本发明属于蛋白质和多肽药物
技术领域：
，具体涉及一种重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白冻干粉制剂。
背景技术：
：肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,tnf)是一种多功能的细胞因子，与多种疾病及病理反应密切相关，在炎症反应、内毒素性休克、恶液质和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中起关键作用，其过量表达是多种自身免疫性疾病的病理机制之一。对tnf受体的研究表明，肿瘤坏死因子受体分布广泛，与肿瘤坏死因子的亲和力较强。这种可溶性受体可以中和tnf，在体内对tnf的活性起负调节作用。用受体免疫球蛋白融合技术，将受体的细胞外区与人免疫球蛋白的fc段基因融合，在体外表达出相应的重组人型肿瘤坏死因子受体(p75)-fc融合蛋白。它有免疫球蛋白的体内半衰期长、组织穿透力强等特性，可以特异性地与体内的tnf结合，从而抑制关节的炎症反应。cn201480065341公开了一种tnfr-fc融合蛋白的液体制剂，包含氨基酸、缓冲溶液和等渗剂，虽然一定程度上提高了tnfr-fc融合蛋白的稳定性，但长时间放置仍会导致聚体含量增加，活性下降等现象。cn201010613663公开了一种重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白的冻干粉针剂，含有自蔗糖、海藻糖等保护剂以及醋酸钠、氨丁三醇等缓冲剂，冻干后的重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白稳定性较好，但蛋白的玻璃转化温度仍有待提高。由于冷冻干燥过程是个复杂变化的过程，会有诸多因素影响蛋白质的稳定，从而引起变性。重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白冻干过程中有容易聚集的倾向，无论怎样的冻干程序都对纯的蛋白造成显著损害，选择添加合适的保护剂来保护重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白的活性是亟待解决的问题。技术实现要素：本发明提供了一种重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白的冻干制剂，该制剂配方简单，蛋白体系稳定，便于大规模生产、贮存和运输，临床给药方便。发明人经过大量创造性实验，偶然发现一种特定处方的冻干重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白，并开发了一种适合于该处方的冻干工艺，制备的重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白制剂既可以提高蛋白的玻璃转化温度，又能抑制各种组份在冻干过程中的结晶，从而提高其稳定性。本发明解决其技术问题所采用的技术方案具体如下：一种重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白冻干制剂，所述冻干制剂包含重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白、氨基酸、羟乙基淀粉、填充剂、表面活性剂和缓冲剂。所述氨基酸为精氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、赖氨酸的中的一种或几种。所述填充剂选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇中的一种或几种。所述表面活性剂为吐温20。所述缓冲剂为tris/hcl。所述重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白冻干制剂包含如下组份：优选地，所述重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白冻干制剂包含如下组份：所述重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白采用如下工艺制备半成品液：称取处方量的tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整ph，取样检测ph及内毒素合格后，再准确量取处方量的氨基酸、填充剂、羟乙基淀粉、表面活性剂和重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白原液加入到tris/hcl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。一种重组人肿瘤坏死因子受体-fc冻干制剂的冻干工艺，采用如下步骤冷冻干燥：1)预冻：冻干样品5℃预冻0.5-1h，降温至-60℃～-40℃，维持4-6h进行冷冻，2)升华干燥：维持真空度，设定10h升温至-25℃～-20℃，维持20-30h，3)再干燥：维持真空度，升温至30℃，维持8-10h进行解析干燥，冻干结束。优选地，所述重组人肿瘤坏死因子受体-fc冻干制剂的冻干工艺，采用如下步骤冷冻干燥：1)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间10～30min达到预设温度，维持0.5-1h，再降温至-60℃～-40℃，设定时间5～10min达到预设温度，维持4-6h进行冷冻；2)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃～-20℃，设定时间10h达到预设温度，维持20-30h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；3)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间80～120min达到预设温度，维持8-10h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。与现有技术相比，本发明的重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白冻干制剂，外观白色疏松，产品水分含量低，复溶迅速，稳定性好，具有更长的存贮时间，便于大规模生产、贮存和运输。具体实施方式下面通过实施例来进一步说明本发明。应该正确理解的是：本发明的实施例仅仅是用于说明本发明而给出，而不是对本发明的限制，所以，在本发明的方法前提下对本发明的简单改进均属本发明要求保护的范围。实施例11)处方2)制备工艺：称取处方量的tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整ph至8.0，取样检测ph及内毒素合格后，再准确量取处方量的精氨酸、蔗糖、羟乙基淀粉、吐温20和重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白原液加入到tris/hcl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。3)冻干工艺：a)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-60℃，设定时间10min达到预设温度，维持6h进行冷冻；b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间10h达到预设温度，维持25h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。实施例21)处方2)制备工艺：称取处方量的tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整ph至7.0，取样检测ph及内毒素合格后，再准确量取处方量的半胱氨酸、海藻糖、羟乙基淀粉、吐温20和重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白原液加入到tris/hcl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。3)冻干工艺：a)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间10min达到预设温度，维持0.5h，再降温至-40℃，设定时间5min达到预设温度，维持4h进行冷冻；b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-20℃，设定时间10h达到预设温度，维持20h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间80min达到预设温度，维持8h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。实施例31)处方2)制备工艺：称取处方量的tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整ph至8.5，取样检测ph及内毒素合格后，再准确量取处方量的苏氨酸、半胱氨酸、甘露醇、羟乙基淀粉、吐温20和重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白原液加入到tris/hcl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。3)冻干工艺：a)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-60℃，设定时间10min达到预设温度，维持6h进行冷冻；b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间10h达到预设温度，维持30h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间120min达到预设温度，维持10h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。实施例41)处方2)制备工艺：称取处方量的tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整ph至8.0，取样检测ph及内毒素合格后，再准确量取处方量的赖氨酸、海藻糖、山梨醇、羟乙基淀粉、吐温20和重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白原液加入到tris/hcl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。3)冻干工艺：a)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间20min达到预设温度，维持0.8h，再降温至-50℃，设定时间8min达到预设温度，维持5h进行冷冻；b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间10h达到预设温度，维持25h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间100min达到预设温度，维持9h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。对比实施例11)处方2)制备工艺：准确量取处方量的脯氨酸、谷氨酸、组氨酸和重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白原液加入到ph＝6.3的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。3)冻干工艺：a)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-60℃，设定时间10min达到预设温度，维持6h进行冷冻；b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间10h达到预设温度，维持25h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。对比实施例21)处方2)制备工艺：按照处方准确称量，加注射用水充分混匀后，用盐酸调其ph至7.30。将药液经0.22μm的材质为聚偏二氟乙烯的滤盘加压除菌过滤。得重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白半成品。将半成品分装于西林瓶中(1ml/瓶)，放入冻干机中，开启冻干机，过程如下：a)预冻阶段：预冻温度为-38℃，保持预冻温度3小时；b)升华干燥阶段：真空度3bar，温度为-32℃，保持12小时；c)解析干燥阶段：真空度3bar，分别在-20℃、-10℃、-5℃、10℃、20℃、30℃各恒温干燥2个小时，即得注射用重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白粉针剂。对比实施例31)处方2)制备工艺：按照处方准确称量，加注射用水充分混匀后，用盐酸调其ph至7.30。将药液经0.22μm的材质为聚偏二氟乙烯的滤盘加压除菌过滤。得重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白半成品。将半成品分装于西林瓶中(1ml/瓶)，放入冻干机中，开启冻干机，过程如下：a)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-60℃，设定时间10min达到预设温度，维持6h进行冷冻；b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间10h达到预设温度，维持25h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。对比实施例41)处方2)制备工艺：称取处方量的tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整ph至8.0，取样检测ph及内毒素合格后，再准确量取处方量的蔗糖、羟乙基淀粉、吐温20和重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白原液加入到tris/hcl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。3)冻干工艺：a)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-60℃，设定时间10min达到预设温度，维持6h进行冷冻；b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间10h达到预设温度，维持25h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。对比实施例51)处方2)制备工艺：称取处方量的tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整ph至8.0，取样检测ph及内毒素合格后，再准确量取处方量的半胱氨酸、蔗糖、山梨醇、吐温20和重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白原液加入到tris/hcl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。3)冻干工艺：a)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-60℃，设定时间10min达到预设温度，维持6h进行冷冻；b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间10h达到预设温度，维持25h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。对比实施例61)处方2)制备工艺：称取处方量的tris用适量注射用水溶解，调节ph至8.0，取样检测ph及内毒素合格后，再准确量取处方量的精氨酸、蔗糖、聚乙二醇和重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白原液加入到tris缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。3)冻干工艺：a)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-60℃，设定时间10min达到预设温度，维持6h进行冷冻；b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间10h达到预设温度，维持25h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。对比实施例71)处方2)制备工艺：称取处方量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠用适量注射用水溶解，用盐酸调整ph至6.0，取样检测ph及内毒素合格后，再准确量取处方量的组氨酸、蔗糖、羟乙基淀粉、吐温20和重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白原液加入到磷酸缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。3)冻干工艺：a)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-60℃，设定时间10min达到预设温度，维持6h进行冷冻；b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间10h达到预设温度，维持25h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。对比实施例81)处方2)制备工艺：称取处方量的tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整ph至8.0，取样检测ph及内毒素合格后，再准确量取处方量的精氨酸、蔗糖、羟乙基淀粉和重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白原液加入到tris/hcl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。3)冻干工艺：a)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-60℃，设定时间10min达到预设温度，维持6h进行冷冻；b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间10h达到预设温度，维持25h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。对比实施例91)处方2)制备工艺：称取处方量的tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整ph至8.0，取样检测ph及内毒素合格后，再准确量取处方量的精氨酸、蔗糖、羟乙基淀粉、吐温20和重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白原液加入到tris/hcl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。3)冻干工艺：a)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-60℃，设定时间10min达到预设温度，维持6h进行冷冻；b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间10h达到预设温度，维持25h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。对比实施例101)处方2)制备工艺：称取处方量的tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整ph至8.0，取样检测ph及内毒素合格后，再准确量取处方量的精氨酸、蔗糖、羟乙基淀粉、吐温20和重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白原液加入到tris/hcl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。3)冻干工艺：a)预冻：先将装有重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度5℃预冻，设定时间10min达到预设温度，维持1h，再降温至-35℃，设定时间10min达到预设温度，维持2h进行冷冻；b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间10h达到预设温度，维持10h，同时维持真空度0.2mbar，完成升华干燥；c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间100min达到预设温度，维持5h进行干燥，同时维持真空度0.2mbar，冻干结束。验证实施例1.差示量热扫描(dsc)采用microcaltmvp-capillarydsc仪，在仪器程序控制温度下，分别测定实施例1-4和对比实施例1-10的重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白的半成品溶液的熔化温度tm值。样品用对应的缓冲溶液稀释至重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白浓度为1mg/ml后，取350μl样品加入到96孔板的样品孔，相应的缓冲液取350μl加入到buffer孔，扫描温度设置为20～90℃，扫描速率为60℃/hr。数据分析采用microcalvp-capillarydsc自动分析软件。结果见表1。表1、重组人肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白的tm值结果样品tmonset/℃tm1/℃tm2/℃实施例140.7664.0873.24实施例239.9463.2673.27实施例339.0562.3773.33实施例440.0763.8973.92对比实施例130.3756.6972.92对比实施例234.3157.6372.83对比实施例334.3157.6373.53对比实施例433.5756.8973.41对比实施例532.0655.3873.53对比实施例634.3757.6973.11对比实施例736.4159.7373.14对比实施例835.1858.573.2对比实施例936.6960.0173.79对比实施例1036.1559.4772.79tm值表示蛋白热转变中点温度，对于多结构域蛋白可以有多个tm值，它是蛋白质热稳定性的重要指标，上移代表了稳定性的增强，可以用来评估寡聚体和聚集体的形成趋势。tmonset是去折叠起始的温度，tm1是第一个转变温度，tm2是第二个转变温度。对比实施例1-3为现有技术的处方，表1结果显示，现有技术的最高tmonset约为34.31℃，本发明tmonset最高可达到40.76℃，与现有技术相比提高了6.45℃。对比实施例4-10在改变处方后，均较本发明的tmonset低。2.稳定性试验分别按照实施例1-4及对比实施例1-10制备样品三批，每批各取60瓶，采用加速稳定性试验和长期试验考察贮存稳定性。加速试验在25℃±2℃的条件下进行，时间为12个月。所用设备能控制温度±2℃，并对实际温度进行监测。在试验期间第0个月、3个月、6个月、12个月末取样一次，按稳定性重点考察项目检测。长期试验在2～8℃的条件下进行，分别于0个月、3个月、6个月、12个月、24个月末按稳定性重点考察项目进行检测；(水分含量测定采用梅特勒-扎利多dl37卡尔费休滴定仪按照《2015版中国药典》第三部通则中规定的库伦法来测定，纯度检查按照通则0514分子排组色谱法和通则0542毛细管电泳法测定，)，结果显示与0月对比均无显著性变化，且比对比例具有更稳定的特征，结果见表2、表3。表2.2～8℃长期稳定性实验结果表3.25℃加速稳定性实验结果表2和表3的稳定性数据结果显示，实施例1-4的冻干制剂为白色疏松体，复溶后澄清透明，略带微乳光；水分含量小于1.00％；在2-8℃条件下保存24个月单体含量≧98.6％；25℃条件下保存12个月单体含量仍能达到≧95％的效果。现有技术中对比实施例1-3在2-8℃条件下保存24个月后，单体含量分别为87.9％、98.1％、97.9％，25℃条件下保存12个月单体含量分别为86.7％、93.5％、92.0％，在加速实验条件下的保存时间远低于本发明，对比实施例4-10改变处方冻干工艺后，冻干制剂的稳定性也均远低于本发明。当前第1页12