调控棕榈酸代谢异常诱导NOD信号通路在心肌损伤诊断防治的应用的制作方法

本发明涉及到监测棕榈酸水平在心肌损伤诊断中的应用以及nod样受体信号通路抑制剂在棕榈酸异常的心肌损伤诊断与防治中的应用。

背景技术：

乌头碱是一种剧毒生物碱，是川乌、草乌、附子等中药中主要的毒性成分，心脏是乌头碱的主要靶器官，乌头碱能够造成心律失常，最终诱导心肌细胞凋亡，造成心脏损伤，但目前对于乌头碱产生心脏损伤的机制研究普遍集中在离子通道，而对于乌头碱其它的导致心脏损伤原因尚未完全阐明。机体代谢紊乱后，异常的代谢物可能会引起进一步的损伤，从而与药物直接对靶器官或组织的损伤复合形成二次损伤，甚至有可能造成正反馈恶性循环导致损伤加剧。因此有必要对其造成的代谢物水平及代谢物功能进行监测，明确代谢物水平变化与药物毒性之间的相关性，从而防止药物对靶器官或组织造成二次损伤。棕榈酸（palmiticacid）是一种饱和脂肪酸，是人体内含量最多的游离脂肪酸，研究表明患心血管疾病（如冠状动脉粥样硬化性心脏病、心力衰竭等）以及脂代谢相关的疾病（如高脂血症）的发病率与体内游离脂肪酸的含量异常升高有密切关系。

代谢组学在基础研究和应用研究中得到了广泛的应用。内源性代谢物直接参与多个重要代谢通路和生物化学过程，代谢通路表达模式的改变与修正能够高灵敏地反馈机体对于毒性发生发展的代谢响应，进而从功能小分子地代谢通路动态调控角度助推复杂毒性机制的早期发现、机制解析及防控药物靶点发现。然而仅通过代谢组学，难以说明代谢物与疾病相关的分子机制。因此，从代谢生物标志物入手，分析相关代谢过程和分子信号通路，再结合其他组学信息互补更有利于药物作用机制探索。蛋白质组学着重于寻找和筛选不同样本之间的差异蛋白质谱，揭示机体对产生疾病的反应途径、进程，同时获得对关键蛋白的认识和功能分析。tmt或itraq标记的定量蛋白质组分析，具有灵敏度高、适用范围广、高通量的优势，对于药物作用进程，以及蛋白质效应靶点的筛选都具有重要意义。代谢组学和蛋白质组学相交汇，利用代谢组学能终端反映表型组的特点，以及蛋白质组学靶点发现的优势，为疾病的机制研究及疾病新靶点的发现提供可行性策略。

格列本脲（glibenclamide）是一种磺胺类药物，被广泛用于治疗2型糖尿病，目前已经发展为单药或者联合其他方法治疗糖尿病的基础药物。格列本脲通过阻断胰岛β细胞膜上atp敏感的钾通道而促进胰岛素释放，是一种口服促胰岛素分泌剂，目前研究发现格列本脲还具有广谱抗炎作用，是炎症小体nlrp3的抑制剂，同时格列本脲也还可以对缺血性卒中、颅脑外伤等中枢神经系统疾病发挥保护作用。

格列本脲目前主要用来治疗2型糖尿病，对心肌损伤的治疗尚未见文献报道。

技术实现要素：

本发明发现在乌头碱诱导的心肌损伤中棕榈酸水平异常升高可以激活nod样受体信号通路，诱发炎症进而加剧心肌损伤。监测棕榈酸水平可以诊断疾病或评估患者病情加重的风险，使用nlrp3的抑制剂格列本脲可以有效的减轻棕榈酸诱导的心肌损伤动物模型中的损伤程度。nlrp3抑制剂可以抑制棕榈酸激活的nod样受体信号通路的作用，从而减轻心肌损伤。这可以为临床上药源性药源性心脏毒性、脂代谢异常引起的心脏病或者与脂代谢相关疾病的诊断和防治提供新的策略和靶点。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

nlrp3抑制剂在减轻乌头碱代谢物诱导的心肌损伤药物中的应用；所述的nlrp3抑制剂指的是格列本脲；所述的乌头碱代谢物指的是：棕榈酸诱导nod样受体信号通路造成的心肌损伤二次损伤。

本发明进一步公开了nlrp3抑制剂格列本脲在抑制乌头碱代谢物棕榈酸诱导nod样受体信号通路降低心肌细胞损伤程度中的应用。

本发明更进一步公开了棕榈酸水平监测在诊断心肌损伤中的应用以及抑制棕榈酸诱导nod样受体信号通路用于治疗疾病的应用。实验结果显示：心肌损伤时动物体内棕榈酸水平异常升高，监测棕榈酸水平能诊断心肌损伤或评估患者病情加重的风险。使用nlrp3抑制剂格列本脲后，动物体内nod样受体信号通路中相关蛋白降低，心肌细胞损伤程度降低，可以减轻棕榈酸异常引起的心脏毒性。

本发明更加详细的描述如下：

（1）从机体内源性物质动态调控的角度阐释乌头碱致心肌损伤的分子机制，调控代谢物对心肌损伤的治疗提供临床治疗策略和靶点。具体机制是乌头碱影响脂肪酸代谢，造成心肌组织内棕榈酸水平异常升高，进而激活nod样受体信号通路诱发炎症反应，nod样受体信号通路相关蛋白及il-18、il-1β的表达量升高，加剧了乌头碱对心脏的损伤作用。本发明发现棕榈酸参与到乌头碱造成心肌损伤的二次损伤进程中，并起着关键的作用。这表明药物（如乌头碱）造成机体代谢紊乱后，异常的代谢物可能会引起进一步的损伤，从而与药物直接对靶器官或组织的损伤复合形成二次损伤，导致损伤加剧。因此对其造成的代谢物水平及代谢物功能进行监测，明确代谢物水平变化与药物毒性之间的相关性，从而防止药物对靶器官或组织造成二次损伤。这也提示我们棕榈酸水平在心脏疾病临床治疗当中可能有较高的价值：一方面，可以通过干扰棕榈酸的产生二次损伤作用的途径，防止疾病进一步的发展；另一方面，可以通过检测患者体内棕榈酸的水平和其他一些临床指标，诊断疾病或者评估患者病情加重的风险，做到早发现，早防治。

（2）进一步公开代谢组学和蛋白质组学两组学联用阐明机制的方法，从药物引起代谢异常进而产生毒性的角度出发，或许能为疾病产生途径及药物靶器官毒性机制的研究提供新的策略。具体为首先复制乌头碱致大鼠心律失常模型，通过定量蛋白质组学筛选差异蛋白，并进行kegg通路富集分析，发现关键信号通路为nod样受体信号通路。同时用代谢组学筛选差异性代谢物，得到的代谢组学数据采用多元统计分析，使用pca和pls-da确定差异代谢物质，分析确定与损伤心脏进程密切相关的关键代谢物为棕榈酸。在此基础上进行组学交汇分析及文献挖掘，获得乌头碱造成心脏损伤的可能作用机制为乌头碱影响棕榈酸代谢，含量异常升高，进而激活nod样受体信号通路诱发炎症，加剧心肌损伤。进一步以h9c2细胞系为对象进行体外研究，以mtt细胞活力检测技术明确关键代谢物对细胞损伤作用，同时以westernblot技术对关键信号通路蛋白表达量进行检测，并进一步采用shrna干扰技术验证关键信号通路蛋白的作用，最终确证了这一机制。

（3）我们给予大鼠一定量的棕榈酸，he染色结果和血清心肌酶谱结果显示大鼠产生心肌损伤，给药组动物注射棕榈酸后又给予一定量的格列本脲，结果显示给予nlrp3抑制剂后，nod样受体信号通路中相关蛋白nlrp3、caspase-1、il-18、il-1β表达降低，心肌损伤程度减轻，说明抑制nod样受体信号通路作用后可以减轻心肌损伤。

本发明主要考察了调控棕榈酸异常激活的nod样受体信号通路在心肌损伤诊断和治疗中的应用，重点解决了药源性心脏毒性、脂代谢异常引起的心脏病或者与脂代谢相关疾病的诊断与防治的问题，本发明创新点是将nlrp3抑制剂格列本脲应用到棕榈酸异常导致的心肌损伤的防治中，通过抑制nod样受体信号通路作用，减轻心肌损伤。同时发现监测体内棕榈酸的水平可以诊断心肌损伤或评估患者病情加重的风险，这一发现为临床药源性心脏毒性、脂代谢异常引起的心脏病或者与脂代谢相关疾病的诊断与防治提供新策略。

本发明的试验效果如下：

目前对于乌头碱产生心脏损伤的机制研究普遍集中在离子通道，而对于乌头碱其它的导致心脏损伤原因尚未完全阐明。机体代谢紊乱后，异常的代谢物可能会引起进一步的损伤，从而与药物直接对靶器官或组织的损伤复合形成二次损伤，甚至有可能造成正反馈恶性循环导致损伤加剧。因此有必要对其造成的代谢物水平及代谢物功能进行监测，明确代谢物水平变化与药物毒性之间的相关性，从而防止药物对靶器官或组织造成二次损伤。本发明从乌头碱影响棕榈酸进而加剧心脏损伤的机制出发，发现棕榈酸激活nod样受体信号通路在心肌损伤中的用途。检测患者体内棕榈酸的水平和其他一些临床指标，可以用来诊断疾病或者评估患者病情加重的风险。另外抑制棕榈酸激活的nod样受体信号通路可为临床药源性心脏毒性、脂代谢异常引起的心脏病或者与脂代谢相关疾病（如高脂血症）的诊断与防治提供新策略。

结论：本发明发现乌头碱导致棕榈酸水平异常升高，进而激活nod样受体信号通路诱发炎症反应，加剧心肌损伤程度。监测棕榈酸的水平可以诊断疾病或评估患者病情加重的风险，使用nlrp3抑制剂可以有效地减轻棕榈酸异常引起的心肌损伤，表明抑制nod样信号通路为药源性心脏毒性、脂代谢异常引起的心脏病或者是与脂代谢相关疾病（如高脂血症）提供新策略。

附图说明

图1为空白组与乌头碱组pca和pls-da得分图及roc曲线分析；其中a：正离子模式下的pca得分图b：负离子模式下的pca得分图c：pls-da正离子模式下得分图d：pls-da负离子模式下得分图；

图2为nod样受体信号通路简图；

图3为棕榈酸对原代心肌细胞和h9c2细胞中炎症因子和nod样受体信号通路关键蛋白的影响;其中a：不同浓度的棕榈酸对h9c2细胞中il-18含量的影响b：不同浓度的棕榈酸对h9c2细胞中il-1β含量的影响c：棕榈酸对h9c2细胞中nod样受体信号通路关键蛋白的影响；

图4为棕榈酸h9c2细胞活力的影响及干扰nlrp3，nod1/2后棕榈酸对h9c2细胞的细胞活力的影响；其中a：不同浓度的棕榈酸对h9c2细胞的抑制率b：shrna-nlrp3干扰后对细胞活力抑制作用的影响c：shrna-nod1干扰后对细胞活力抑制作用的影响d：shrna-nod2干扰后对细胞活力抑制作用的影响；

图5对nlrp3、nod1、nod2基因沉默干扰后，棕榈酸对nod通路关键蛋白表达的影响；其中a-d:shrna-nlrp3干扰对的nlrp3、caspase-1、il-18、il-1β表达的影响；e-j:shrna-nod1干扰对nod1、nod2、rip2、nlrp3、il-18、il-1β蛋白表达的影响；k-p:shrna-nod2干扰对nod1、nod2、rip2、nlrp3、il-18、il-1β蛋白表达的影响。其中pa：palmiticacid。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料例如nlrp3抑制剂格列本脲及试剂均有市售。

实施例1

1、动物实验：洁净级雄性wistar大鼠30只，体重为200±20g，将大鼠平均分为两组：（1）空白组给药生理盐水，剂量2ml(n=15,灌胃给药，d=7）；乌头碱组给药乌头碱剂量0.32mg/kg（n=15，灌胃给药，d=7）。在第7天给药30min后，对各组大鼠进行腹主动脉取血，离心得血清；摘除心脏，一部分进行病理学检查；另一部分，保存在液氮中用于蛋白质组学和代谢组学研究。

2、蛋白质组学分析：称取适量心脏组织样品至液氮预冷的研钵中，加液氮充分研磨至粉末。各组样品分别加入粉末4倍体积裂解缓冲液（8m尿素和1%蛋白酶抑制剂），超声裂解。4℃，12000g离心10min，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管。所得蛋白溶液用于蛋白定量、sds-page电泳、tmt标记、lc-ms/ms分析。

3、代谢组学样品分析：将冻存于液氮的心脏组织取出剪碎并混合均匀，每100mg加200μl预冷的生理盐水匀浆。取100μl匀浆液，加入1000μl甲醇，涡旋混匀1min，冰水浴超声10min，以13000rpm转速，4℃离心10min，吸取上清液1ml，氮气流下吹干临用前用100μl纯甲醇复溶，涡旋，离心，取上清液进行uplc/q-tof-ms分析。

4、数据分析：代谢组学获取数据后，进行数据处理，首先，原始数据经过markerlynxapplicationsmanagerversion4.1数据处理系统进行峰发现、峰对齐、峰匹配和峰强度校正等操作，以找出潜在的判别变量；其次，采用simca-p+11.5软件进行多元统计分析；利用spss17.0软件进行t-test检验，以获得具有统计学意义的潜在生物标志物（p<0.05）；最后，根据标志物的质量数（m/z值）在hmdb和kegg数据库中查找可能的物质，并对其进行物质鉴定。

蛋白质组学所得数据一方面通interpro数据库分析差异表达蛋白的功能结构域并对其进行富集。另一方面使用kegg数据库对蛋白通路进行注释，通过keggmapper将注释过的蛋白匹配入数据库相应的通路中。

5、结果：本发明对得到的代谢组学数据采用多元统计分析，使用pca和pls-da确定差异代谢物质。分析结果显示乌头碱组与对照组明显分离，见图1-1(a-b)，图1-2（c-d）表明乌头碱组中内源性物质已经发生变化。基于pls–da分析的基础，t-test后得到乌头碱组和对照组之间的具有显著性差异的物质(p<0.05)，然后在hmdb数据库中检索识别，从中鉴定出22个生物标志物（见表1）,其中饱和脂肪酸类成分棕榈酸变化明显。

采用roc曲线分析评价生物标志物的特异性和灵敏度，分析结果表明每个诊断标志物量化后的auc曲线下面积均大于0.7，表明其对诊断心肌损伤具有较好的准确性，损伤具有较好的诊断价值。总之，代谢组学分析结果表明棕榈酸的变化明显，可能与乌头碱引起的心脏损伤有潜在的关系。

蛋白质组学分析得到的数据使用kegg通路富集分析，通路富集分析结果表明nod样受体信号通路富集结果最为显著，并且此通路上富集到的差异蛋白主要包括rip2、nf-κb、fadd。这些蛋白在nod样受体信号通路中的位置及相互关系见图2，其中差异蛋白nf-κb，其存在于细胞核内的差异蛋白，其入核后调控nlrp3、il-18、il-1β等变化，是参与炎症发生、发展的重要蛋白。差异蛋白结构域的富集分析结果表明具有p53样转录因子-dna结合域的蛋白富集最为显著，有研究报道称nod受体基因核心启动子区域相似位置含有p53样的结合位点，并且p53样蛋白参与心肌细胞的炎性损伤及凋亡，这提示nod受体能参与心肌细胞炎性损伤。以上结果表明模型组大鼠心脏中的nod样受体炎症通路被激活，结合代谢组学和蛋白质组学结果，提出棕榈酸可能通过nod受体通路参与到乌头碱引起的心脏损伤过程中，造成第二次损伤的假设。

表1乌头碱给药7天后心脏组织差异代谢物

实施例2

1、细胞：原代心肌细胞有乳鼠心脏分离得到，分离后的细胞用含10%胎牛血清(fbs)、1%双抗(青霉素-链霉素混合溶液)的dmem培养液，置37℃含5%co2的恒温培养箱中继续传代培养。

2、mtt检测：使用mtt试剂盒（america,sigma）检测细胞的活力。

3、westernblotting分析：通过使用ripa裂解缓冲液获得细胞提取物，将提取物物进行sds-page电泳后，通过电印迹将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。然后将膜封闭并与抗体（nf-κb（america,cst）、rip2(america,sigma)、fadd(america,cst)、nlrp3(america,cst)、caspase-1(america,cst)、il-18(america,cst)、il-1β(america,cst))。将膜显色后得到的胶片用labworkstm凝胶成像及分析系统进行摄像，分析各组蛋白条带的亮度值。

4、将不同浓度的棕榈酸加入h9c2细胞后的细胞抑制率如图4所示。结果表明随着棕榈酸浓度的升高，细胞抑制率逐渐升高，表明棕榈酸对原代心肌细胞造成损伤，并呈浓度依赖性。24小时后，检测细胞中il-18、il-1β的含量，结果如图3中的a,b所示，检测结果表明il-18、il-1β含量逐渐升高且呈浓度依赖性。在h9c2细胞中加入500µmol/l的棕榈酸后，wb检测结果如图3中的c所示。结果表明与对照组相比，棕榈酸组rip2、fadd、nf-κb、nlrp3、caspase-1、il-18、il-1β的含量均显著性升高（p<0.05），这提示我们棕榈酸能激活h9c2细胞中的nod通路产生il-18、il-1β造成心肌细胞损伤。

棕榈酸能够激活心肌细胞中nod样信号通路产生il-18、il-1β造成心肌细胞损伤，为了证明干扰nod样受体信号通路上关键蛋白对心肌细胞有保护作用，在心肌细胞中加入shrna-nlrp3/nod1/nod2干扰后，检测心肌细胞的活力变化。mtt检测结果表明与棕榈酸组比较（见图4），三个干扰组的心肌细胞的活力较强。

我们利用shrna-nlrp3/nod1/nod2干扰质粒在h9c2细胞中对nlrp3、nod1、nod2进行干扰后，检测棕榈酸对细胞中关键蛋白含量的影响。结果见图5。结果表明，与对照组相比，棕榈酸组nod1、nod2、rip2、nlrp3、caspase-1、il-18、il-1β蛋白表达量显著性升高（p<0.05）；并且与棕榈酸组比较，棕榈酸+shrnanlrp3组相关蛋白表达显著性下降（p<0.05）；棕榈酸+shrnanod1组、棕榈酸+shrnanod2组中nod1、nod2、rip2、nlrp3、il-18、il-1β蛋白表达量显著性下降，表明棕榈酸可通过nlrp3及其下游参与炎症反应，并且nod1、nod2蛋白的激活和nlrp3在炎症反应中发挥重要的作用，在棕榈酸参与的心肌细胞炎性损伤中起到重要的作用。综合以上实验结果表明,乌头碱在直接造成大鼠心脏损伤的同时，还会干扰其体内代谢进程，造成心肌组织内棕榈酸水平异常升高，进而激活nod样受体信号通路诱发炎症反应，从而引发心脏二次损伤。

实施例3

实际应用

我们对动物实验中空白组和乌头碱组血清中的乳酸脱氢酶（ldh）、肌酸激酶-同工酶mb（ck-mb），结果表明相较于正常组，给药组的ldh、ck-mb（p<0.01）均显著升高，表明大鼠已出现心肌损伤，uplc/q-tof-ms测定血清中棕榈酸，结果显示棕榈酸水平也显著升高。这表明监测棕榈酸水平能诊断药源性心脏毒性。

实施例4

1、实验：洁净级雄性wistar大鼠45只，体重为200±20g，将大鼠平均分为三组（空白组、模型组、给药组），模型组大鼠静脉注射棕榈酸（5mm），每日两次；药物组同时灌格列本脲（10mg/kg），模型组和空白组给予等量生理盐水对应给药，每日1次，第7天各组大鼠进行腹主动脉取血，离心得血清，观测血清生化指标。通过全自动生化仪测定ldh、ck-mb的水平。

2、结果：各组大鼠he染色结果显示，空白组大鼠心肌纤维清晰，排列整齐，未见坏死及脂质沉积。模型组大鼠心肌纤维模糊，明显肿胀，有处纤维断裂，可见局部片状坏死及小灶性坏死，部分区域有较多炎细胞浸润，有脂质沉积。给药组大鼠心肌纤维较清晰，肌纤维肿胀，局部有少量炎细胞浸润，血管内皮肿胀，有少量脂质沉积。各组大鼠血清心肌酶谱ldh、ck-mb比较结果显示（见表3），与空白组相比，模型组大鼠的血清心肌酶谱ldh、ck-mb明显升高。与模型组相比，给药组大鼠的血清心肌酶谱ldh、ck-mb明显降低，说明nlrp3抑制剂格列本脲可以减轻模型组心肌损伤程度。与空白组相比，模型组中nod样受体信号通路激活，相关蛋白表达增加；与模型组相比，给药组给予nlrp3抑制剂后，相关蛋白表达降低，结果见表3。

综上可见，心肌损伤时，体内棕榈酸水平升高，nod样受体信号通路被激活，相关蛋白表达增加，格列本脲抑制nod信号通路下游蛋白nirp3，体内相关蛋白表达降低，从而减轻心肌损伤程度。因此，调控棕榈酸激活的nod样受体信号通路的抑制剂可以用于制备防治心肌损伤的药物。

表2各组大鼠血清心肌酶谱ldh、ck-mb比较

表3各组大鼠心肌组织中nlrp3、caspase-1、il-18、il-1β蛋白表达水平比较

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。