本发明属于疫苗生产工艺技术领域，具体涉及到一种乙型脑炎灭活疫苗冻干制剂及其制备方法。
背景技术：
目前市场在售的乙型脑炎灭活疫苗以冻干制品为主，水针制品为辅。冻干后的蛋白质药物呈疏松饼状，水分含量低，有利于药品的理化性质稳定，延长蛋白质药品的储存期限。乙型脑炎灭活疫苗冻干制品对照配方使用右旋糖酐和人血白蛋白。人血白蛋白是非常好的蛋白类冻干保护剂，不仅可以保护抗原蛋白的活性，还可以起到骨架支撑的作用。目前使用的右旋糖酐有复溶时间略长的问题，另外不同的冻干保护剂作用效果也有所区别，因此通过对冻干保护剂中糖的种类和浓度的调整，解决复溶时间略长、并进一步提高冻干制品的稳定性，进而延长疫苗的有效期，就成为现有技术中亟待解决的技术难题。
目前已公开的乙型脑炎疫苗冻干配方主要分为两大类：一类是不含动物源的配方，另一类是含动物源的配方。不含动物源的配方大多处于技术开发阶段，并未实际应用于市售产品。因为此类配方多由复合糖类，多羟基化合物，氨基酸及聚合物等复杂成分组成。成分多，品种杂，不良反应尚不明确，且冻型不佳。含动物源的配方是目前市售产品的主力配方，但是，已公开含人血白蛋白的配方中亦含有明胶保护剂，但是国内市场使用明胶多用动物来源的明胶或明胶水解片段，并且日本有大量研究表明，绝大多数过敏反应的发生均与动物源性明胶相关，发生过敏反应的儿童血清中80%以上均检测出抗-明胶ige。因此，去除动物源性明胶是疫苗配方改良的发展趋势。另外，在冻干过程中可以利用退火技术，使冻干制品的玻璃化温度升高，从而加速干燥且不造成产品坍塌。目前已公开的乙型脑炎疫苗冻干配方中所使用的糖类，属右旋糖酐的冻型为最佳，骨架支撑能力最强，因此冻干方法也是最简单的。更换糖的种类，在提高产品稳定性的同时，也会带来冻型不佳的新问题。用已公开的冻干工艺解决不了冻干制品塌陷的问题。因此需要在原有冻干工艺的基础上引入退火技术，通过该项技术解决产品塌陷的问题。
技术实现要素：
鉴于现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种乙型脑炎灭活疫苗冻干制剂及制备方法，本发明中的乙型脑炎灭活疫苗冻干制品中的冻干保护剂可以缩短疫苗复溶时间长的问题，进一步提高乙型脑炎灭活疫苗的热稳定性，从而延长乙型脑炎灭活疫苗的有效期。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种乙型脑炎灭活疫苗冻干制剂，由乙型脑炎灭活疫苗和冻干保护剂组成，其中冻干保护剂包括人血白蛋白，海藻糖、乳糖、麦芽糖中的任意一种，表面活性剂，所述的表面活性剂为吐温20或吐温80。
所述的一种乙型脑炎灭活疫苗冻干制剂，由以下成分组成：蛋白质含量为12-18µg/ml并且抗原含量不低于1：8乙型脑炎灭活疫苗原液、海藻糖2-6g/100ml、2-6g/100ml人血白蛋白。
所述的一种乙型脑炎灭活疫苗冻干制剂，其特征在于，由以下成分组成：蛋白质含量为12-18µg/ml并且抗原含量不低于1：8乙型脑炎灭活疫苗原液、2-6g/100ml乳糖、2-6g/100ml人血白蛋白。
所述的一种乙型脑炎灭活疫苗冻干制剂，其特征在于，由以下成分组成：蛋白质含量为12-18µg/ml并且抗原含量不低于1：8乙型脑炎灭活疫苗原液、2-6g/100ml麦芽糖、2-6g/100ml人血白蛋白。
所述的一种乙型脑炎灭活疫苗冻干制剂，其特征在于，由以下成分组成：蛋白质含量为12-18µg/ml并且抗原含量不低于1：8乙型脑炎灭活疫苗原液、2-6g/100ml乳糖、2-6g/100ml人血白蛋白、0.01g-0.05g/100ml吐温20。
所述的一种乙型脑炎灭活疫苗冻干制剂，其特征在于，由以下成分组成：蛋白质含量为12-18µg/ml并且抗原含量不低于1：8乙型脑炎灭活疫苗原液、2-6g/100ml乳糖、2-6g/100ml人血白蛋白、0.01g/100ml-0.05g/100ml吐温80。
一种乙型脑炎灭活疫苗冻干制剂的制备方法，包括以下步骤。
1）细胞制备：30l生物反应罐，按照20g/l接种微载体，取上罐的混合细胞液500ml。调整参数，设定ph为7.4，温度为37℃，灌流培养5-7天。
2）病毒接种：当反应罐内细胞密度达到1.0×107/ml时，将反应罐温度降至33℃，并停止灌流。取工作种子按0.002moi接种病毒，并吸附2-3小时后进行灌流。
3）病毒收获：病毒接种后48小时开始收获病毒液，连续收获12天。
4）经0.65µm滤膜澄清，并用截留分子量为300kd滤膜超滤浓缩20-30倍，浓缩液的蛋白质含量应为10-15mg/ml。
5）病毒灭活：浓缩后病毒液加入β-丙内酯，置于4℃搅拌灭活24小时，然后于37℃水解2小时。
6）纯化：灭活后病毒液采用柱色谱的方法纯化，色谱介质为sepharose6ff，洗脱平衡液为ph7.6的pbs缓冲液，收集纯化液的检测紫外光波长为280nm，收集范围从50mv开始收集，吸光值回到50mv时结束收集。
7）冻干稀释液的制备：将海藻糖、乳糖、麦芽糖、人血白蛋白、表面活性剂溶解于pbs溶液后，用0.22µm的微孔滤膜除菌过滤。
8）半成品配制：乙型脑炎灭活疫苗与冻干稀释液按1：2-1：5的体积比混合，乙型脑炎灭活疫苗原液蛋白质含量为12-18µg/ml，抗原含量不低于1：8。
9）成品冻干制备：将半成品分装到西林瓶中后，用christ冻干机冻干，冻干方法为：将半成品快速降温至-45℃，在此温度下维持4~6小时后，在-15℃退火，退火时间为10-30min，退火后，再将温度降低至-45℃，在此温度下维持4~6小时后，抽真空至0.1mbar，然后升温至-30℃，8~10小时之后升温至-20℃，4~6小时之后升温至27℃维持6~8小时后即得。
与现有技术比，本发明的有益效果：将目前使用的右旋糖酐替换成麦芽糖，可以有效提高乙型脑炎灭活疫苗的热稳定性并延长该疫苗的有效期，使产品在有效期内更加稳定。同时可以加快冻干乙型脑炎灭活疫苗的复溶速度，便于医生操作和接种者使用。冻干配方变化后，在原有冻干工艺基础上，引入退火技术，可以解决制品塌陷的问题，从而制备出冻型合格的产品。
具体实施方式
下面结合实施例详细描述本发明，以下所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
实施例1乙型脑炎灭活疫苗冻干制剂制备工艺参数的筛选实验。
一、冻干保护剂中糖类的筛选实验。
（1）配制方法：称取各成分：人血白蛋白30g，任选地海藻糖、乳糖、麦芽糖45g，加入pbs缓冲液至500ml。以上制成的液体用孔径0.22µm的滤器除菌过滤即得本发明的冻干保护剂。
（2）乙型脑炎灭活疫苗毒株经过37℃，微载体悬浮培养20天后进行病毒液收获，而后将收获液进行浓缩、灭活工序，最后通过分子筛进行纯化。将得到的纯化液和已配制完成的冻干保护剂按1：3混合，充分混匀，按既定容量分装后立即进行冷冻干燥。
（3）将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，预冻-45℃，在此温度下维持4~6小时后，抽真空至0.1mbar，然后升温至-30℃，8~10小时之后升温至-20℃，4~6小时之后升温至27℃维持6~8小时后即得。
（4）结果见表1，从一周、两周及三周热稳的结果分析，麦芽糖的保护效果最优。
二、冻干过程中退火时间的筛选实验。
（1）称取各成分：人血白蛋白30g，麦芽糖45g，加入pbs缓冲液至500ml。以上制成的液体用孔径0.22µm的滤器除菌过滤即得本发明的冻干保护剂。
（2）乙型脑炎灭活疫苗毒株经过37℃，微载体悬浮培养20天后进行病毒液收获，而后将收获液进行浓缩、灭活工序，最后通过分子筛进行纯化。将得到的纯化液和已配制完成的冻干保护剂按1：2-1：5混合，充分混匀，按既定容量分装后立即进行冷冻干燥。
（3）将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，预冻-45℃，在此温度下维持4~6小时后，在-15℃退火，退火时间为10-30min。退火后，再将温度降低至-45℃，在此温度下维持4~6小时后，抽真空至0.1mbar，然后升温至-30℃，8~10小时之后升温至-20℃，4~6小时之后升温至27℃维持6~8小时后即得。
（4）结果见表2，10min的退火时间不足导致冻干制品冻型不佳，20min和30min的退火时间均能满足冻型需求，但是考虑到提高效率并避免能源浪费，所以选择退火时间为20min。
三、麦芽糖浓度的筛选实验。
（1）配制方法：称取各成分：人血白蛋白30g，任选地麦芽糖30g、麦芽糖60g，加入pbs缓冲液至500ml。以上制成的液体用孔径0.22µm的滤器除菌过滤即得本发明的冻干保护剂。
（2）乙型脑炎灭活疫苗毒株经过37℃，微载体悬浮培养20天后进行病毒液收获，而后将收获液进行浓缩、灭活工序，最后通过分子筛进行纯化。将得到的纯化液和已配制完成的冻干保护剂按1：2-1：5混合，充分混匀，按既定容量分装后立即进行冷冻干燥。
（3）将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，预冻-45℃，在此温度下维持4~6小时后，在-15℃退火，退火时间为20min。退火后，再将温度降低至-45℃，在此温度下维持4~6小时后，抽真空至0.1mbar，然后升温至-30℃，8~10小时之后升温至-20℃，4~6小时之后升温至27℃维持6~8小时后即得。
（4）结果：将上述乙型脑炎灭活疫苗冻干剂，置于2-8℃和37℃条件下保存，定期抽样检测，测定效价及外观性状观察，结果见表3-表8。
批号：lj01。
效价下降率（%）=（2-8℃t值-37℃对应存放时间的t值）/2-8℃t值×100%。
批号：lj02。
效价下降率（%）=（2-8℃t值-37℃对应存放时间的t值）/2-8℃t值×100%。
批号：lj03。
效价下降率（%）=（2-8℃t值-37℃对应存放时间的t值）/2-8℃t值×100%。
从表4、表6和表8中效价下降率可以看出，本发明用麦芽糖替代了原有对照配方中的右旋糖酐，不但可以提高复溶的速度，也可以更长效地保护乙型脑炎灭活疫苗。从37℃两周、三周热稳研究可以看出麦芽糖对乙型脑炎灭活疫苗的保护优势，尤其是2%麦芽糖的浓度更可以显著延缓乙型脑炎灭活疫苗冻干剂的效价下降速率。如37℃三周热稳数据中，采用2%麦芽糖的冻干配方，其效价下降的速率仅为对照配方的50%。所以，从加速热稳数据可以看出，麦芽糖的替换可以对乙型脑炎灭过疫苗提供更有效、更长效的保护，且效果明显。并且本发明的右旋糖苷替换成麦芽糖后，也能有效提高乙型脑炎灭活疫苗冻干制品的复溶速度。
实施例2乙型脑炎灭活疫苗优化后冻干制剂配方及制备工艺参数。
一、优化后的冻干保护剂配方：其特征为麦芽糖2-4g/100ml，人血白蛋白2g/100ml。
二、优化后的冻干工艺：预冻-45℃，在此温度下维持4~6小时后，在-15℃退火，退火时间为20min。退火后，再将温度降低至-45℃，抽真空至0.1mbar，然后升温至-30℃，8~10小时之后升温至-20℃，4~6小时之后升温至27℃维持6~8小时后即得。
三、制备方法。
（1）配制方法：称取各成分：人血白蛋白30g，麦芽糖30g，加入pbs缓冲液至500ml。以上制成的液体用孔径0.22µm的滤器除菌过滤即得本发明的冻干保护剂。
（2）乙型脑炎灭活疫苗毒株经过37℃，微载体悬浮培养20天后进行病毒液收获，而后将收获液进行浓缩、灭活工序，最后通过分子筛进行纯化。将得到的纯化液和已配制完成的冻干保护剂按1：3混合，充分混匀，按既定容量分装后立即进行冷冻干燥。
（3）将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，预冻-45℃，在此温度下维持4~6小时后，在-15℃退火，退火时间为20min。退火后，再将温度降低至-45℃，抽真空至0.1mbar，然后升温至-30℃，8~10小时之后升温至-20℃，4~6小时之后升温至27℃维持6~8小时后即得。
实施例3乙型脑炎灭活疫苗优化后冻干制剂与原工艺冻干制剂的比较。
在实施例2中制备的冻干制剂与原工艺制备的冻干制剂在复溶时间，热稳定性方面的对比数据见表9。
从表9中结果可以得出。
（1）引入退火工艺后，可以解决冻干制品塌陷的问题，冻型理想。
（2）将原有右旋糖酐替换为麦芽糖后，乙型脑炎灭活疫苗复溶时间缩短一半，由20-30秒缩短为8-10秒。药物溶解快而充分，方便使用。
（3）将原有右旋糖酐替换为麦芽糖后，对乙型脑炎灭活疫苗的保护力得到显著提高，尤其是在长时间保护中的优势更加明显。从一周效价下降率中虽未看到明显优势，但是从两周效价下降率中可以看到，优化后的配方已经把原有配方的效价下降率降低了34.6%。并且从三周效价下降率中可以看到，优化后的配方已经把原有配方的效价下降率降低了50.6%。说明优化后的配方，其保护优势不仅存在，更有愈发显著的趋势。存放时间越长，保护效果提高的越显著。因此可以推测，优化后的配方可以延长乙型脑炎灭活疫苗的有效期。