一种口蹄疫免疫增强剂、制备及其应用的制作方法

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种口蹄疫免疫增强剂、制备及其应用。
背景技术：
：口蹄疫(foot-and-mouthdisease,fmd)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,fmdv)引起的一种感染牛、羊和猪等偶蹄动物、具有高度传染性的动物疫病。该病毒具有7个血清型：a、o、c、sat1、sat2、sat3以及asia1型，且每个血清型又包含了若干个亚型。疫苗免疫是控制该病的关键措施之一，在我国，口蹄疫疫苗属于强制免疫疫苗，灭活疫苗是目前使用的疫苗主体，也是目前防控最有效的手段，但是还存在抗体合格率较低、免疫持续期较短的技术问题。免疫增强剂是快速改善疫苗免疫效力的方法，不改变现有生产工艺，研发周期短，制备方法简单，使用方便。现有用于口蹄疫的免疫增强剂虽然能显著提高口蹄疫灭活疫苗的免疫效力，但是免疫增强剂保存期短，保存后再用于疫苗配制，会导致免疫增强效力显著下降。技术实现要素：本发明的主要目的是提供一种口蹄疫免疫增强剂，不仅能够显著提高口蹄疫疫苗免疫后的抗体效价和免疫持续期，而且保存一年后，仍然能够显著提高口蹄疫疫苗免疫后的抗体效价。本发明的再一目的是提供所述口蹄疫免疫增强剂的制备方法，采用该方法能够获得的免疫增强剂在保存一年后，仍然能够显著提高口蹄疫疫苗免疫后的抗体效价。本发明的另一目的是提供所述口蹄疫免疫增强剂的应用，对于仔猪只需要免疫一次一针就可以保护到出栏，抗体持续期延长至6个月以上，显著降低养猪成本。本发明的目的采用如下技术方案实现：一种口蹄疫免疫增强剂，所述口蹄疫免疫增强剂是将黄芪多糖、磷酸三苯酯、透明质酸和胞壁酰二肽依次溶解于溶剂后得到的，所述免疫增强剂中胞壁酰二肽的浓度为80-220μg/ml，磷酸三苯酯的浓度为20-60mg/ml，透明质酸的浓度为1-6μg/ml，黄芪多糖的浓度为1-6mg/ml。在本发明中，所述溶剂为生理盐水、注射用水、pbs缓冲液、tris-hcl缓冲液或hank’s液。优选的技术方案中，所述溶剂为ph8.0的tris-hcl缓冲液。本发明还提供所述口蹄疫免疫增强剂的制备方法，是将黄芪多糖、磷酸三苯酯、透明质酸和胞壁酰二肽依次溶解于溶剂后得到所述口蹄疫免疫增强剂。在本发明中，所述溶剂为生理盐水、注射用水、pbs缓冲液、tris-hcl缓冲液或hank’s液。优选的技术方案中，所述溶剂为ph8.0的tris-hcl缓冲液。本发明还提供含有所述免疫增强剂的口蹄疫疫苗。在本发明中，将免疫增强剂与吐温-80按照体积比为96:4混合均匀，得到水相；白油与司本-80按照体积比为96:4混合均匀，得到油相；将水相与油相按照体积比为1:2混合，乳化，得到伴侣疫苗；将伴侣疫苗与商品化口蹄疫疫苗按照体积比为1：25～100混合，搅拌均匀，得到所述口蹄疫疫苗。在本发明中，将免疫增强剂与灭活的猪o型口蹄疫病毒液按照体积比为1:100混合均匀，得到水相溶液；将水相溶液与isa206按照体积比为1:1混合，乳化，得到所述口蹄疫疫苗。本发明相对于现有技术，具有以下优点：1、本发明口蹄疫免疫增强剂，与口蹄疫灭活疫苗混合后使用可以有效的提高疫苗的效力，不但可以提高平均抗体水平、抗体的合格率，延长持续期至6个月以上，而且保存一年后，仍然能够显著提高口蹄疫疫苗免疫后的抗体效价。2、本发明口蹄疫免疫增强剂的制备方法方便，免疫增强剂现用现配或者配置后4度保存一年都可以，且添加体积小，只要1％，可显著提高免疫效力，延长抗体持续期至6个月以。3、本发明免疫增强剂配合口蹄疫疫苗对仔猪只需要免疫一次，就可以保护到出栏，抗体持续期延长至6个月以上，显著降低养猪成本，减少猪群应激。附图说明图1显示了各免疫增强剂的免疫效果。横坐标为灭活口蹄疫疫苗编号，纵坐标为液相阻断elisa抗体滴度的平均值。图2免疫增强剂的保存期效力试验(添加保存不同时间后免疫增强剂的口蹄疫疫苗免疫效力评价)，其中横坐标为各疫苗编号，纵坐标为液相阻断elisa抗体滴度的平均值。图3显示了伴侣疫苗+三价疫苗免疫后抗体持续期，其中横坐标为免疫后时间，单位为天，(a)、(b)、(c)中纵坐标分别为a型、o型和亚i型液相阻断elisa抗体滴度的平均值。图4显示了伴侣疫苗+o型疫苗免疫后抗体持续期，横坐标为免疫后时间，纵坐标为o型液相阻断elisa抗体滴度的平均值。图5显示了伴侣疫苗+多肽疫苗免疫后抗体持续期，横坐标为免疫的疫苗分组，左侧纵坐标为o型液相阻断elisa抗体检测的od值，右侧纵坐标为o型液相阻断elisa抗体滴度的平均值。具体实施方式下面结合附图对本发明作更进一步的说明。实施例1：制备免疫增强剂及灭活口蹄疫疫苗的方法1、实验材料胞壁酰二肽(缩写为mdp)和透明质酸(500～800kda)均购自invivogen公司。磷酸三苯酯(tpp)购自国药集团。黄芪多糖购自陕西正大生物科技有限公司。isa206购自赛百克公司。灭活的猪o型口蹄疫病毒液(毒株为猪o型口蹄疫病毒缅甸98株)，经二乙烯亚胺灭活，146s含量为5.87μg/ml。商品化的口蹄疫o、a、亚i三价疫苗购自金宇宝灵生物药品有限公司。6-7周龄健康易感仔猪的口蹄疫液相阻断elisa抗体滴度≤1:8。本发明采用口蹄疫液相阻断elisa试剂盒(兰州兽医研究所)检测液相阻断elisa抗体滴度。2.免疫增强剂的配置免疫增强剂含有200μg/mlmdp、50mg/ml磷酸三苯酯(tpp)、5μg/ml透明质酸和5mg/ml黄芪多糖，溶剂是0.1m、ph8.0的tris-hcl缓冲液。免疫增强剂的制备方法如下：将溶质按照先后顺序依次溶解于溶剂中，最后采用溶剂定容，过滤(0.22μm滤器)除菌后分装至青霉素瓶中，4℃保存。为了考察免疫增强剂中溶质的溶解顺序对其稳定性和免疫效果的影响，设计了24种溶解顺序，具体如表1所示。其中方法13的步骤如下：第一步将透明质酸溶解于0.1m、ph8.0的tris-hcl缓冲液中；第二步，加入黄芪多糖，搅拌至溶解；第三步，加入磷酸三苯酯(tpp)，搅拌至溶解；第四步，加入胞壁酰二肽，搅拌至溶解；采用0.1m、ph8.0的tris-hcl缓冲液定容。其中方法21的步骤如下：第一步将黄芪多糖溶解于0.1m、ph8.0的tris-hcl缓冲液中；第二步，加入磷酸三苯酯(tpp)，搅拌至溶解；第三步，加入透明质酸，搅拌至溶解；第四步，加入胞壁酰二肽，搅拌至溶解；采用0.1m、ph8.0的tris-hcl缓冲液定容。表124种制备方法中的溶质溶解顺序、对应的免疫增强剂和疫苗编号将表1中方法配制的24种免疫增强剂按照其制备方法的编号，分别编号为免疫增强剂1-24。3、口蹄疫疫苗制备方法制备口蹄疫疫苗的第一种方法：将免疫增强剂作为伴侣疫苗，具体制备方法如下：将免疫增强剂与吐温-80按照体积比为96:4混合，搅拌均匀做为水相；白油与司本-80按照体积比为96:4混合，搅拌均匀作为油相；将水相与油相按照体积比为1:2混合，乳化，得到伴侣疫苗。将伴侣疫苗与商品化疫苗(口蹄疫o、a、亚i三价疫苗)按照体积比为1：25～100混合，搅拌均匀后直接接种。制备口蹄疫疫苗的第二种方法：将免疫增强剂与灭活的猪o型口蹄疫病毒液按照体积比为1:100充分混合，制备为水相溶液。将isa206和水相溶液分别放置于室温约30分钟，然后将isa206加入乳化罐中，在200转/分搅拌转速下将水相溶液加入乳化罐中，在2000转/分条件下搅拌10分钟，得到疫苗。其中水相与isa206的体积比为1:1。采用免疫增强剂分别按照上述两种方法制备的疫苗，在免疫增强剂中溶质浓度相同的条件下，免疫效果上基本一致，只是方便生产上不同需求的用户使用。本实施例将标题2中免疫增强剂1-24采用第二种方法制备灭活口蹄疫疫苗，疫苗编号见表1。对照疫苗1(不含增强剂)：按照制备口蹄疫疫苗的第二种方法制备对照疫苗1，不同之处仅在于采用0.1m、ph8.0的tris-hcl缓冲液替代免疫增强剂。4、分组、免疫及抗体检测实验分组及免疫：将健康易感仔猪随机分成25组，每组10头。其中24组仔猪每组采用表1中的一种疫苗免疫，免疫剂量为2ml/头；另外一组仔猪作为对照组，免疫对照疫苗1，免疫剂量为2ml/头。疫苗免疫后观察，免疫后24h内，观察仔猪无明显的发热和应激表现，未出现腹泻、皮疹、水肿、紫癜、兴奋易怒、食欲丧失、呕吐等全身症状；14天内观察试验猪注射部位无红肿、硬结、瘙痒、淋巴肿大等症状的局部反应，证明该免疫增强剂对仔猪安全。对免疫后的效力进行监测，具体方法如下：免疫后28天，对各组仔猪采血分离血清，采用口蹄疫液相阻断elisa试剂盒(兰州兽医研究所)检测各疫苗免疫后的抗体产生情况(当液相阻断elisa抗体滴度大于等于26为抗体合格)，计算各疫苗免疫后仔猪的液相阻断elisa抗体滴度的平均值。5、免疫后各组仔猪的抗体情况如图1所示，相对于对照疫苗1而言，大部分疫苗免疫后抗体水平显著提高，一般在2-4倍。其中疫苗13和21免疫后的效力最好，平均抗体滴度相对于对照疫苗1而言可以提高6倍以上，相对于含其它免疫增强剂的疫苗而言提高了近3倍。综上所述，采用将黄芪多糖、tpp、透明质酸和胞壁酰二肽依次溶解的方法制备而成的免疫增强剂21可以显著提高口蹄疫疫苗的免疫效力，对口蹄疫灭活疫苗具有良好的免疫增强作用。实施例2免疫增强剂的保存期试验1、免疫增强剂的制备免疫增强剂21的制备方法同实施例1。免疫增强剂13的制备方法同实施例1。免疫增强剂25：免疫增强剂25含有100μg/mlmdp、30mg/ml磷酸三苯酯(tpp)、2μg/ml透明质酸和2mg/ml黄芪多糖，溶剂是0.1m、ph8.0的tris-hc缓冲液。免疫增强剂25的制备方法如下：第一步将黄芪多糖溶解于0.1m、ph8.0的tris-hcl缓冲液中；第二步，加入磷酸三苯酯(tpp)，搅拌至溶解；第三步，加入透明质酸，搅拌至溶解；第四步，加入胞壁酰二肽，搅拌至溶解；采用0.1m、ph8.0的tris-hcl缓冲液定容。复方免疫增强剂1：是含有2mg/ml的mpl、20mg/ml的mdp和0.4mg/mlβ-葡聚糖的溶液，溶剂为0.1m、ph8.0的tris-hcl缓冲液溶。配制方法如下：称量各物质后加入同一容器中，然后加入溶剂溶解，定容。复方免疫增强剂2：是含有500μg/mlmpl、500μg/mlmdp、500μg/mlβ-葡聚糖和5mg/ml黄芪多糖的溶液，溶剂为0.1m、ph8.0的tris-hcl缓冲液溶。配制方法如下：称量各物质后加入同一容器中，然后加入溶剂溶解，定容即可。2、疫苗制备及免疫效力评价将免疫增强剂21、免疫增强剂13及免疫增强剂25、复方免疫增强剂1和复方免疫增强剂2，在4℃条件下保存半年、一年后分别配制成疫苗进行猪只免疫，以动物试验评价免疫增强剂的免疫效力。(1)免疫增强剂21相关疫苗制备将新鲜配制的免疫增强剂21、4℃保存半年后的免疫增强剂21和4℃保存一年后的免疫增强剂21分别采用如下方法配制成疫苗：将免疫增强剂与灭活的猪o型口蹄疫病毒液按照体积比为1:100充分混合，制备为水相溶液。将isa206和水相溶液分别放置于室温约30分钟，然后将isa206加入乳化罐中，在200转/分搅拌转速下将水相溶液加入乳化罐中，在2000转/分条件下搅拌10分钟，得到疫苗。其中水相与isa206的体积比为1:1。新鲜配制的免疫增强剂21、4℃保存半年后的免疫增强剂21和4℃保存一年后的免疫增强剂21配制成的疫苗依次记为21-fmd、21-fmd-半年、21-fmd-一年。(2)免疫增强剂13相关疫苗将新鲜配制的免疫增强剂13、4℃保存半年后的免疫增强剂13和4℃保存一年后的免疫增强剂13分别采用如下方法配制成疫苗：将免疫增强剂与灭活的猪o型口蹄疫病毒液按照体积比为1:100充分混合，制备为水相溶液。将isa206和水相溶液分别放置于室温约30分钟，然后将isa206加入乳化罐中，在200转/分搅拌转速下将水相溶液加入乳化罐中，在2000转/分条件下搅拌10分钟，得到疫苗。其中水相与isa206的体积比为1:1。新鲜配制的免疫增强剂13、4℃保存半年后的免疫增强剂13和4℃保存一年后的免疫增强剂13配制成的疫苗依次记为13-fmd、13-fmd-半年、13-fmd-一年。(3)免疫增强剂25相关疫苗将新鲜配制的免疫增强剂25、4℃保存半年后的免疫增强剂25和4℃保存一年后的免疫增强剂25分别采用如下方法配制成疫苗：将免疫增强剂与灭活的猪o型口蹄疫病毒液按照体积比为1:100充分混合，制备为水相溶液。将isa206和水相溶液分别放置于室温约30分钟，然后将isa206加入乳化罐中，在200转/分搅拌转速下将水相溶液加入乳化罐中，在2000转/分条件下搅拌10分钟，得到疫苗。其中水相与isa206的体积比为1:1。新鲜配制的免疫增强剂25、4℃保存半年后的免疫增强剂25和4℃保存一年后的免疫增强剂25配制成的疫苗依次记为25-fmd、25-fmd-半年、25-fmd-一年。(4)复方免疫增强剂1、2相关疫苗将新鲜配制的复方免疫增强剂1、4℃保存半年后的复方免疫增强剂1、4℃保存一年后的复方免疫增强剂1分别采用如下方法配制成疫苗：将复方免疫增强剂与灭活的猪o型口蹄疫病毒液按照体积比为1:9混合后，得到水相溶液。将isa206和水相溶液分别放置于室温约30分钟，然后将isa206加入乳化罐中，在200转/分搅拌转速下将水相溶液加入乳化罐中，在2000转/分条件下搅拌10分钟，得到的疫苗。其中水相与isa206的体积比为1:1。由新鲜配制的复方免疫增强剂1制成的疫苗记为复方1-fmd；由4℃保存半年后的复方免疫增强剂1制成的疫苗记为复方1-fmd-半年；由4℃保存一年后的复方免疫增强剂1制成的疫苗分别记为复方1-fmd-一年。将新鲜配制的复方免疫增强剂2、4℃保存半年后的复方免疫增强剂2、4℃保存一年后的复方免疫增强剂2分别采用如下方法配制成疫苗：将复方免疫增强剂与灭活的猪o型口蹄疫病毒液按照体积比为1:100混合后，得到水相溶液。将isa206和水相溶液分别放置于室温约30分钟，然后将isa206加入乳化罐中，在200转/分搅拌转速下将水相溶液加入乳化罐中，在2000转/分条件下搅拌10分钟，得到的疫苗。其中水相与isa206的体积比为1:1。由新鲜配制的复方免疫增强剂2制成的疫苗记为复方2-fmd；由4℃保存半年后的复方免疫增强剂2制成的疫苗记为复方2-fmd-半年；由4℃保存一年后的复方免疫增强剂2制成的疫苗记为复方2-fmd-一年。(5)fmd对照疫苗按照21-fmd的制备方法制备fmd对照疫苗，不同之处仅在于以0.1m、ph8.0的tris-hcl缓冲液替代新鲜配制的免疫增强剂21。3、分组、免疫和抗体检测实验分组及免疫：将健康易感仔猪随机分组，每组10头，共16组。将本实施例标题2中制备的16种疫苗各免疫一组健康易感仔猪，免疫剂量为2ml/头。疫苗免疫后观察，免疫后24h内，观察仔猪无明显的发热和应激表现，未出现腹泻、皮疹、水肿、紫癜、兴奋易怒、食欲丧失、呕吐等全身症状；14天内观察试验猪注射部位无红肿、硬结、瘙痒、淋巴肿大等症状的局部反应。因此，上述疫苗对仔猪来说是安全的。免疫后第28天，各组健康易感仔猪采血分离血清，采用口蹄疫液相阻断elisa试剂盒(兰州兽医研究所)检测疫苗免疫后的抗体产生情况(当液相阻断elisa抗体滴度大于等于26为抗体合格)，计算平均抗体水平。免疫后的平均抗体水平如图2所示。由图2可知，由新鲜配制的免疫增强剂21、13、25制成的疫苗免疫后的平均抗体水平与新鲜配制的复方免疫增强剂1、2制成的疫苗免疫效果相当，均有明显的免疫增强作用；保存半年后，复方免疫增强剂1、2和免疫增强剂13制成的疫苗免疫效果明显下降，免疫增强剂21、25制成的疫苗免疫后平均抗体水平基本不变，是复方免疫增强剂1、2和免疫增强剂13对应疫苗免疫后平均抗体水平的4倍以上；保存一年后，复方免疫增强剂1、2制成的疫苗免疫效果基本与fmd对照疫苗无明显差异，免疫增强剂21、25制成的疫苗免疫后的平均抗体水平略有下降，但是平均抗体水平仍然是复方免疫增强剂1、2对应疫苗平均抗体水平的4倍以上。由此可见，免疫增强剂21和25在4℃保存一年后，仍然能够保持较高的免疫效力。实施例3：保存一年后的免疫增强剂21作为伴侣疫苗对口蹄疫商品化疫苗的免疫效力评价1、免疫用疫苗制备：取4℃条件下保存一年后的免疫增强剂21作为研究对象进行伴侣疫苗的制备。将4℃条件下保存一年后的免疫增强剂21与吐温-80按照体积比为96:4，混合均匀，作为水相；将白油与司本-80按照体积比96:4混合均匀，作为油相；将水相和油相按照体积比为1:2混合，乳化，得到伴侣疫苗。将0.1m、ph8.0的tris-hcl缓冲液与吐温-80按照体积比为96:4，混合均匀，作为水相；将白油与司本-80按照体积比96:4混合均匀，作为油相；将水相和油相按照体积比为1:2混合，乳化，得到对照伴侣疫苗。将伴侣疫苗、对照伴侣疫苗分别与各商品化疫苗按照体积比1：50混合均匀，得到免疫用疫苗，以考察保存一年后的免疫增强剂21对商品化疫苗的免疫增强作用。其中商品化疫苗包括：(1)口蹄疫o、a、亚i三价灭活疫苗(缩写为三价疫苗)，生产日期20170409，购买自内蒙古金宇宝灵生物药品有限公司；(2)o型口蹄疫灭活疫苗(缩写为o型疫苗)，生产日期20170316，购买自中农威特生物科技股份有限公司；(3)猪口蹄疫o型合成肽疫苗(缩写为多肽疫苗)，多肽疫苗批号：(2017)090297522，生产日期20170421，购买自上海申联。2、分组、免疫和抗体检测实验分组及免疫：将健康易感仔猪随机分组，每组10头，共6组。将伴侣疫苗、对照伴侣疫苗与各商品化疫苗制备而成的免疫用疫苗分别免疫一组健康易感仔猪，添加伴侣疫苗的三价苗命名为伴侣疫苗+三价疫苗，而添加对照伴侣疫苗的三价疫苗命名为对照三价疫苗；其他免疫用疫苗的命名按此方法类推。免疫剂量为2ml/头，具体见表2。表2疫苗免疫及分组分组免疫疫苗种类免疫头数1伴侣疫苗+三价疫苗102对照三价疫苗103伴侣疫苗+o型疫苗104对照o型疫苗105伴侣疫苗+多肽疫苗106对照多肽疫苗10对各组仔猪免疫后的抗体产生情况进行监测：免疫后第28、60、90、120、150、180天分别对各组仔猪采血分离血清，采用o型口蹄疫液相阻断elisa试剂盒(兰州兽医研究所)及多肽疫苗的vp1抗体检测试剂盒(购自上海申联)检测疫苗免疫后的抗体水平并对持续期进行监测。o型液相阻断elisa抗体滴度大于等于26为抗体合格，a和亚i型液相阻断elisa抗体滴度大于等于27为抗体合格。三价苗免疫后的抗体持续期如图3。由图可见，三价苗中添加免疫增强剂21后可以显著提高o型、a型和亚i型液相阻断elisa抗体滴度，且抗体持续期不少于6个月。o型口蹄疫灭活疫苗免疫后的抗体持续期如图4。由图可见，o型口蹄疫灭活疫苗中添加免疫增强剂21后可以显著提高免疫后o型液相阻断elisa抗体滴度，且抗体持续期不少于6个月。多肽疫苗免疫后28天的抗体水平如图5。由图5可见，添加免疫增强剂21后可以显著提高多肽疫苗免疫后的抗体水平，且可以提高o型液相阻断elisa抗体滴度的合格率和平均抗体滴度。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12