镉胁迫条件下毛白杨中的一种差异表达的NACs转录因子及其获取方法与流程

本发明属于生物信息学技术领域，具体涉及镉胁迫条件下毛白杨中的一种nacs转录因子及其获取方法。

背景技术：

土壤是人类赖以生存的物质基础，也是人类最早开发和利用的农业生产资源，它与当今全世界人类面临的粮食、资源和环境等许多问题密切相关。镉是造成土壤污染面积最大、危害最严重的重金属之一。镉作为植物生长发育非必需的金属元素，含量较低时就可能会对植物产生危害，如降低植物体内酶的活性及光合强度，造成代谢紊乱，改变细胞膜透性，阻碍根系生长，抑制其对水分和养分的吸收，影响作物的产量和品质。但到目前为止，人们对重金属镉胁迫下许多基因表达的调节机制还不清楚。由于它存在着强毒性与可迁移性，所以被植物的根系所吸收的镉元素很容易迁移至植物的籽粒中。此外，镉在生物体内的半衰期较长且不易被降解，因此，镉极易通过食物链进入人体并在人体内累积，这将会严重地危害人类肾、肝、脑、骨髓等器官的健康；美国毒物管理委员会(atsdr)将镉命名为第六位对人类健康造成危害的物质，关于人体内镉的最大允许摄入量，世界卫生组织规定应≤1μg/(kg·d)。

nac转录因子是近年来发现的一类具有多种生物功能的植物特有的转录因子家族，它具有多方面的功能，如：参与植物的次生生长、激素调控、信号转导、调节植物矿物质水平、作物品质改良、植物的细胞分裂和植株的衰老过程中都发挥着重要的作用。研究显示，nac家族成员在植物生理发育等过程中起到广泛的调控作用，其参与植物的多个生长发育过程，如种子萌发、细胞分裂、细胞次生壁的合成、开花、衰老、侧根形成等，还参与植物对生物以及非生物胁迫的相应。越来越多的研究表明，nac转录因子在植物逆境及耐逆方面起着关键作用，特别是在重金属胁迫中起着重要的作用。因此，nac转录因子已成为当前植物基因功能及表达网络调控研究中的热点。

杨树具有耐性强、生长快、品种多，栽培范围大、面积广，枝叶繁茂、根系发达的特点，同时对重金属具有抗性和积累作用，而杨树中的毛白杨(populustomentosa)是我国特有的杨属白杨派树种，因此在毛白杨中研究镉胁迫条件下nac转录因子的调控作用，对于治理和修复重金属污染以及提高植物的抗逆性具有重要的参考价值和理论意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了镉胁迫条件下毛白杨中的一种差异表达的nacs转录因子及其获取方法，能够有效地判别出镉胁迫条件下毛白杨的重要nacs转录因子，从而对治理和修复镉金属污染以及提高植物的抗逆性奠定基础。

为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种镉胁迫条件下毛白杨中的一种差异表达的nacs转录因子，所述差异表达的nacs转录因子具有seqidno.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种上述方案所述的差异表达的nacs转录因子的获取方法，包括如下步骤：

1)将毛白杨进行镉胁迫处理后，获取镉胁迫条件下毛白杨中差异表达的候选nacs转录因子；

2)对镉胁迫处理后的毛白杨进行基因组测序，将得到的基因组序列与毛白杨种质资源库的基因进行比对，得到镉胁迫处理后的毛白杨的基因组snp数据，然后根据所述差异表达的候选nacs转录因子在基因组中的位置信息获取所述步骤1)的差异表达的候选nacs转录因子的snp位点；

3)测定与生长和光合作用相关的群体表现型性状的数据；

所述与生长和光合作用相关的群体表型性状包括：树高、胸径、材积、净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、胞间二氧化碳浓度、丙二醛含量和总蛋白含量；

4)将所述步骤2)的差异表达的候选nacs转录因子的snp位点和所述步骤3)的与生长和光合作用相关的群体表型性状进行关联分析，得到与上述性状显著关联的snps位点，根据与性状显著关联的snps位点筛选出与各性状显著关联的候选nacs转录因子，选择其中与性状显著关联个数最多的为nacs转录因子；

所述步骤2)与3)没有时间顺序的限定。

优选的，所述步骤1)中，所述镉胁迫处理的方法为将毛白杨幼苗的根部放入20mg/l的氯化镉水溶液中浸泡6h。

优选的，所述步骤1)中，获取镉胁迫条件下毛白杨中的差异表达的候选nacs转录因子的方法，包括以下步骤：

i.提取镉胁迫处理后的毛白杨叶片的总rna，将所述总rna进行转录组分析，得到转录组数据；

ii.将所述步骤i的转录组数据与未进行镉处理的毛白杨的转录组数据进行对比，获得差异表达的基因，并对差异表达的基因进行功能注释和富集分析，选择差异表达基因中含有nac功能域的转录因子为差异表达的候选nacs转录因子。

优选的，所述步骤2)中，得到基因组snp数据后，还包括将得到的基因组snp数据进一步筛选，删除单个基因型所对应的个体数有限的snp数据，筛选最小等位频率在5％以上，缺失数据在20％以内的snp位点，获得高质量snp数据，然后根据所述差异表达的候选nacs转录因子在基因组中的位置信息获取差异表达的候选nacs转录因子的snp位点。

优选的，所述步骤4)中筛选出与各性状显著关联的候选nacs转录因子的方法包括如下步骤：

(1)将所述步骤2)的差异表达的候选nacs转录因子的snp位点和所述步骤3)的与生长和光合作用相关的群体表型性状进行关联分析后的数据进行fdr检验，选择fdr＜0.1的snp位点作为显著关联位点；

(2)将所述步骤(1)的显著关联位点建立nacs转录因子与性状的关联网络，根据网络结构筛选出与各性状显著关联的候选nacs转录因子。

优选的，在所述步骤4)中筛选出与各性状显著关联的候选nacs转录因子后，还包括将所述步骤2)的基因组snp数据和所述步骤3)的群体表型数据进行上位性模式检测，构建候选nacs转录因子中两两转录因子间的相互作用关系网络，根据相互作用关系网络筛选出有上位性互作效应的候选nacs转录因子，选择其中上位互作效应最高的候选nacs转录因子为nacs转录因子。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：

本发明提供了提供了镉胁迫条件下毛白杨中的一种nacs转录因子及其获取方法。本发明采用高通量测序技术和生物信息学分析的方法，获取了镉胁迫条件下毛白杨中的差异表达的nacs转录因子；基于毛白杨种质资源库的重测序数据，发现了差异表达的nacs转录因子的snps位点；通过对差异表达的nacs转录因子内snps基因型位点与生长和光合作用相关的群体性状进行关联分析和上位性分析，确定了与性状显著关联的snps位点，发掘了与生长和光合作用显著关联的nacs转录因子以及它们之间的相互作用关系。本发明首次通过转录组分析和关联分析相结合的策略，获得了镉胁迫条件下毛白杨重要nacs转录因子，这些转录因子能够影响镉胁迫条件下毛白杨的生长和光合作用，对于治理和修复重金属污染以及提高植物的抗逆性具有重要的参考价值和理论意义。

附图说明

图1为显著差异表达的nacs转录因子与生长和光合作用相关的性状的关联网络；其中圆圈(节点)代表10个生长和光合作用相关的性状，方框(节点)代表14个nacs转录因子，连线(边)表示转录因子和性状相互关联；

图2为显著差异表达的nacs转录因子之间的相互作用关系网络；其中圆圈(节点)代表15个nacs转录因子，箭头连线(边)表示一个转录因子对另一个转录因子的上位性互作关系。

具体实施方式

本发明提供了一种镉胁迫条件下毛白杨中的一种差异表达的nacs转录因子，所述差异表达的nacs转录因子具有seqidno.1所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：

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本发明提供了一种上述方案所述的差异表达的nacs转录因子的获取方法，包括如下步骤：

1)将毛白杨进行镉胁迫处理后，获取镉胁迫条件下毛白杨中差异表达的候选nacs转录因子；

2)对镉胁迫处理后的毛白杨进行基因组测序，将得到的基因组序列与毛白杨种质资源库的基因进行比对，得到镉胁迫处理后的毛白杨的基因组snp数据，然后根据所述差异表达的候选nacs转录因子在基因组中的位置信息获取所述步骤1)的差异表达的候选nacs转录因子的snp位点；

3)测定与生长和光合作用相关的群体表现型性状的数据；

所述与生长和光合作用相关的群体表型性状包括：树高、胸径、材积、净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、胞间二氧化碳浓度、丙二醛含量和总蛋白含量；

4)将所述步骤2)的差异表达的候选nacs转录因子的snp位点和所述步骤3)的与生长和光合作用相关的群体表型性状进行关联分析，得到与上述性状显著关联的snps位点，根据与性状显著关联的snps位点筛选出与各性状显著关联的候选nacs转录因子，选择其中与性状显著关联个数最多的为nacs转录因子；

所述步骤2)与3)没有时间顺序的限定。

本发明将毛白杨进行镉胁迫处理后，获取镉胁迫条件下毛白杨中差异表达的候选nacs转录因子。

在本发明中，所述镉胁迫处理的方法优选为将毛白杨幼苗的根部放入20mg/l的氯化镉水溶液中浸泡6h。所述浸泡前优选将根部的泥土清洗干净。所述毛白杨幼苗优选为6个月大小的幼苗。

在本发明中，所述获取镉胁迫条件下毛白杨中的差异表达的候选nacs转录因子的方法，优选包括以下步骤：

i.提取镉胁迫处理后的毛白杨叶片的总rna，将所述总rna进行转录组分析，得到转录组数据；

ii.将所述步骤i的转录组数据与未进行镉处理的毛白杨的转录组数据进行对比，获得差异表达的基因，并对差异表达的基因进行功能注释和富集分析，选择差异表达基因中含有nac功能域的转录因子为差异表达的候选nacs转录因子。

在本发明中，所述提取镉胁迫处理后的毛白杨叶片的总rna的方法优选为采用rnaplantplus植物总rna提取试剂进行提取。

在本发明中，所述对差异表达的基因进行功能注释和富集分析的方法优选为利用swiss-prot(amanuallyannotatedandreviewedproteinsequencedatabase)数据库和nr(ncbinon-redundantproteinsequences)数据库对差异表达的基因进行功能注释和富集分析。

本发明对镉胁迫处理后的毛白杨进行基因组测序，将得到的基因组序列与毛白杨种质资源库的基因进行比对，得到镉胁迫处理后的毛白杨的基因组snp数据，然后根据所述获取差异表达的候选nacs转录因子在基因组中的位置信息获取所述步骤1)的差异表达的候选nacs转录因子的snp位点。

在本发明中，得到基因组snp数据后，优选将得到的基因组snp数据进一步筛选，删除单个基因型所对应的个体数有限的snp数据，筛选最小等位频率在5％以上，缺失数据在20％以内的snp位点，得到高质量snp数据，然后根据所述差异表达的候选nacs转录因子在基因组中的位置信息获取差异表达的候选nacs转录因子的snp位点。

在本发明中，所述差异表达的候选nacs转录因子在基因组中的位置信息优选包括基因本体、5′端上游2kb的启动子区和3′端下游1kb的侧翼序列。在本发明中，从所述高质量snp数据中得到差异表达的候选nacs转录因子的snp位点的方法优选为利用vcftools工具和python脚本相结合的方法。

本发明测定与生长和光合作用相关的群体表现型性状的数据。所述与生长和光合作用相关的群体表型性状包括：树高、胸径、材积、净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、胞间二氧化碳浓度、丙二醛含量和总蛋白含量。

在本发明中，所述净光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间二氧化碳浓度优选采用li6400光合测定仪测定。所述丙二醛含量和总蛋白含量优选采用试剂盒测定。在本发明中，所述丙二醛含量测定的试剂盒的品牌为solarbio，货号bc0020；所述蛋白质含量测定的试剂盒购自南京建成生物工程研究所，货号a045-2。

本发明将所述差异表达的候选nacs转录因子的snp位点和所述与生长和光合作用相关的群体表型性状进行关联分析，得到与上述性状显著关联的snps位点，根据与性状显著关联的snps位点筛选出与各性状显著关联的候选nacs转录因子，选择其中与性状显著关联个数最多的为nacs转录因子。

在本发明中，所述关联分析的方法优选为采用tasselv5.0中混合线性模型(mixedlinearmodel，mlm)进行关联分析。

在本发明中，所述筛选出与各性状显著关联的候选nacs转录因子的方法优选包括如下步骤：

(1)将所述步骤2)的差异表达的候选nacs转录因子的snp位点和所述步骤3)的与生长和光合作用相关的群体表型性状进行关联分析后的数据进行fdr检验，选择fdr＜0.1的snp位点作为显著关联位点；

(2)将所述步骤(1)的显著关联位点建立nacs转录因子与性状的关联网络，根据网络结构筛选出与各性状显著关联的候选nacs转录因子。

在本发明中，显著关联的标记点以p<0.001为标准，并通过r软件包中的q-value软件进行fdr检验。

在本发明中，优选将与各性状显著关联的候选nacs转录因子与生长和光合作用相关的群体表型性状之间建立关联网络图。在本发明中所述关联网络图优选采用cytoscape软件构建。

在本发明中，筛选出与各性状显著关联的候选nacs转录因子后，优选还包括将得到镉胁迫处理后的毛白杨的基因组snp数据和群体表型数据进行上位性模式检测，构建候选nacs转录因子中两两转录因子间的相互作用关系网络，筛选出有上位性互作效应的候选nacs转录因子，确定上位互作效应最高的为nacs转录因子。在本发明中，所述构建候选nacs转录因子中两两转录因子间的相互作用关系网络的方法优选为采用采用cytoscape软件构建。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

获取镉胁迫条件下毛白杨中的差异表达的候选nacs转录因子

利用当年生毛白杨优良无性系植株“1316”[p.tomentosacarr.(clone‘1316’)]为实验材料，该无性系种植于山东冠县国营苗圃(北纬:36°23′，东经:115°47′)。选取优良无性系植株当年生的幼嫩的枝条于1月份进行嫁接，于当年7月份选择长势良好并且基本一致的植株进行处理，即采用六个月大小的幼苗进行实验。首先将幼苗从土壤中取出，用水清洗小心清理根部，然后放入含有20mg/l的氯化镉的水溶液中进行处理，6h以后采取叶片样品，每个样品均包含三个生物学重复，取样后立即放入液氮中冻存。

采用rnaplantplus植物总rna提取试剂对叶片的总rna进行提取，操作步骤按提取试剂说明书进行。吸取1μl总rna溶液用利nanodrop进行测定，a260/a280取值在1.8～2.1之间即为合格的rna，将合格的rna样品用于文库构建，采用illuminahiseq平台进行测序，进行转录组分析。

从转录组数据中获得差异表达的基因，并利用swiss-prot(amanuallyannotatedandreviewedproteinsequencedatabase)数据库和nr(ncbinon-redundantproteinsequences)数据库对差异表达的基因进行功能注释和富集分析，得到20个差异表达的候选nacs转录因子，将其命名为ptonac1-20。其中有14个nacs转录因子表达上调，6个nacs转录因子表达下调，而ptonac19表达上调最明显，具体结果如表1所示。

表1差异表达的nacs转录因子

由表1可以看出：nacs转录因子在镉胁迫条件下毛白杨的生长发育过程中起着重要的作用，其中ptonac19可能扮演着非常关键的角色。

实施例2

获取差异表达的候选nacs转录因子的snp数据

利用基因组重测序技术测定435株毛白杨群体的基因组序列。将测序得到的基因组序列与毛白杨种质资源库的基因进行比对，获取镉胁迫处理后的毛白杨的基因组snp数据。然后筛选最小等位频率(minorallelefrequency，maf)在5％以上，缺失数据在20％以内的snp位点，最终获得的高质量snp数据。

基于群体重测序数据，将20个差异表达的候选nacs转录因子通过多重比对方法定位相应毛白杨基因，并提取snp数据，共获得了来自于20个nacs转录因子内的889个snp位点。

实施例3

对实施例2采用的435株毛白杨自然群体进行表型性状测定，包括以下10个生长和光合作用相关的群体表型数据：树高(height，h)、胸径(diameteratbreastheight，d)与材积(stemvolume，v)、净光合速率(netphotosystheticrate，pn)、气孔导度(sromatalconductance，sc)、蒸腾速率(transpirationrate,tr)、胞间co2浓度(intercellularco2concentration，ci)、丙二醛含量(malondialdehydecontent，mda)和总蛋白含量(totalproteincontent，p)。

利用生长性状测定工具测定其胸径、树高、材积，利用li6400光合测定仪测定净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、胞间co2浓度四个光合性状，利用试剂盒测定丙二醛含量和总蛋白含量。

实施例4

采用tasselv5.0中混合线性模型(mixedlinearmodel，mlm)将20个差异表达的候选nacs转录因子内snp数据与生长和光合作用等10个性状进行关联分析，显著关联的标记位点以p<0.001为标准，并通过r软件包中的q-value软件进行fdr检验，选择fdr<0.1的snp位点作为显著关联位点。共检测到14个候选nacs转录因子内52个snps与10个性状组成的71个显著的关联(p<0.001，q<0.1)，每一位点可解释表型变异率(r²)的3.81％～19.90％，具体结果如表2所示。基于14个显著关联的候选nacs转录因子，采用cytoscape软件构建候选nacs转录因子与性状的关联网络图，具体如图1所示。

表2候选nacs转录因子内snp和光合作用性状的关联

由表2可以看出：12个候选nacs转录因子内的39个显著的snps与胸径性状关联，数量最多；而对于净光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间co2浓度四个性状，分别仅有1个显著的候选nacs转录因子内的snp与其形成显著的关联，数量最少。另外，有17个显著的候选nacs转录因子内的snps可与2～3个性状显著关联。其中ptonac19_snp39和ptonac19_snp44分别与3个性状显著关联，分别是树高、胸径、材积和胸径、材积、总蛋白含量。

以nacs基因为单位，有12个多效性nacs基因可与2～5个性状显著关联。其中ptonac19基因与5个性状显著关联，分别为树高、胸径、材积、丙二醛含量和总蛋白含量。

以上结果表明毛白杨ptonac19转录因子在镉胁迫条件下通过生长和光合作用性状影响杨树的生长和发育过程。

实施例5

利用java中的mdr软件包将20个差异表达的候选nacs转录因子内的snp数据与生长和光合作用相关的群体表型数据进行了基因位点间的上位性互作效应模式的检测，最终发现15个候选nacs转录因子内的39个snp间存在99对显著的snp-snp上位互作性组合，与10个生长和光合作用相关性状形成关联。基于nacs转录因子之间的互作关系，采用cytoscape软件构建两两转录因子间的相互作用关系网络。

以上结果发现，9个候选nacs转录因子可与两个以上的其他的候选nacs转录因子有上位性互作效应，其中ptonac19转录因子可以和8个其他的nacs转录因子存在上位性互作效应，表明ptonac19转录因子在镉胁迫条件下杨树的生长发育过程中起着关键的调控作用，确定ptonac19为镉胁迫条件下毛白杨中的nacs转录因子，具有seqidno.1所示的核苷酸序列。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>北京林业大学

<120>镉胁迫条件下毛白杨中的一种差异表达的nacs转录因子及其获取方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

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<211>666

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