汀磷酸二钠pbs水溶液进行水化，水浴温度为35-60℃，水化时间为30-60min。

进一步地，除去游离药物选用透析法和过g-50层析柱的方法。

游离的cur去除方法如下：(1)在g-50粉末中加入蒸馏水浸泡，浸泡完毕后装柱，使用蒸馏水填充层析柱烧结板下端的死区，将溶胀好的凝胶缓慢灌入层析柱中，装柱完毕后加样；(2)加样前，先打开出口，让水流出，待只留下极薄的一层水后，关闭出水口，用将样品垂直缓慢地加入柱内；(3)洗脱：预留水层，保证层析柱表面不干涸，用pbs进行洗脱；收集样品：从样品一加进凝胶柱时就开始收集，得到去除游离cur的样品。

游离ca4p的去除方法如下：把制备好的样品装入透析袋，透析介质为pbs溶液。

进一步地，制备完成后，将所得的脂质体依次过膜孔径为450nm，220nm的聚醚砜膜方法对脂质体的粒径进行控制，得到粒径范围在120～240nm的靶向共载脂质体，并对其进行一系列的理化性质测定，包封率在60％-90％，载药量范围0.7％-6％。

将上述所得的共载姜黄素和康普瑞汀磷酸二钠的靶向制剂在肝癌治疗方面的应用。

除非另有说明，本发明中的“％”为质量百分比。

有益效果：(1)本发明的靶向聚合物中引入ga分子，肝细胞膜上存在ga的特异性受体，与ga特异性结合，与未修饰的脂质体相比，ga修饰的脂质体对肝癌细胞和组织有更理想的主动靶向作用，使得脂质体递送药物的准确性提高，运送药物到达靶标部位进行释放，更好的发挥抗肿瘤作用；(2)本发明中通过靶向聚合物制备的靶向脂质体，脂质体作为载药体系，一方面解决了药物溶解性的问题，将难溶于水的cur封装在脂质体的疏水层中，由其运送到细胞内发挥作用；另一个方面可以实现药物缓释，同时使两种药物在一定时间内呈现缓释趋势，作用时间延长：ca4p诱导的血管参数的改变是短暂的，治疗4小时后ca4p降低kht肿瘤血流量，但在20h后血流恢复到基线水平，经过脂质体包载后，药物是以缓慢而连续的形式进行释放，增加了在体内的循环时间，从而起到了有效的治疗作用；(3)本发明采用姜黄素和康普瑞汀磷酸二钠两种药物联合，将抗肿瘤细胞增殖药物与抗肿瘤血管生成药物的联用，通过抑制肿瘤细胞增殖和抗肿瘤血管生成两种途径达到协同抗肿瘤的效果，并解决了单一药物长期治疗所产生的肿瘤耐药性问题。脂质体作为药物载体解决了姜黄素的溶解性问题，同时使两种药物在一定时间内呈现缓释趋势，作用时间延长，本发明的共载药物从不同途径治疗肝癌，在肝癌的治疗中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明中靶向聚合物的反应原理图；

图2为本发明中dspe-peg-nhs、ga-n和dspe-peg-ga的¹h核磁共振谱，其中，a:ga-n的峰值为0.7-1.5ppm，b:dspe-peg-nhs的峰值为3.6ppm。

图3为ca4p/ga-lps示意图。药物装载系统由疏水层、亲水核以及连接在表dspe-peg-ga组成。分别将亲水性的ca4p和疏水性的cur加载到水内芯和疏水层中；

图4为脂质体性能表征图：其中a为空白脂质体tem图像，b为cur&ca4p/ga-lpstem图像，c为cur&ca4p/ga-lps粒度分布图；

图5为cur&ca4p/ga-lps中cur和ca4p的体外释放图；

图6为摄取靶向共载脂质体的细胞荧光显微图，其中a为cur&ca4p/lps孵育的bel-7402细胞的荧光显微图，b为cur&ca4p/ga-lps孵育的bel-7402细胞的荧光显微图；

图7为脂质体细胞毒性评价结果，其中a为空白脂质体、游离cur，物理混合cur+ca4p，cur&ca4p/lps和cur&ca4p/ga-lps处理bel-7402细胞24小时后的细胞存活率，b为空白脂质体、游离cur，物理混合cur+ca4p，cur&ca4p/lps和cur&ca4p/ga-lps处理b16细胞24小时后的细胞存活率，c为不同样品对bel-7402处理24h、48h和72h的细胞存活率；d为不同样品对b16细胞处理24h、48h和72h的细胞存活率；

图8为肿瘤细胞迁移抑制率评价结果，其中a为不同样品对bel-7402细胞的迁移抑制结果，b为不同样品对b16细胞的迁移抑制结果，c为通过image-pro6.0测量bel-7402细胞的疤痕从0h到24h的平均宽度计算出的迁移率(％)结果，d为通过image-pro6.0测量b16细胞的疤痕从0h到24h的平均宽度计算出的迁移率(％)结果；

图9为h22荷瘤小鼠注射游离dir和dir/ga-lps后nir图像；

图10为靶向共载脂质体的体内抗肿瘤效能的评价结果：其中a为小鼠体重，b为处死小鼠剥离的肿瘤组织；c为h22荷瘤小鼠经生理盐水和各种药物制剂组静脉注射后的抗肿瘤效果，d为不同药物制剂对肿瘤生长抑制率；

图11为肿瘤组织的组织学分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作出进一步说明。

一、原材料及仪器

1.1原材料来源

姜黄素(cur)、卵磷脂、胆固醇(chol)、交联葡聚糖tmg-50、mtt、dapi、rpmi-1640培养基、胎牛血清(fbs)、青链双抗、胰蛋白酶、苏木素、伊红，来自北京solarbio有限公司；

康普瑞汀磷酸二钠(ca4p)，来自北京innochem科技有限公司；

甘草次酸(ga)，来自富捷制药有限公司；

4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmt-mm)，来自上海medpep有限公司

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，来自阿拉丁试剂数据库公司；

荧光探针(dir)，来自北京潘波生物化学有限公司；

1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-n-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇(dspe-peg-nhs)，来自西安日西科技有限公司；

人肝癌细胞bel-7402和黑色素瘤细胞b16，来自武汉大学生活收藏中心；

鼠肝癌细胞h22，来自武汉凯基生物科技有限公司。

1.2仪器

旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；

电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

气浴恒温振荡器，金坛市医疗仪器厂；

生物组织包埋机、电脑超薄切片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；

倒置荧光显微镜，日本尼康；

正置荧光显微镜，日本奥林巴斯；

超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；

malvernzetasizernanozs90激光粒度仪，英国malvern公司；

核磁共振仪，日本jeol。

二、样品制备

实施例1：合成靶向分子dspe-peg-ga

(1)合成ga-n

精密称取ga1.41g溶于30ml甲醇中，并加入0.976g缩合剂dmt-mm，此体系置于100ml的茄形瓶中反应，室温下搅拌1h，tlc检测生成中间产物ga-es，37℃旋蒸除去甲醇，将所得的固体缓慢加入到30ml的乙二胺中，室温搅拌过夜。60℃旋蒸除去乙二胺，旋蒸后的固体用乙醇溶解，超声，加入硅胶粉，旋蒸除去乙醇，得到粉末状固体，分离纯化：硅胶粉溶解在乙酸乙酯中，导入柱子，使硅胶沉积，形成致密的硅胶柱；上样：将粉末缓缓倒入柱内，加乙酸乙酯，使得液面不低于粉末；洗脱：将体积比为2:1的乙酸乙酯和乙醇作为展开剂，加入柱内进行洗脱；收集：样品加入时开始收集，收集过程中进行tlc检测，待出现样品点为止，最终旋蒸得到ga-n粉末。

(2)合成dspe-peg-ga

精密称取ga-n15mg于50ml茄形瓶中，充分溶解于3ml的二甲基亚砜中，加入20mgdspe-peg-nhs粉末(dspe-peg-nhs和ga-n的摩尔比为1:3)，加1.58mgedc催化反应，在反应体系中加入20μl的三乙胺以调节ph，氮气保护下室温反应48h，透析72h后，冷冻干燥得dspe-peg-ga固体。分别将ga-n、dspe-peg-nhs以及dspe-peg-ga溶于三氯甲烷中检测核磁共振氢谱，结果见图2。

从图2可以看出，通过将胺化的ga与dspe-peg-nhs耦合，合成了靶向材料dspe-peg-ga。显示了在3.6ppm(peg组)处dspe-peg-nhs的特征峰值，ga-n的特征峰显示在0.7-1.5ppm，dspe-peg-ga特征峰显示在0.7-1.3ppm(咪唑环)。这些结果表明，ga-n成功地引入dspe-peg-nhs合成了dspe-peg-ga，其特征峰分别为3.6和0.7-1.3ppm。

实施例2：空白靶向脂质体(ga-lps)的制备

卵磷脂120mg，胆固醇30mg，20mgdspe-peg-ga(质量比为12:3:2)充分溶解于5ml的三氯甲烷中置于100ml的茄形瓶中，使用旋转蒸发仪旋蒸除去三氯甲烷，旋蒸条件：35℃，18rpm。待形成一层均匀的薄膜时，加入5mlpbs(ph＝7.4)水溶液进行水化，水化时间为40min，超声5min，依次过膜孔径为450nm，220nm的聚醚砜膜，制备的空白靶向脂质体。

实施例3：制备靶向共载cur和ca4p脂质体

卵磷脂120mg，胆固醇30mg，dspe-peg-ga20mg，(质量比为12:3:2)充分溶解于5ml的三氯甲烷中置于100ml的茄形瓶中，加入cur3mg(cur与磷脂的质量比为1:40)充分溶解，使用旋转蒸发仪旋蒸除去三氯甲烷，旋蒸条件：35℃，18rpm。待形成一层均匀的薄膜时，加入5ml3mg/ml的ca4ppbs(ph＝7.4)水溶液(cur与ca4p的质量比为1:5)进行水化，水化时间为40min，超声5min，通过g-50葡聚糖凝胶柱和透析法除去未包封的游离药物：

cur的去除：凝胶准备：称取g-50粉末10g于250ml锥形瓶中，加入100ml蒸馏水，搅拌均匀浸泡24h，中途间断性搅拌，以倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，反复漂洗2～3次；装柱：使用蒸馏水填充层析柱烧结板下端的死区，将溶胀好的凝胶沿玻璃棒缓慢灌入层析柱中，待凝胶柱沉积到大约10cm左右，反复用蒸馏水平衡；加样：加样前，先打开出口，让水流出，待只留下极薄的一层水后，关闭出水口，用移液枪将1ml样品垂直缓慢地加入柱内；洗脱：洗脱时注意不要让层析柱表面干涸，预留0.2cm的水层，用pbs进行洗脱；收集样品：从样品一加进凝胶柱时就开始收集，得到去除游离cur的样品。

游离ca4p的去除：把制备好的样品取2ml装入透析袋，透析介质为pbs溶液，透析1-2天。

将经过上述步骤处理的脂质体依次过膜孔径为450nm，220nm的聚醚砜膜。使用马尔文粒度仪对cur&ca4p/ga-lps的粒径和zeta电位进行检测，并根据以下公式计算其载药量(le)和包封率(ee)。

测定cur包封率75.33％，载药量2.07％；ca4p包封率87.23％，载药量5.17％。测定其平均粒径为168.9nm。

如图3所示，脂质体由亲水核和疏水壳组成。将疏水性药物cur加载到疏水膜中，ca4p包裹在亲水性核心中，dspe-peg-ga嵌入到外膜中。

进一步对实施例2制备的空白脂质体与实施例3制备的靶向脂质体用扫描电镜观察其形态学特征，如图4a和图4b所示，cur&ca4p/ga-lps呈圆形气泡结构，大小均一，与空白脂质体相似，如图4c所示，cur&ca4p/ga-lps平均粒径约为168.9nm，粒径分布较窄(pdi＝0.23)。

实施例4：制备靶向共载cur和ca4p脂质体

cur&ca4p/ga-lps的制备采用的是薄膜分散法：卵磷脂120mg，胆固醇40mg，dspe-peg-ga20mg，(质量比为12:3:2)充分溶解于5ml的三氯甲烷中置于100ml的茄形瓶中，加入cur3mg(cur与磷脂的质量比为1:40)充分溶解，使用旋转蒸发仪旋蒸除去三氯甲烷，旋蒸条件：35℃，18rpm。待形成一层均匀的薄膜时，加入5ml1.8mg/ml的ca4ppbs(ph＝7.4)水溶液(cur与ca4p的质量比为1:3)进行水化，水化时间为40min。水化结束后超声5min，通过g-50葡聚糖凝胶柱和透析法除去未包封的游离药物，通过依次过膜孔径为450nm，220nm的聚醚砜膜方法对脂质体的粒径进行控制。

测定cur包封率71％，载药量1.5％；ca4p包封率80.6％，载药量4.37％。测定其平均粒径为161.8nm。

实施例5：制备靶向共载cur和ca4p脂质体

卵磷脂120mg，胆固醇40mg，dspe-peg-ga20mg，(质量比为12:3:2)充分溶解于5ml的三氯甲烷中置于100ml的茄形瓶中，加入cur3mg(cur与磷脂的质量比为1:40)充分溶解，使用旋转蒸发仪旋蒸除去三氯甲烷，旋蒸条件：35℃，18rpm。待形成一层均匀的薄膜时，加入5ml0.2mg/ml的ca4ppbs(ph＝7.4)水溶液(cur与ca4p的质量比为3:1)进行水化，水化时间为40min，超声5min，通过g-50葡聚糖凝胶柱和透析法除去未包封的游离药物，依次过膜孔径为450nm，220nm的聚醚砜膜。

测定cur包封率64.3％，载药量0.4％；ca4p包封率82％，载药量4.2％。测定其平均粒径为196.2nm。

实施例6：测定不同组分对脂质体性质的影响

按照实施例3制备脂质体的方法，分别制备如下脂质体：

blankga-lps：卵磷脂120mg，胆固醇40mg，20mgdspe-peg-ga；

cur-lps：卵磷脂120mg，胆固醇40mg，cur3mg；

ca4p-lps：卵磷脂120mg，胆固醇40mg，ca4p15mg；

cur&ca4p/lps：卵磷脂120mg，胆固醇40mg，cur3mg，ca4p15mg；

cur&ca4p/ga-lps：卵磷脂120mg，胆固醇40mg，dspe-peg-ga20mg，cur3mg，ca4p15mg；

对以上脂质体进行性能测定，粒径(dls，nm)、分散指数(pdi)、电位(ζ-potential，mv)、包封率(ee，％)、载药量(le，％)的测定结果见表1。

表1不同脂质体样品的性能测定结果

负载药物的脂质体可通过增强渗透性和滞留(epr)效应在肿瘤微环境中容易积累，且表面电荷是脂质体稳定性和与细胞相互作用的标志，由表1的结果可知，cur&ca4p/lps和cur&ca4p/ga-lpszeta电位在-25mv左右，稳定性较好。

实施例7：测定两种药物不同配比对脂质体性能的影响，筛选负载药物比例

卵磷脂120mg，胆固醇40mg，dspe-peg-ga20mg，(质量比为12:3:2)，cur3mg(cur与磷脂的质量比为1:40)，ca4p的用量根据与cur的比例进行调整，制备条件均一致，各脂质体配方的平均粒径、zeta电位、ee、le见表2。

从表2的结果可看出，当cur与ca4p的比值在1:1到10:1之间时测量le和ee，第三组(cur:ca4p＝1:5)，由于le和ee的值比其他组较理想，因此选用实施例3方法制备的脂质体作为载药脂质体进行进一步实验。

表2不同药物比例脂质体的性能表征

实施例8：将通过实施例3方法制备的脂质体进一步测定其在不同时间的性能变化，结果见表3。

表3cur&ca4p/ga-lps脂质体在不同时间的性能变化结果

由表3的结果可知，脂质体制剂稳定性检测2周后，cur&ca4p/ga-lps的理化性质无明显变化。

实施例9：靶向共载脂质体的体外释药

采用透析法研究了从脂质体中释放cur和ca4p的情况。以pbs(ph7.4)为释放介质，加入1％tween80和20％无水乙醇。将1mlcur&ca4p/ga-lps转移至透析袋(截留分子量为3.5kda)，放入装有50ml释放介质的锥形瓶中。该体系放置在气浴恒温振荡器中，转速为100rpm，温度为37℃。在特定的时间点0.5、1、2、4、8、12、24、36、48h，取4ml介质，同时补充相同体积得释放介质。用紫外分光光度计分别在424nm和288nm处测定cur和ca4p的吸光度，并计算累积释药量。利用下式计算累积cur和ca4p释放率(er)：

其中md为脂质体中药物的量，v0为释放液的整体体积，ci为释放液中cur或ca4p的浓度，vr为替换液的体积。

如图5所示，两种药物均未出现明显的爆裂释放。相反，两种药物均在48小时内持续释放，很明显，在实验的进行的前10小时内，两种药物的累积释放速率几乎相同，而ca4p在10小时后的释放速度明显快于cur。大约有60％的ca4p在24小时内释放，而少于50％的cur在同一时间内释放。48h时，ca4p和cur的累积释放量分别为65％和50％，这可能是因为在水溶性pbs中，亲水性ca4p的释放速度快于疏水性cur。

实施例10：靶向共载脂质体的细胞摄取

采用定性方法评价肝癌细胞bel-7402对于脂质体制剂的摄取情况。将密度为6×10³细胞接种到6孔板上，在37℃，co2培养箱中孵育24小时直到观察到细胞贴壁生长。分别使用cur&ca4p/lps，cur&ca4p/ga-lps(10μg/mlcur)孵育1h，弃掉所有的试剂，用冷pbs洗三遍，4％聚甲醛固定10min，dapi染色(0.1μg/ml，用pbs稀释)放在co2培养箱中孵育10min。最后用pbs洗涤3次，用荧光倒置显微镜观察并拍照。图像使用imageproplus6.0软件合成。

用倒置荧光显微镜观察cur&ca4p/lps和cur&ca4p/ga-lps细胞摄取情况。如图6所示，图6a为cur&ca4p/lps处理的荧光显微图，图6b为cur&ca4p/ga-lps处理的荧光显微图，dapi(蓝色)作为bel-7402细胞核的荧光标记物。细胞质中的绿色荧光表明cur被细胞摄取。在合并后的图像中，蓝色和绿色荧光共定位表明脂质体是通过内吞作用进入细胞的。从图中可以看出，孵育的bel-7402细胞的荧光显微图cur&ca4p/ga-lps比cur&ca4p/lps具有更强的绿色荧光。表明cur&ca4p/ga-lps可以通过ga受体介导的内吞作用被癌细胞摄取，ga分子的引入促进了肝癌细胞对脂质体的摄取，导致细胞质中积累更多的药物。

实施例11：靶向共载脂质体的体外细胞毒性分析与迁移分析

1、体外细胞毒性实验

采用mtt法测定不同剂型的体外细胞毒性。将大约5×10³密度的b16、bel-7402细胞分别在接种在96孔板上，在37℃，co2培养箱中孵育24小时。首先要做细胞相容性测试，按照实施例3的方法和用量，制备空白ga-lps的脂质体，分别加入不同浓度(0.01～10μg/ml)的空白ga-lps处理细胞24、48h或者72h。每孔加入10μmtt试剂(5mg/ml)，避光条件下孵育4h。时间到后，在每孔中加入大约150μl的dmso，震荡10min以溶解甲瓒晶体。使用酶标仪检测，波长设定为490nm。根据以上方法，分别用不同浓度的cur+ca4p、cur&ca4p/lps、cur&ca4p/ga-lps处理细胞，培养24、48和72h。

2、细胞迁移实验

细胞迁移试验设立五个组，分别为游离cur，物理混合cur+ca4p，cur&ca4p/lps,cur&ca4p/ga-lps通过伤口愈合试验评估。具体来说，密度为1×10⁴的b16、bel-7402细胞分别接种到6孔板中，在37℃，co2培养箱中孵育24小时。当细胞贴壁生长至铺满每个孔时，使用无菌移液枪的200μl的枪头在每个孔中平行划三条线，用pbs清洗因划线浮起的细胞，在显微镜下记录0h的细胞划痕状态并做好视野范围标记。加入不同的药物配方孵育细胞，稀释药物母液的溶剂为含有1.5％血清的rpmi-1640培养基，在药物孵育24h后拍照记录细胞侵入划痕区域情况。通过计算迁移率来评价药物对细胞迁移的影响，迁移率的计算公式如下：

其中wn和w0分别表示nh处的划痕平均宽度和0h处的划痕平均宽度。

图7a和b显示空白ga-lps处理24h后，b16和bel-7402细胞存活率超过86％，说明空白ga-lps在实验条件下无明显毒性，可作为药物传递载体。

如图7a所示，游离cur、物理混合cur+ca4p、cur&ca4p/lps和cur&ca4p/ga-lps在bel-7402细胞孵育24h后表达剂量依赖性细胞毒性作用，与图7b中显示的b16细胞处理结果相似，从图7a与图7b中可以看出，cur和ca4p的结合对bel-7402或b16细胞具有更高的细胞毒性，表明化疗药物联合抗血管生成药物具有细胞毒性。

从图7c和图7d所示，与物理混合联用两药组类似，脂质体联合用药对两种细胞系的24h、48h和72h表现出时间依赖的细胞毒性，从图7c与图7d中可看出，共载脂质体显示比游离cur和ca4p的混合物更强的细胞毒性。表明载药脂质体通过膜融合或内吞作用内化到细胞中，从而抑制对糖蛋白介导的药物流出。cur&ca4p/lps比cur&ca4p/lps具有更高的细胞毒性，具有显著性(p<0.05)，表明ga的引入增加了载药脂质体的细胞摄取，导致肿瘤细胞中积累了更多的药物。

为了进一步证实各种制剂的细胞毒性作用，在bel-7402和b16细胞中进行了伤口愈合试验，评价肿瘤细胞迁移抑制作用。24h后测量细胞移动和迁移到划痕区域的能力，在特定时间点拍照，如图8所示，图8a为bel-7402伤口愈合试验结果，图8b为b16的伤口愈合试验，通过image-pro6.0测量疤痕从0h到24h的平均宽度计算出的迁移率(％)，结果见图8c和图8d，从图中可以看出，四种不同药物制剂治疗后肿瘤细胞的迁移和侵袭能力不同，在培养24h内，对照组的划痕几乎消失，cur的迁移率分别为63.85％和45.68％，与对照组相比，cur+ca4p的迁移抑制效果较好，分别为47.28％和38.29％。结果表明，联合用药能明显比单独用药组具有更高的迁移抑制能力。共载脂质体组对细胞迁移的抑制效果强于物理混合cur+ca4p；cur&ca4p/ga-lps比cur&ca4p/lps对细胞迁移抑制效果更加显著，迁移率在两种细胞系中分别为15.74％和15.69％。细胞迁移试验结果与细胞毒性试验结果一致，cur&ca4p/ga-lps组细胞杀伤能力最强，p<0.01。

实施例12：靶向共载脂质体的体内生物分布

采用nirf观察ga-lps配方在体内的生物分布，制备了包载dir的ga-lps(dir/ga-lps)，ga-lps由120mg卵磷脂，40mg胆固醇，20mgdspe-peg-ga组成，用于监测脂质体的分布。当肿瘤达到100mm³时，将dir/blanklps注入小鼠尾静脉。游离dir作为对照组。用10％水合氯醛对小鼠进行麻醉，使用激发波长745nm，发射波长835nm实时监测nirf图像。结果采用livingimage3.1软件进行分析。

如图9，结果表明从1h至48h的监测，自由dir的nirf信号远低于dir/blanklps组。在2h时，游离dir组并没有发现荧光信号在肿瘤区域的聚集。相比之下，dir/blanklps出现了在肿瘤区域的荧光信号的积累，并在注射48h后荧光信号一直持续。blanklps载药系统增加了dir在肿瘤中的积累。

实施例13：靶向共载脂质体的体内抗肿瘤效能

1、体内抗肿瘤效能

为了评价cur&ca4p/ga-lps在h22荷瘤balb/c雄性小鼠体内抗肿瘤作用。首先建立荷瘤小鼠模型，分为两个步骤：第一将0.3ml5×10⁴肝癌细胞h22注入小鼠腹腔，注射五只。两周后，小鼠出现腹水肿瘤。第二，抽取小鼠腹水离心收集h22细胞，用生理盐水稀释密度为4×10⁶个/ml。小鼠背部右后肢皮下接种0.2ml的细胞悬浮液。当肿瘤体积生长到约100mm³左右时，将小鼠分为(1)生理盐水(对照组)；(2)游离cur组；(3)cur+ca4p组；(4)cur&ca4p/lps组；(5)cur&ca4p/ga-lps组。每组小鼠使用不同药物配方进行治疗，每隔一天静脉注射等量的0.2ml。药物配方以5mg/kg(以cur量计)剂量注射。在治疗过程中，监测小鼠体重，测量肿瘤直径。根据公式：(l×w²)/2计算肿瘤体积，其中l为最长肿瘤直径，w为最短肿瘤直径(mm)。两周的治疗结束后，处死小鼠，剥取肿瘤。测量肿瘤重量，计算肿瘤生长抑制率：

肿瘤生长抑制率＝(1-药物治疗组肿瘤重量/对照组肿瘤重量)*100％。

2、组织化学染色

在体内抗肿瘤研究中给药后进行组织化学染色，剥离肿瘤组织，在4％甲醛中固定24小时以上，用石蜡包埋组织。

包埋：

(1)准备工作：将固定好的肿瘤组织切成0.5cm³小块放入包埋盒中，流水冲洗过夜除去多聚甲醛；

(2)脱水：将包埋盒中依次放入70％乙醇(1h)→80％乙醇(1h)→95％乙醇(1h)→95％乙醇(1h)→100％乙醇(0.5h)→100％乙醇(0.5h)进行操作；

(3)透明：在二甲苯(ⅰ)中处理0.5h→取出后重新用二甲苯(ⅱ)中处理15min，时刻观察组织透明情况和硬度，防治组织破碎；

(4)浸蜡：温度60℃，在熔融石蜡(ⅰ)中处理1h→取出后在熔融石蜡(ⅱ)中继续处理2h；

(5)包埋：石蜡温度60℃，使用生物组织包埋机在蜡块盒中注蜡，把组织放入蜡盒的目标位置，放在包埋机冷冻台进行凝固并做好标记；

(6)切片：过夜凝固蜡块，然后用电脑超薄切片机把蜡块切成4μm的薄片；

(8)展片：切出完整的薄片之后放在45℃水浴锅中展片，展开至组织无褶皱，用干燥的粘附载玻片捞片，用滤纸吸干多余的水分，做好标记；

(9)粘片：将片子放在60℃的恒温箱中烤2h。

随后做组织化学染色：

(1)脱蜡：在二甲苯(ⅰ)中处理10min，取出后加入二甲苯(ⅱ)中，处理10min；

(2)入水：100％乙醇(10min)→95％乙醇(3-5min)→80％乙醇(1-3min)→70％乙醇(1-2min)，洗去溶解的石蜡和二甲苯，乙醇浓度逐步降低，防止脱片；

(3)水洗：蒸馏水洗2次，轻轻洗掉乙醇；

(4)苏木素染色：用移液枪滴加苏木素染液在组织上，处理10-15min，后用蒸馏水洗净；

(5)利用0.5％盐酸-酒精分化5-10s：0.5％盐酸-酒精的配置，取0.5-1ml盐酸，加

95％的乙醇至10ml；

(6)用蒸馏水洗5-10min，肉眼看见片子呈现兰色后，梯度乙醇清洗：70％乙醇(10min)→80％乙醇(10min)；

(7)伊红染色5-10s后，进行以下处理：95％乙醇(2min)→95％乙醇(1-2min)→100％乙醇(10-15min)→100％乙醇(10-15min)→二甲苯(10-15min)→二甲苯(10-15min)→中性树胶封片→显微镜观察并拍照记录。

如图10a所示，与对照组相比游离cur组展示了明显的体重下降趋势，表明游离姜黄素可产生一定的系统性毒性。从图中可看出，脂质体组的体重没有多度的下降，与对照组一样呈现上升趋势，表明脂质体配方可以减少系统性毒性。在图10b中，生理盐水处理的小鼠在实验期间肿瘤大小迅速增加，四种药物配方处理的小鼠肿瘤大小略有增加，说明这些药物配方均可以抑制肿瘤的发展。此外，与单药治疗相比，cur和ca4p联合用药在抗肿瘤治疗中更有效，这两种药物通过促凋亡和抗血管生成活性达到了叠加效应。如图10b、图10c和图10d所示，与物理混合cur+ca4p相比，两种脂质体配方具有更强的抗肿瘤作用与mtt法结果一致，具有协同效应。从以上结果可看出，脂质体通过epr效应提高了cur和ca4p在肿瘤区域的积累，从而提高了抑制效率。此外，如图10d所示，cur&ca4p/ga-lps的肿瘤抑制率为90.5％，高于cur&ca4p/lps。表明cur&ca4p/ga-lps可以通过ga受体介导的内吞作用被肿瘤细胞吸收，通过主动肝靶向给药增加抗肿瘤作用。

对肿瘤组织切片进行h&e染色，进一步评价其抗肿瘤作用。如图11所示，生理盐水对照组肿瘤细胞无明显坏死，细胞核保持完整状态，而肿瘤细胞经药物处理后，细胞核缩小，细胞密度低，形态变化明显，提示肿瘤细胞的发育受到抑制。与游离cur组相比，物理混合组肿瘤细胞核产生更多的核收缩，说明cur和ca4p的结合可以通过促凋亡和抗血管生成活性来增强抗肿瘤作用。此外，经脂质体配方处理的肿瘤细胞与物理混合cur+ca4p组相比，细胞密度更低，核收缩更大，表明在脂质体配方处理下，肿瘤区域积累了更多的药物。在所有的处方中，cur&ca4p/ga-lps的疗效最好。结果表明由于ga-lps可以通过epr效应有效地将药物传递到肿瘤微环境，并通过ga-受体介导的内吞作用增加肿瘤细胞对药物的吸收量。