布立尼布作为治疗登革病毒感染的药物及其制药用途的制作方法

本发明涉及医药领域,具体涉及一种化合物制备治疗黄病毒类的药物中的用途。

背景技术：

登革病毒(denguevirus,denv)属黄病毒科，黄病毒属(flaviviridae),是当今世界上分布最广的一种虫媒病毒，主要由叮咬人的埃及伊蚊和白纹伊蚊传播引起登革热，其中以出现登革出血热/登革休克综合征(denguehemorrhagicfever/dengueshocksyndrome,dhf/dss)更为严重。该病毒有四个血清型，血清2型是流行病株登革热(denguefever)是经蚊媒传播的急性传染病，主要在热带、亚热带地区流行见图一。自1779年首次发现登革热以来，世界各地陆续爆发登革热疫情。据who估计，目前全球约2/5的人口受到登革热的威胁，每年有亿计的人感染该病毒。我国除台湾地区有流行外，其疫情主要集中在广东，多呈爆发和输入性流行的特征，已知的4种血清型登革病毒在我国均有发现，而且呈扩散加大的趋势。目前，登革病毒感染的机制扔不明确，由于各血清型之间缺乏有效的交叉保护，又存在抗体依赖的增强作用等，至今仍无安全有效的疫苗可用，临床上还没有有效的治疗药物。虽然发现了许多针对登革热病毒主要蛋白的活性分子，但由于种种原因(如毒副作用等问题)，目前还没有针对登革热病毒的药物和疫苗，因此，针对登革热的抗病毒活性分子的发现具有重要的生物学研究意义和实践意义，为开发登革热病毒的有效药物提供支持。

目前，登革病毒感染的机制仍不明确，由于各血清型之间缺乏有效的交叉保护，又存在抗体依赖的增强作用等，至今仍无安全有效的疫苗可用，临床上还没有有效的治疗药物。虽然发现了许多针对登革热病毒主要蛋白的活性分子，但由于种种原因(如毒副作用等问题)，目前还没有针对登革热病毒的药物上市。

本发明涉及的化合物布立尼布brivanibalaninate是2006年发表的一种atp竞争性的vegfr2抑制剂【bhide,rajeevs.,etal."discoveryandpreclinicalstudiesof(r)-1-(4-(4-fluoro-2-methyl-1h-indol-5-yloxy)-5-methylpyrrolo2,1-f1,2,4triazin-6-yloxy)propan-2-ol(bms-540215),aninvivoactivepotentvegfr-2inhibitor."journalofmedicinalchemistry49.7(2006):2143-6.】。对于本发明涉及的布立尼布brivanibalaninate在制备治疗或预防2型登革热病毒感染药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对2型登革热病毒抑制活性具有良好的效果，不存在由于其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于登革热病毒感染的治疗和防治显然具有显著的进步，极有可能被开发成新型的抗登革热感染的药物。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种brivanibalaninate，即式i所示化合物在作为制备治疗或预防登革病毒感染药物中的应用，brivanibalaninate在10.0μm浓度下对2型登革热病毒的抑制率为107.64％。而brivanibalaninate在10.0μm条件下，对bhk-21细胞的存活率为92.74％。brivanibalaninate能够有效地抑制登革热病毒的增值，单是对细胞毒性很小，可进一步开发为治疗登革热病毒感染的药物，具有广泛的应用前景。

所述化合物brivanibalaninate结构如式i所示：

本发明涉及的化合物brivanibalaninate是一种atp竞争性的vegfr2抑制剂，是brivanib的前体药物。对于本发明涉及的brivanibalaninate在制备治疗或预防2型登革热病毒感染药物中的用途属于首次公开，而且其对2型登革热病毒抑制活性具有良好的效果，不存在由于其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于登革热病毒感染的治疗和防治显然具有显著的进步，极有可能被开发成新型的抗登革热感染的药物。

本发明一个方面提供了式i所示化合物或其药物可接受盐在制备治疗或预防黄病毒类病毒感染的药物中的用途

本发明另一个方面提供了式i所示化合物或其药物可接受盐在制备治疗或预防登革病毒感染的药物中的用途。

在本发明的技术方案中，登革病毒为登革病毒1-4型。

在本发明的技术方案中，登革病毒为登革病毒2型。

本发明再一个方面提供了式i所示化合物或其药物可接受盐在制备抑制登革病毒中ns3和e蛋白的mrna的药物中的用途。

本发明再一个方面提供了式i所示化合物或其药物可接受盐在制备抑制登革病毒中ns3和e蛋白的蛋白质表达的药物中的用途。

本发明再一个方面提供了一种治疗登革病毒感染的药物组合物，其含有作为活性物质的式i所示化合物或其药物可接受盐。

在本本发明的技术方案中，所述药物组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂。

在本发明的技术方案中，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。

附图说明

图1为brivanibalaninate对denv2感染后的bhk-21细胞内病毒rna的抑制作用。

图2为brivanibalaninate对denv2感染后的bhk-21细胞内病毒蛋白合成的抑制作用。

图3为brivanibalaninate对denv2感染后的bhk-21细胞产生子代病毒的抑制作用。

具体实施方式

实施例1brivanibalaninate对bhk-21细胞的毒性实验：

bhk-21细胞(乳仓鼠肾细胞)是denv2的易感细胞。实验中的bhk-21细胞为本科室所有；mtt购自碧云天生物技术研究所；胎牛血清购自美国gibico公司；细胞培养板购自美国康宁公司；rpmi1640培养基购自美国gibico公司。

实验步骤如下：

1接种bhk-21细胞：用含10％(v/v)胎牛血清的rpmi1640培养基配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100μl

2培养bhk-21细胞：在37℃，5％(v/v)co2培养条件下培养24小时；

3加入brivanibalaninate：吸弃每个孔中的培养基，向各个孔加入100μl用10％(v/v)胎牛血清的rpmi1640培养基稀释成相应浓度的brivanibalaninate，对照孔加入不含药物的10％(v/v)胎牛血清的rpmi1640培养基100μl；

4呈色：培养48小时后，每孔加5mg/mlmtt溶液10μl，在37℃，5％(v/v)co2培养条件下继续培养4小时，然后加入dmso，至普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解；

5测量与计算：在570nm测定吸收值，brivanibalaninate不同浓度下的细胞的存活率为该浓度下细胞吸光度值比上对照孔的吸光值，再乘以100％。

表1不同浓度的brivanibalaninate对bhk-21细胞的毒性实验

实验结果证明不同浓度的brivanibalaninate对bhk-21存活率基本没有影响，显示出brivanibalaninate毒性教低。

实施例2brivanibalaninate对denv2的抑制实验：

以bhk-21为培养病毒denv2的细胞，10tcid50，实验步骤如下：

1在细胞培养板中接入bhk-21，24小时后细胞长至单层，细胞覆盖孔底的面积约为80％～90％，吸出培养基，pbs洗1次，接入病毒样品200μl，37℃吸附1小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，pbs清洗1次。加入含10％(v/v)胎牛血清的rpmi1640培养基稀释的指定浓度的brivanibalaninate，于37℃5％(v/v)co2培养条件下培养。96小时后，细胞出现明显的细胞病变之后，收集上清，测上清中细胞释放的乳酸脱氢酶(ldh)含量；或培养至48小时后，收集细胞上清，做病毒空斑实验；或培养至48小时后，收集细胞的总蛋白总mrna分别通过蛋白免疫印迹法和实时荧光定量pcr检测细胞内病毒蛋白的含量和病毒rna的含量。

2测上清中细胞释放的乳酸脱氢酶含量：吸取96孔板细胞上清120μl，用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(ldhcytotoxicityassayki，beyotime)检测denv所致细胞毒性时释放的乳酸脱氢酶的活性。

表2不同浓度的brivanibalaninate对denv2感染的bhk-21细胞释放的ldh的影响

实验结果：实验结果表明在10μm的浓度下，brivanibalaninate对denv2感染导致的bhk-21细胞死亡具有很强的保护作用，其抑制效果达到107.64％。而在该浓度时，bhk-21细胞的存活率约92.74％。

实施例3brivanibalaninate对denv2关键蛋白ns3和e蛋白的mrna抑制试验

1收集细胞总rna：6孔细胞培养板每孔加入1mltrizol试剂(ambion)，室温放置5分钟后，吸取上清液至1.5mleppendorf管；每管加0.2ml氯仿，震荡，室温孵育15分钟，4℃12000rpm离心15分钟，吸取上层液相转入另一个1.5mleppendorf管；加入0.5ml异丙醇，震荡，室温孵育10分钟，4℃12000rpm离心10分钟；吸弃上清，加入75％(v/v)乙醇1ml，洗涤沉淀，4℃12000rpm离心10分钟，吸弃上清；室温下晾干使之变透明；加入depc处理双蒸水20μl溶解rna，-80℃保存备用；紫外分光光度计检测260/280吸光度比值，计算rna浓度。

2将rna逆转录为cdna：反应体系：rna1mg，5×primescriptrtmastermix(takara)4μl，depc处理的三蒸水至总体积20μl。小心混匀后37℃15min，85℃5秒。

3实时荧光定量pcr检测各样品的病毒包膜蛋白以及非结构蛋白1的rna水平：反应体系(10μl)：cdna模板1μl，qpcrmastermix(promega)5μl，正反引物0.4μl，depc处理的三蒸水3.2μl。混匀后，95℃10分钟预变性，95℃15秒，60℃1分钟(40个循环)。

表3各目标rna的正反引物

4计算：根据各样品的ct值运用2-δδcт法算出各样品相对于对照组的rna水平。

实验结果：参见附图1，brivanibalaninate处理后，denv2关键蛋白ns3和e蛋白的mrna水平显著降低，并具有浓度依赖性。在5和10μm的浓度下，显著降低了ns3和e蛋白的mrna水平。显示其具有抑制登革病毒的复制和扩增的能力。

实施例4brivanibalaninate对denv2病毒关键蛋白ns3和e蛋白的蛋白质表达抑制试验

1收集细胞总蛋白：bhk-21细胞用药物以及登革病毒(denv2)处理后，48h提蛋白：冷pbs洗细胞，6孔板每孔加入ripa裂解液(ripa裂解液(凯基生物)加入磷酸酶抑制剂(凯基生物)和蛋白酶抑制剂(凯基生物))每孔100μl，刮刀刮下收集于1.5mleppendorf管，4℃12000rcf离心15min，转移上清至新eppendorf管中。

2检测样品蛋白浓度：蛋白标准品用双蒸水稀释至0，0.0008，0.0016，0.0032，0.004，0.006，0.008mg/ml的梯度浓度；取蛋白标准品和蛋白样品各2.5μl加入到24孔板中，每孔加入1×g250工作液1.5ml，使每孔终体积为2.5ml，室温震荡3分钟，用酶标仪测定每孔570nm吸光；根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。处理数据，样品加入相应体积的ripa裂解液和上样缓冲溶液使每个样品蛋白浓度一致。100℃变性5min，-20℃保存备用。

3蛋白免疫印迹检测梯度浓度brivanibalaninate处理后的登革病毒蛋白的表达差异：10％sds聚丙烯酰胺凝胶的配置：按顺序加入各种试剂，配置10％的分离胶迅速在玻璃间隙灌注，流出灌注浓缩胶所需的时间(约梳子下方下缘的0.8cm)，迅速在分离胶上覆盖一层无水乙醇，待分离胶聚合后，倒去无水乙醇层，用滤纸吸干，继续灌注浓缩胶，插上梳子。电泳：接通电源，起始用80v恒压进行电泳，待染料前沿进入分离胶后，再改为120v，根据预染蛋白marker的分离程度和目标蛋白的分子量确定电泳时间，一般跑75min左右。

4转膜：从玻璃板中取出凝胶，剪切凝胶大小的pvdf膜，并在甲醇中浸泡1min，再用转移缓冲液(1*tris/glycinebuffer，biorad)浸泡5min。将凝胶，滤纸，pvdf膜都浸泡在转移液中，按以下顺序安装转膜装置：负极--棉垫--滤纸--凝胶--pvdf膜--滤纸--棉垫--正极，上述物品逐一叠放，准确对齐。将转膜装置置于转膜盒内，确认电极无误，加入转膜液至覆盖整个转膜装置，转膜盒及上方均用冰块覆盖，接通电源，100v恒压转膜70min左右，结束后，取出pvdf膜。

5蛋白封闭：将pvdf膜置于封闭液中，室温摇床浸泡1h，以封闭非特异性抗原。封闭后，tbs/tt室温摇床洗膜3次，每次5min接着孵育一抗。

6一抗杂交：将pvdf膜蛋白面向上置于小盒子内，加入含有登革病毒包膜蛋白(denguevirusenvelopeproteinantibody，genetex)和非结构蛋白1(denguevirusns3glycoproteinantibody，abcam)一抗的tbs/t配置的5％(w/v)脱脂牛奶缓冲液，4℃摇床过夜。pbst室温摇床洗膜六次，每次5min。

7二抗杂交：将pvdf膜蛋白面向上置于小盒子内，加入含有二抗(兔抗或鼠抗，proteintech)的tbs/t配置的5％(w/v)脱脂牛奶缓冲液，室温摇床1小时。pbst室温摇床洗膜六次，每次5min。

8化学发光显影：按比例均匀加入ecl显影液a/b液(cst)，将pvdf膜浸泡在发光液中，反应2min。取出pvdf膜，置于暗盒中，暗室曝光，放置x光底片，曝光，取出显影，晾干胶片，记录，保存。

实验结果：参见图2，brivanibalaninate处理后，denv2关键蛋白ns3和e蛋白表达水平显著降低，并呈浓度依赖性。在5和10μm的浓度下，显著降低了ns3和e蛋白的表达水平，跟基因水平的结果一直。显示其确实具有抑制登革病毒关键蛋白表达的作用。

实施例5brivanibalaninate对denv2病毒的空斑抑制试验

1在24孔板中接入c6/36细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约90％～100％)，吸弃各孔中的培养基，pbs洗1次，接入用pbs稀释的病毒样品200μl，37℃吸附1小时。

2吸附完成后将各个孔的上清吸弃，pbs洗去未吸附的病毒。加入含1.2％甲基纤维素2％(v/v)胎牛血清的rpmi1640培养基，于37℃，5％(v/v)co2的培养箱中培养96～120小时。

3待空斑形成后吸弃甲基纤维素覆盖培养基用4％多聚甲醛(博士德生物)固定，再用1％(w/v)结晶紫染色，2小时后用流水冲去结晶紫，晾干后扫描24孔板，根据空斑数判断mol-5对denv2感染后的bhk-21细胞产生子代病毒的抑制作用。

实验结果：参见图3，病毒的空斑实验确定病毒感染后子代病毒的数量和感染能力。结果显示处理后，denv2病毒感染bhk-21细胞后产生的子代病毒数量和感染能力显著降低。

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