6-苄氨基嘌呤在制备预防和/或治疗急进高原导致的高原病的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及6-苄氨基嘌呤(6-ba)在制备预防和/或治疗急进高原导致的高原病的药物中的应用。

背景技术：

海拔3000m以上的高原低压低氧环境会对人体健康产生较大影响，尤其是未经适应锻炼的人员从平原急速进入高原时，极易发生急性高原病(acutemountainsickness，ams)，治疗不及时可进一步发展为高原肺水肿(highattitudepulmonaryedema，hape)和高原脑水肿(highattitudecerebraledema，hace)等危及生命。随着高原国防、经济建设和旅游人员的增加，寻找真正有效防治急性高原病的药物成为高原医学研究工作的一项急迫任务。

6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-ba)是一种植物生长调节剂中的细胞分裂素。6-ba具有抑制植物叶内的叶绿素、核酸、蛋白质分解，保绿防老，将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，而且有稳定、廉价和易于使用等特点，被广泛应用于植物组织培养、果实生长及蔬菜保鲜等。但是6-ba对于动物和人体的组织细胞是否具有防御氧化损伤的功能尚未见文献报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是如何预防和/或治疗急进高原低压低氧环境导致的急性高原病。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了6-苄氨基嘌呤或其药学上可接受的盐、酯的新用途。

所述6-苄氨基嘌呤的英文名称为6-benzylaminopurine，别名可为6-苯甲基腺嘌呤、6-ba、bap。cas登录号为1214-39-7。einecs登录号为19406。分子式为c12h11n5。分子量为225.25。外观为白色结晶粉末，难溶于水，微溶于乙醇，在酸、碱中稳定。结构式如式i所示。

本发明提供了6-苄氨基嘌呤或其药学上可接受的盐、酯在制备预防和/或治疗急进高原低压低氧环境导致的高原病的药物中的应用。

进一步的，所述高原病为急性高原病。所述急性高原病是进入高原地区，人体短期内暴露于低压低氧环境后产生的各种病理性反应，是高原地区独有的常见病。由平原快速进入海拔3000m以上高原，或由高原进入海拔更高地区，在数小时或1～3天内发病。

更进一步的，所述高原病可包括有下列表现之一或一种以上者：1)具有头痛、头昏、恶心呕吐、记忆与思维能力减退、失眠、多梦、呼吸深大、频率增加、心动过速、心慌、气短、胸闷、胸痛、嗜睡、食欲减退、腹胀、手足发麻等症状，且经检查不能用其他原因解释者。评价症状的程度主要依据头痛和/或呕吐的程度(轻、中、重度)，并结合其他症状。2)休息时仅表现轻度症状，如心慌、气短、胸闷、胸痛等，但活动后症状特别显著者。3)有下列体征者，如脉搏显著加快、血压轻度或中度升高(或降低)，口唇和/或手指发绀，眼睑和/或面部浮肿等，且经吸氧，或适应1-2周，或转入低海拔区后上述症状或体征明显减轻或消失者。

本发明还提供了6-苄氨基嘌呤或其药学上可接受的盐、酯在制备预防和/或治疗急进高原低压低氧环境导致的心肌组织水肿的药物中的应用。

上述应用中，所述心肌组织水肿还包括其导致的心室收缩和/或舒张功能障碍、心律失常、心力衰竭、房室传导阻滞等恶性心律失常造成的心源性猝死。

本发明还提供了6-苄氨基嘌呤或其药学上可接受的盐、酯在制备减轻急进高原低压低氧环境导致的心肌组织受损程度的药物中的应用。

上述应用中，所述心肌组织损伤可包括暴发性心肌炎和急性心肌炎。

本发明还提供了6-苄氨基嘌呤或其药学上可接受的盐、酯在下调急进高原低压低氧环境下的心肌组织中的水通道蛋白基因aqp1表达水平和/或mir-144-3p基因表达水平中的应用。

本发明还提供了6-苄氨基嘌呤或其药学上可接受的盐、酯在制备下调急进高原低压低氧环境下的心肌组织中的水通道蛋白基因aqp1表达水平和/或mir-144-3p基因表达水平的药物中的应用。

上述应用中，所述表达水平为mrna表达水平。

上述应用中，所述心肌组织为哺乳动物心肌组织；

所述哺乳动物包括人类。

以6-苄氨基嘌呤或其药学上可接受的盐、酯为活性成分在制备预防和/或治疗急进高原低压低氧环境导致的高原病的药物中的应用或在制备预防和/或治疗急进高原低压低氧环境导致的心肌组织水肿的药物中的应用或在制备减轻急进高原低压低氧环境导致的心肌组织受损程度的药物中的应用也均属于本发明的保护范围。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

上述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式；上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

mir-144-3p作为靶点在开发或筛选预防和/或治疗急进高原低压低氧环境导致的高原病的药物中的应用或mir-144-3p作为靶点在开发或筛选预防和/或治疗急进高原低压低氧环境导致的心肌组织水肿药物中的应用或mir-144-3p作为靶点在开发或筛选减轻急进高原低压低氧环境导致的心肌组织受损程度的药物中的应用也均属于本发明的保护范围。

抑制或降低mir-144-3p表达量和/或活性的物质在制备预防和/或治疗急进高原低压低氧环境导致的高原病的药物中的应用或抑制或降低mir-144-3p表达量和/或活性的物质在制备预防和/或治疗急进高原低压低氧环境导致的心肌组织水肿的药物中的应用或抑制或降低mir-144-3p表达量和/或活性的物质在制备减轻急进高原低压低氧环境导致的心肌组织受损程度的药物中的应用也均属于本发明的保护范围。

抑制或沉默mir-144-3p基因表达的物质在制备预防和/或治疗急进高原低压低氧环境导致的高原病的药物中的应用或抑制或沉默mir-144-3p基因表达的物质在制备预防和/或治疗急进高原低压低氧环境导致的心肌组织水肿的药物中的应用或抑制或沉默mir-144-3p基因表达的物质在制备减轻急进高原低压低氧环境导致的心肌组织受损程度的药物中的应用也均属于本发明的保护范围。

本发明运用综合实验舱模拟海拔7000m高原环境，观察了6-苄氨基嘌呤(6-ba)对于急进高原后高原低压低氧环境所致大鼠心肌水肿的保护作用，并探索了相关机制。通过实验结果表明，6-ba可减少高原低压低氧大鼠心肌组织的含水量，减轻急进高原低压低氧环境导致的心肌组织受损程度，下调急进高原低压低氧环境下的大鼠心肌组织中aqp1mrna表达水平及mir-144-3p表达水平。上述结果说明6-ba具有防治高原低压低氧所致的心肌组织水肿的作用。本发明的化合物6-ba对于急进高原低压低氧环境下产生的高原病具有较好的治疗作用，对治疗模拟7000米高原环境大鼠的心肌组织水肿具有显著效果，可开发成防治高原低氧环境产生的高原病的药物。

附图说明

图1为大鼠心肌组织含水量测定结果。各处理组大鼠n＝6，**p＜0.01vscon；##p＜0.01vshh。

图2为大鼠心肌组织he病理切片结果(x20光镜)。从左至右依次为con组、hh组和6-ba组。对照组(con组)的大鼠心肌组织：大鼠心肌细胞界限清楚，粉红色，可见肌原纤维和横纹，胞核清晰。低氧组(hh组)大鼠心肌组织：大鼠心肌灶状变性，肌束稀疏。6-ba组大鼠心肌组织：大鼠心肌灶状变性，肌束稀疏。6-ba组大鼠心肌组织受损程度低于低氧组。

图3为大鼠心肌组织aqp1mrna检测结果。各处理组大鼠n＝6，**p<0.01vscon；#p＜0.05vshh。

图4为大鼠心肌组织mir-144-3p检测结果。各处理组大鼠n＝6，**p＜0.01vscon；#p＜0.05vshh。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的六周龄spf级sd大鼠，体重200±20g，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证号scxk(京)2016-0006。所有动物实验均通过伦理委员会审核。

实施例1、6-ba在制备防治急进高原导致的高原病的药物中的应用

一、实验材料与方法

1、实验材料：六周龄spf级sd大鼠，体重200±20g，雄性。

2、实验分组：采用随机数字表法将sd大鼠随机分为高原低氧实验组、6-ba干预组和常压常氧对照组。每组18只动物。各组处理方法分别如下：

高原低氧实验组(简称低氧组或hh组)：应用实验舱(贵州风雷航空军械有限责任公司)模拟高原低压低氧条件。将sd大鼠置于实验舱内进行高原低压低氧处理7天。实验舱参数设定：模拟海拔高度7000m，升降速度10m/s，舱内压力56kpa，舱内氧气压力8.6kpa，舱内温度22.8℃，舱内湿度24％rh。实验舱运行时间23h/日，昼夜比12h/12h。每日上午开仓1小时更换饲料、饮用水和垫料。同时将等体积饮用水(与6-ba干预组所用的6-ba溶液体积相同)在每日开仓时进行大鼠灌胃，连续灌胃7天。

6-ba干预组(简称6-ba组)：应用实验舱(贵州风雷航空军械有限责任公司)模拟高原低压低氧条件。将sd大鼠置于实验舱内进行高原低压低氧处理7天。实验舱参数设定：模拟海拔高度7000m，升降速度10m/s，舱内压力56kpa，舱内氧气压力8.6kpa，舱内温度22.8℃，舱内湿度24％rh。实验舱运行时间23h/日，昼夜比12h/12h，每日上午开仓1小时更换饲料、饮用水和垫料。同时将6-ba(美国sanland公司，批号为201212201，规格为25g/每瓶)溶于浓度为0.06mol/l的稀hcl中，配制成浓度为10g/l的6-ba储备液。按照100mg/kg/d剂量在每日开仓时进行大鼠灌胃，连续灌胃7天。

常压常氧对照组(简称对照组或con组)：常压常氧对照组大鼠置于实验舱外，处理等同于实验组大鼠。

3、实验方法：三组动物完成实验出舱后断颈法处死，摘取完整心脏进行he染色观察组织病理学变化。采用干湿重法测定心肌组织含水量。real-timepcr检测心肌组织水通道蛋白1(aquaporin1，aqp1)mrna表达水平以及mir-144-3p表达水平。

心肌组织含水量检测方法的具体步骤如下：各组动物麻醉处死后，剖开胸腔，无菌条件下取出心脏，4℃生理氯化钠溶液漂洗，滤纸吸干后，用电子天平称心脏湿质量后，置80℃恒温干燥箱烘干48h至恒质量，称心脏干质量，按照如下公式计算心肌组织含水量：心肌组织含水量＝{(心脏湿重-心脏干重)/心脏湿重}×100％。

心肌组织病理检测方法的具体步骤如下：各组动物麻醉处死后，剖开胸腔，无菌条件下取出心脏。4℃条件下pbs溶液漂洗，滤纸吸干。组织脏器用40ml/l多聚甲醛溶液固定24h，常规脱水，石蜡包埋，连续切5片，片厚约4μm，he染色，中性树胶封片，光镜下观察心肌组织病理学变化。

心肌组织aqp1mrna表达水平的real-timepcr检测具体步骤如下：取各组大鼠的心肌组织标本各100mg，采用trizol法提取组织总rna。通过reversetranscriptionkit将rna逆转录为cdna，使用荧光定量pcr试剂盒对心肌组织aqp1mrna进行测定。检测总体系为25μl(其中上下游引物各0.5μl、premix12.5μl、cdna模板2μl、ddh2o9.5μl)。pcr程序参照试剂盒中提供的两步法检测：95℃30s，95℃5s，60℃30s，共40个循环。各组实验独立重复3次。以β-actin作为内参基因，采用2^-δδct法计算mrna相对表达量，引物由上海生工合成。各基因扩增的上下游引物序列如下：

aqp1上游引物：5’-gccagcgagttcaagaag-3’；

aqp1下游引物：5’-tccaccaccctgttgctgta-3’。

β-actin上游引物：5'-ttcgcgggcgacgatgc-3'；

β-actin下游引物：5'-cgaagtccagggcgac-3'。

其中，aqp1上游引物和aqp1下游引物扩增产物大小为230bp；β-actin上游引物和β-actin下游引物扩增产物大小为310bp。

心肌组织mir-144-3p表达水平的real-timepcr检测具体步骤如下：取各组大鼠的心肌组织标本100mg，采用trizol法提取组织总rna。应用反转录试剂盒mir-x^tmmirnasfirst-strandsynthesiskit将待测rna反转录成cdna。采用sybrqpcrpremixkit试剂盒和7500定量pcr仪进行pcr反应。pcr反应条件：95℃10s，95℃5s，65℃20s，共40个循环。采用2^-δδct法计算mirna相对表达水平，其中δct＝ct目的基因-ct内参基因。各组实验独立重复3次。以cel-mir-39为内参基因，mirna特异性引物由广州锐博公司合成。引物序列如下：

rno-mir-144-3p：

茎环引物：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagcacttacag；

上游引物：5'-tcggcaggtacagtatagatg-3'；

下游引物：5'-ctcaactggtgtcgtgga-3'；

cel-mir-39：

茎环引物：

tcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgccaagct；

上游引物：5'-agtgcacggtccgaggtatt-3'；

下游引物：5'-cgggtgtaaatcagcttggt-3'。

统计学方法如下：采用spss17.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，进行正态分布和方差齐性检验。多组间比较采用单因素方差分析，两组间差异采用独立样本t检验。以p＜0.05定义为差异具有统计学意义。

二、实验结果

1、大鼠心肌组织含水量检测结果

大鼠心肌组织含水量检测结果如图1、表1所示。

与对照组比较，低氧组和6-ba组大鼠心肌组织含水量均显著升高(p<0.01)。与低氧组比较，6-ba组大鼠心肌组织含水量降低(p<0.01)。说明6-ba可减轻高原低压低氧导致的心肌水肿。

表1.心肌组织含水量检测结果

2、大鼠心肌组织病理变化

大鼠心肌组织病理切片结果如图2所示。

对照组大鼠心肌组织：心肌细胞界限清楚，粉红色，可见肌原纤维和横纹，胞核清晰。低氧组大鼠心肌组织：心肌灶状变性，肌束稀疏。6-ba组大鼠心肌组织：心肌可见少量灶状变性。心肌病理显示6-ba组大鼠心肌组织受损程度低于低氧组。

3、大鼠心肌组织aqp1mrna检测结果

大鼠心肌组织aqp1mrna检测结果如图3、表2所示。

与对照组比较，低氧组大鼠心肌组织aqp1mrna表达水平显著升高(p<0.01)，6-ba组大鼠心肌组织aqp1mrna表达水平未见显著变化(p>0.05)。与低氧组比较，6-ba组大鼠心肌组织aqp1mrna表达水平降低(p<0.05)。说明6-ba可下调高原低压低氧环境下的心肌组织中的aqp1mrna表达水平。

表2.大鼠心肌组织aqp1mrna检测结果

4、大鼠心肌组织mir-144-3p检测结果

大鼠心肌组织mir-144-3p检测结果如图4、表3所示。

与对照组比较，低氧组大鼠心肌组织mir-144-3p表达水平显著升高(p<0.01)，6-ba组大鼠心肌组织mir-144-3p表达水平未见显著变化(p>0.05)。与低氧组比较，6-ba组大鼠心肌组织mir-144-3p表达水平显著降低(p<0.05)。说明6-ba可下调高原低压低氧环境下的心肌组织中的mir-144-3p表达水平。

表3.大鼠心肌组织mir-144-3p检测结果

上述结果表明，6-ba可降低高原低压低氧大鼠心肌组织含水量，抑制高原低压低氧大鼠心肌组织中aqp1mrna和mir-144-3p的表达，说明6-ba具有防治高原低压低氧心肌水肿的作用。推测其机制可能与6-ba调控心肌组织aqp1/mir-144-3p相关的水转运相关。本发明的化合物6-ba对于急进高原低压低氧环境下产生的高原病具有较好的治疗作用，对治疗模拟7000米高原环境大鼠的心肌水肿具有显著效果，可开发成防治高原低氧环境产生的高原病的药物。