止泻木碱B的医药用途的制作方法

本发明属医药技术领域,止泻木碱b的医药用途，具体涉及化合物止泻木碱b在制备抑制微生物外排泵活性药物中的应用。

背景技术：

随着抗生素的广泛应用，细菌耐药性越来越严重,尤其是多重耐药性(multi-drugresistance,mdr)已经成为非常严重的医疗问题,而多种类型细菌外排泵(effluxpumps)的存在是细菌多重耐药的重要机制。

金黄色葡萄球菌是医院内感染的主要致病菌之一，尤其是mrsa的出现，使临床治疗更加棘手。mrsa感染已经与乙型肝炎和获得性免疫缺陷综合征并列成为世界上最难解决的3大感染性疾病。外排泵的外排作用是金黄色葡萄球菌耐药的重要原因之一。

外排泵抑制剂具有减少耐药菌株出现，逆转耐药菌株耐药性的作用，有望成为恢复细菌对药物的敏感性、提高临床疗效的一类新型药物。目前已经发现了一些具有细菌外排泵抑制活性的化合物，但目前还没有一种能够用于临床治疗,外排泵抑制剂类药物的研发工作任重而道远。因此寻找有应用前景的外排泵抑制剂(effluxpumpinhibitors,epis)是十分必要且迫切的。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供止泻木碱b的医药新用途。

进一步地，本发明提供止泻木碱b在制备外排泵抑制剂中的应用。

所述的止泻木碱b具有如下结构：

本发明提供了止泻木碱b作为外排泵抑制剂，在制备耐药逆转剂恢复细菌对抗生素的敏感性方面的新用途。

本研究采用溴乙锭(etbr)和派洛宁y(pyroniny)累积量实验考查止泻木碱b对微生物外排泵的抑制作用。

结果表明：0.25-2mm的止泻木碱b可显著增加两种mrsa的etbr和pyroniny累积量，止泻木碱b在0.25-0.5mm时，作用更强，说明止泻木碱b可有效抑制微生物外排泵的外排作用，可以用于制备外排泵抑制剂，并用于逆转耐药菌耐药性，尤其是逆转耐药细菌的耐药性。

同时，本发明的止泻木碱可以和抗生素联用，从而提高抗生素的抗菌活性，所述的抗生素可以为青霉素。

本发明的止泻木碱b可以和药学上可接受的载体或赋形剂组成药物组合物或制剂。

所述的制剂为口服制剂、外用制剂、皮下、肌肉或静脉给药制剂。其剂型可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、洗剂、气雾剂、喷雾剂、膏剂或注射剂。

附图说明

图1为止泻木碱b(0.063-0.5mm)对73111mrsaetbr累积量实验影响；

图2为止泻木碱b(1.0-2.0mm)对73111mrsaetbr累积量实验影响；

图3为止泻木碱b(0.063-0.5mm)对73127mrsaetbr累积量实验影响；

图4为止泻木碱b(1.0-2.0mm)对73127mrsaetbr累积量实验影响；

图5为止泻木碱b(0.063-0.5mm)对73111mrsapyroniny累积量实验影响；

图6为止泻木碱b(1.0-2.0mm)对73111mrsapyroniny累积量实验影响；

图7为止泻木碱b(0.063-0.5mm)对73127mrsapyroniny累积量实验影响；

图8为止泻木碱b(1.0-2.0mm)对73127mrsapyroniny累积量实验影响。

具体实施方式

下面结合实施例来更详细的说明本发明,但本发明并不受这些实施例的限制。

实施例1

止泻木碱b对耐甲氧西林型金黄色葡萄球菌(mrsa)外排泵的影响

材料与方法

实验菌株：

73111和73127两株菌，均为耐甲氧西林型金黄色葡萄球菌(mrsa)，对这些菌株进行了传代培养，然后用于本实施例中。药品与试剂：

溴乙锭(etbr)：sigma-aldrich；

羰基氰氯苯腙(cccp)：sigma-aldrich；

pyroniny：sigma-aldrich；

磷酸缓冲盐溶液：自制；

葡萄糖：大连美仑生物技术有限公司；

4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(hepes)：北京索莱宝科技有限公司；

甲酸钠：天津博迪化工股份有限公司；

96孔酶标板：广州洁特生物过滤股份有限公司

实验仪器：

分析天平；uv-1700型紫外分光光度计(日本岛津)；zhjh-c1112b型双人垂直流超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；ldzx-50kbs型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；drp-9162型电热恒温培养箱(上海森信实验仪器有限公司)；zwy-100h型智诚恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)；varioskanflash型酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)；tdl-60b型低速离心机(上海安亭科学仪器厂)

实验方案

药品配置：

etbr：溶解于水中，配制成浓度为80mg/l的初始溶液；

cccp：溶解于dmso中，配制成浓度为2mm的初始溶液；

pyroniny：溶解于水中，配制成浓度为80mg/l的初始溶液；

4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(hepes)：溶解于水中，配制成浓度为20mm的溶液；

甲酸钠：溶解于水中，配制成浓度为2500mm的初始溶剂实验方法：

etbr累积量实验：

增菌后的菌悬液使用低速离心机于3500rpm/min离心10min除去培养基后，使用0.01mol/lpbs+0.4％glc校正浓度至od600＝1作为菌悬液备用。

将配置好的0.01mol/lpbs+0.4％glc溶液分装后于113℃，55.21kpa高压蒸汽灭菌30min，室温保存备用。

将100μl菌悬液无菌操作加入到96孔黑色酶标板实验孔中；加入10μl不同浓度止泻木碱b作为实验组；加入10μl终浓度为100μm的cccp作为阳性对照孔；加入0.01mol/lpbs+0.4％glc作为阴性对照孔；使用0.01mol/lpbs+0.4％glc补充总体积至190μl；快速加入10μl终浓度为4mg/l的etbr；立即使用酶标仪于激发波长518nm，发射波长605nm条件下检测并记录相对荧光值(relativefluorescenceunits,rfu)，前10min检测频率：1min/次，之后10min/次，共记录3h。

pyroniny累积量实验：

增菌后的菌悬液使用低速离心机于3500rpm/min离心10min除去培养基后，使用20mmhepes缓冲液校正浓度至od650＝0.85作为菌悬液备用。

取1ml菌悬液于1.5ml尖嘴离心管中，加入50μl终浓度为100μmcccp作为阳性对照，实验组依次加入不同浓度的止泻木碱b，并设置阴性对照；加入50μl终浓度为4mg/l的pyroniny，混匀，于37℃培养箱中培养1.5h；将培养后的菌悬液于3500rpm/min离心10min，使用移液枪小心吸去上清液，并悬浮于1ml20mmhepes缓冲液中；将菌悬液小心转移至96孔黑色酶标板中，200μl/孔，重复三个复孔；向每个实验孔中加入10μl终浓度为125mm的甲酸钠；及时使用酶标仪测量并记录荧光值，10min/次，共测量1.5h，激发波长及发射波长分别为545nm，570nm。

实验结果：

止泻木碱b在0.25～2.0mmol/ml浓度下，可显著增加耐甲氧西林型金黄色葡萄球菌(mrsa)菌体内etbr累积量(见图1-图4)和pyroniny累积量。(见图5-图8)

实验结果表明，止泻木碱b可显著增加mrsa菌体内etbr和pyroniny累积量。说明止泻木碱b可以抑制药物的外排，增加药物在菌体内的累积量，是潜在的外排泵抑制剂。

实施例2

止泻木碱b与青霉素联合应用，对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(mrsa)的体外协同抗菌活性比较

参照美国临床实验室标准化委员会clsi(前身nccls)药敏实验方案，测定化合物止泻木碱b与青霉素联合应用的体外抑菌活性。

材料与方法

实验菌株：

mrsa(耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)，对这些菌株进行了传代培养，然后用于本实施例中。

传代培养步骤：

1.从-80℃冰箱中取出含菌甘油管，无菌操作接种于营养肉汤培养基中，振动培养18-24h。

2.将装有肉汤琼脂培养基的三角瓶加热至充分融化。将培养基冷却至50℃左右后，采用无菌操作法倒平板水平静止待凝，即培养平板。

3.采用分区划线法接种，将平皿分为a、b、c、d四区。

4.将接种的平皿在37℃恒温培养箱中静置培养18-24h后，取出置于4℃冰箱中保存，获得第1代菌株。

5.每次药敏实验前，在平皿中挑取大小形状相同的2个菌株接种于营养肉汤培养基中振动培养18-24h，获得纯种菌悬液并进行药敏试验。

药品与试剂：

青霉素为华北制药股份有限公司产品，生化分析纯。mh培养基、bhi肉汤为北京奥博星生物技术有限公司产品，na2s2o3、naoh、氯化钠为天津市大茂化学试剂厂产品，琼脂为北京科密欧化学试剂有限公司产品，蒸馏水(沈阳药科大学)。

细菌bhi肉汤培养基的配制：

取脑心浸出液肉汤(bhi)24.5g，溶于500ml蒸馏水中，再加10g琼脂，调ph7.4±0.2，分装后115℃灭菌30min。

细菌mh肉汤培养基的配制：

取mh培养基24.0g，加热溶于1000ml蒸馏水中，调ph7.2±0.2，分装后115℃灭菌30min。

细菌菌悬液的制备：

用接种环挑取形态相近的菌落3-5个，接种于含有5mlbhi肉汤培养基的试管中，37℃孵育24h。增菌后的菌液用m-h肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含有1-2×10⁸cfu/ml。经m-h肉汤1：100稀释后，作为接种用菌悬液。

实验仪器：

仪器与试剂分析天平；uv-1700型紫外分光光度计(日本岛津)；zhjh-c1112b型双人垂直流超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；ldzx-50kbs型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；drp-9162型电热恒温培养箱(上海森信实验仪器有限公司)；zwy-100h型智诚恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)；varioskanflash型酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)

实验方案

药品配制：

浓度配成2560μg/ml：称取2560μg样品后，用1ml体积的溶剂溶解。

实验方法：

以青霉素最低抑菌浓度实验结果为依据，设计青霉素的1/8mic值，增菌后的菌悬液使用mhb校正浓度至0.5麦氏比浊管标准，经mhb稀释100倍做为菌悬液备用。

选取96孔板3-9列，b-g行为实验区域，无菌操作；止泻木碱b的4个浓度由高到低以纵列方式分别从第3纵列加至第6纵列，每孔10μl；于b、c、d行与3、4、5、6列交叉处加入青霉素50μl，作为抗生素和提取物联用实验孔；第7纵列加入青霉素50μl/每孔，为青霉素单用实验孔；第8纵列每孔加入100μl菌悬液，作为空白对照实验孔；第9纵列为mhb，作为阴性对照实验孔；每孔加入100μl菌悬液并补充mhb至终体积为200μl/每孔；将96孔板放置于37℃培养箱中恒温培养18～24h；620nm下测定吸光度并计算抑制率，抑制率计算公式如下：

抑制率(％)＝[(od空白孔-od待测孔)/od空白孔]×100

其中，od空白为空白对照孔吸光度值，od待测孔为待测孔吸光度值。

实验结果：

止泻木碱b(5个不同浓度)与1/8mic浓度的青霉素联合用药时对mrsa菌的抑制率分别为99.5％、98.6％、95.6％、46.3％、32.8％，联合抑菌实验数据见下表。

实验结果表明，青霉素在1/8mic浓度下(1μg/ml)对mrsa耐药菌仅具有较弱的抑菌作用，其抑制率为17％～22％；5个不同浓度的止泻木碱b单独使用时对耐药菌的抑菌率仅为9％～14％；而当两者联合使用后，其抑菌效果显著增加。如浓度为0.5～2.0mmol/l范围内的止泻木碱b与1/8mic浓度的青霉素联合使用后，抑菌率可达95～99％，显著高于两者单独使用时抑菌率之和，说明两者抑菌并非简单的加和作用，而是发挥了明显的协同抑菌作用，实现了1+1>2的效果。

表1：止泻木碱b与青霉素单独使用与联合应用的抑菌效果

实施例2：片剂的制备

取止泻木碱b50g，加入淀粉细粉150g，用等量递增法混匀，加入滑石粉5g，硬脂酸镁2g，混匀，用85％乙醇制粒，干燥，整粒，压制成1000片，每日3次，每次2片。

实施例3：胶囊的制备

取止泻木碱b50g，加入淀粉细粉200g，加入滑石粉10g，硬脂酸镁5g，混匀，制粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒，每日3次，每次2片。

实施例4：颗粒剂的制备

取止泻木碱b50g，加入淀粉细粉200g，加入滑石粉10g，硬脂酸镁5g，混匀，乙醇水混合液制粒，干燥，装入包装，规格10克/袋，每日3次，每次1袋。

实施例5：滴丸剂的制备

取peg600250g在油浴上加热至约135℃，取止泻木碱b50g，不断搅拌，至全部熔融，趁热过滤，置贮液瓶中，135℃保温，用管口内径分别为9.0，9.8mm的滴管滴制，滴速为80滴/分，滴入含43％煤油的液状石蜡(外层为冰水浴)冷凝液中冷凝成丸，然后用液状石蜡洗丸至无煤油味，用毛边纸吸去黏附的液体石蜡，装入包装，规格15克/袋，每日3次，每次1袋。

实施例6：洗剂的制备

止泻木碱b50g、氧化锌25g混合研磨至糊状，再加入甘油25g，羟甲基纤维素钠2.5g，加蒸馏水至500ml既得，每日冲洗2次，每次10ml(1：9洗液与水配比)。

实施例7：喷雾剂的制备

将16g卵磷脂溶解于0.8l去离子水中，再取25g止泻木碱b和200gpeg300溶解于上述卵磷脂水溶液中，并加入一定量的乙酸乙酯，超声形成初乳，再将其转入150l乙酸乙酯中，形成药物小颗粒，离心收集药物粒子。再用适量2,3-氢全氟丙烷分两次将残余的卵磷脂洗去，室温下干燥得药物颗粒，分剂量灌装，规格15克/瓶，每日3次，每次1喷。

实施例8：气雾剂的制备

将16g卵磷脂溶解于0.8l去离子水中，再取25g止泻木碱b和200gpeg300溶解于上述卵磷脂水溶液中，并加入一定量的乙酸乙酯，超声形成初乳，再将其转入150l乙酸乙酯中，形成药物小颗粒，离心收集药物粒子。再用适量2,3-氢全氟丙烷分两次将残余的卵磷脂洗去，室温下干燥得药物颗粒，分剂量灌装，封接剂量阀门系统，在每25mg药物粒子中分别压入12.5mlhfa-134a，该组分在180w，室温下超声处理10分钟，规格15克/瓶，每日3次，每次1喷。

实施例9：膏剂的制备

7.5g卡波沫940放入190ml水中，大力均匀搅拌，加250g甘油继续搅拌均匀，加入1％苯甲酸钠1ml，继续搅拌均匀，形成基质，将5g止泻木碱b和基质混合研磨均匀后既得，规格15克/瓶，每日涂抹于患病处2次。

实施例10：注射剂的制备

取止泻木碱b50g，甘露醇150g，加注射用水2000ml，搅拌使其溶解，用1mnaoh溶液调ph至9.60-10.00，搅拌使其溶解，滤过滤液按1％溶液体积量加入活性炭，在70-80℃下加热10分钟，粗滤过，管道及容器用400ml注射用水洗涤，加水到2500ml，药液经0.22pm无菌过滤器过滤，灌装，冻干，压塞，轧盖，制成1000瓶，规格5ml/瓶，每日2次，每次1瓶。