一种脱细胞软骨基质及其制备方法与流程

本发明涉及关节软骨技术领域，具体涉及一种脱细胞软骨基质及其制备方法。

背景技术：

关节软骨是人体关节的重要结构，关节软骨的主要功能是保护骨骼关节面免受磨损。因关节软骨上无血管、淋巴和软骨分布，且软骨细胞高度分化，使得关节软骨自身修复能力极为有限，关节软骨一旦遭到破坏，产生的病理改变往往不可逆转，再生非常困难，而软骨损伤严重影响人的正常行走和日常活动，长期软骨损伤也是导致肢体残障的主要原因之一。

脱细胞技术是脱除免疫原性的组织细胞保留细胞外基质的方法，软骨的细胞外基质中不仅含有生物活性分子、胶原、非胶原糖蛋白、弹性蛋白、糖胺多糖等多种功能性成分，能够促进软骨组织修复，控制细胞的迁移、增殖、分化和代谢，而且由于软骨的细胞外基质为三维网状结构，有利于细胞的黏附、增殖，为细胞生长提供良好的生长环境，脱细胞技术已成为软骨组织修复中非常重要的研究方向和研究内容。

目前国内外常用到的脱细胞方法主要有机械法、酶消化法、化学去垢剂法等，然而在单独使用或者联合使用这些方法脱细胞的过程中容易出现细胞抗原性去除不彻底，细胞外基质的三维结构遭到破坏的问题，使得细胞营养供应以及代谢废物排出困难，影响软骨修复效果，甚至导致软骨修复失败。现有技术中，为了彻底地脱除软骨细胞，主要采用先将软骨粉粹或者研磨成微粒的方法，这就造成在后续处理中需要多次离心以及多次清洗，不仅加重了对细胞外基质的三维结构的破坏，导致脱细胞软骨基质材料力学性能变差、机械强度降低。

例如，中国专利文献cn108066823a公开了一种细胞脱细胞软骨基质的及其制备方法，具体包括如下步骤：(1)在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50-300rpm/min的速度震荡24-72h。(2)与离子表面活性剂在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡3-6h得到第二软骨。(3)与胰酶以及核酸酶在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡0.5-2h。(4)先在紫外线下照射1-3h后，再浸入交联剂中反应2-6h。上述脱细胞软骨基质的制备方法中，虽然通过物理和化学交联能够在很大程度上提高脱细胞软骨基质的力学强度，使其更加稳定，然而，因外加交联剂本身具有毒性及其残留的问题，植入体内一段时间后易出现免疫反应。

技术实现要素：

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的脱细胞软骨基质机械性能差，免疫原性和毒性高的缺陷，从而提供一种脱细胞软骨基质及其制备方法。

本发明提供了一种脱细胞软骨基质的制备方法，将软骨组织依次通过低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理，制得软骨基质。

在低渗处理中，将软骨组织加入低渗溶液中孵育，室温下孵育15-30h；

优选地，所述低渗溶液为10mm且ph为7-8的tris-hcl溶液。

在胰蛋白酶处理中，将软骨组织加入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热6-24h；

优选地，所述胰蛋白酶溶液为含0.10-0.50％(m/v)胰蛋白酶的pbs溶液。

在去污剂处理中，将软骨组织加入去污剂溶液中，在温度为15-25℃下振荡处理15-30h；

优选地，所述去污剂溶液为含0.05-0.3％sds的8-10mm的tris-hcl溶液。

在核酸酶处理中，将软骨组织加入缓冲细胞液中，然后加入30-60u/ml的dna酶和0.5-4u/ml的rna酶，在35-40℃下水浴加热6-20h；

优选地，所述缓冲细胞液为含5-30mm氯化镁的tris-hcl溶液，所述tris-hcl溶液的浓度为30-60mm，ph为7-8。

在低渗处理之前还包括对软骨组织进行反复冻融处理；

优选地，在反复冻融处理中，将软骨组织置于-70～-80℃下冷冻2-4h，然后置于15-25℃下解冻1-6h，反复冻融的次数为2-6次。

在核酸酶处理之前还包括中性蛋白酶处理；

优选地，在中性蛋白酶处理中，将软骨组织加入含300-700u/l的中性蛋白酶的生理盐水中，在30-40℃下水浴加热4-12h；

优选地，在中性蛋白酶处理之后还包括α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理，在α-1,3-半乳糖苷酶处理中，将软骨组织加入含10-40μg/ml的α-1,3-半乳糖苷酶的pbs溶液中，在25-37℃下，浸泡1-6小时。

在核酸酶处理之后还包括灭菌处理；

优选地，在灭菌处理中，将软骨组织加入消毒液中浸泡1-6h，所述消毒液为含有0.05-0.4vt％乙酸和0.05-0.4wt％次氯酸钠的pbs溶液，或

含有0.05-0.4vt％乙酸和0.05-0.4vt％84消毒液的pbs溶液。

软骨组织在低渗处理之前还包括前清洗处理；在低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理之后还包括中间清洗处理；在核酸酶处理之后还包括后清洗处理；

优选地，在前清洗处理中，将软骨组织加入生理盐水中浸泡，然后加入超纯水中超声清洗，再用超纯水持续冲洗；

优选地，在中间清洗处理中，将软骨组织加入超纯水中超声清洗，再用超纯水持续冲洗；

优选地，在后清洗处理中，将软骨组织加入无菌pbs中浸泡。

本发明提供了一种所述的制备方法制得的脱细胞软骨基质。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的脱细胞软骨基质的制备方法，清洗后的软骨组织依次经过低渗处理，胰蛋白酶处理和去污剂处理，最后经过核酸酶处理，制得脱细胞软骨基质。其中，通过低渗溶液的渗透作用使水分不断透过细胞膜，使细胞膜膨胀破裂，促进胰蛋白酶处理和去污剂处理中的脱细胞溶液透过细胞膜进入细胞，从而能够提高胰蛋白酶处理和去污剂处理的脱细胞效果，具体地，软骨组织经过胰蛋白酶消化细胞膜表面和细胞内的免疫蛋白，有效降低免疫原性，保留胶原和糖胺多糖，然后经过去污剂去除软骨组织中的细胞成分，破坏细胞膜磷脂和脂膜，彻底清除抗原和免疫复合物，最后通过核酸酶处理可以去除细胞核中的dna和rna；本发明不仅利用在先的低渗溶液处理来增强胰蛋白酶处理和去污剂处理的脱细胞效果，而且通过胰蛋白酶处理和去污剂的联合处理也能够提高脱细胞效果，降低去污剂的用量，有效改善因去污剂残留或者去污剂处理过度而导致的脱细胞软骨基质的细胞毒性或者免疫原性增强，同时也能够改善胰蛋白酶处理过度而造成对胶原蛋白和弹性蛋白的过度消化导致脱细胞软骨基质基质的三维结构紊乱和机械强度降低的情况发生。因而，本发明制备的脱细胞软骨基质能够最大限度地保留软骨细胞基质本身的三维结构，具有良好的机械性能，而且不需要外加交联剂进行物理或者化学交联，免疫原性低、毒性低，而且制备方法简单，成本较低，适宜产业化生产。

2.本发明提供的脱细胞软骨基质的制备方法，将软骨组织置于低渗溶液中孵育，室温下孵育15-30h，使低渗溶液中的水分在温和条件下缓慢进入软骨细胞，避免低渗溶液破坏软骨细胞外基质的结构的完整性，提高机械性能的稳定性，进一步的，采用8-10mm且ph为7-8的tris-hcl溶液为低渗溶液，能够进一步改善低渗溶液处理过程对脱细胞软骨基质结构的完整性的影响，提高脱细胞软骨基质机械性能，降低毒性。

3.本发明提供的脱细胞软骨基质的制备方法，将软骨组织加入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热6-24h，能够进一步提高软骨细胞基质的结构的完整性，提高脱细胞软骨基质机械性能和稳定性。而且本发明采用将软骨组织加入去污剂溶液中，在温度为15-25℃下振荡处理15-30h，以含0.05-0.3％sds的8-10mm的tris-hcl溶液为去污剂，具有加强的去污效果，保证脱细胞完全。

4.本发明提供的脱细胞软骨基质的制备方法，通过先将软骨组织加入缓冲细胞液中，然后加入30-60u/ml的dna酶和0.5-4u/ml的rna酶，高浓度的核酸酶在缓冲溶液中逐渐分散，彻底消化掉软骨组织中的核酸，有效降低脱细胞软骨基质的免疫原性，减少批次之间毒性的差异，提高产品质量的稳定性，且采用水浴加热的方式，使核酸酶在温和条件下进入软骨组织，消化dna和rna，减少对脱细胞软骨基质的破坏，提高脱细胞软骨基质机械性能和稳定性。

5.本发明提供的脱细胞软骨基质的制备方法，在低渗处理之前还包括对软骨组织进行反复冻融处理，反复冻融处理能够使细胞外基质较为疏松，有利于后续水分和脱细胞溶液的进入，提高脱细胞效果，进一步降低免疫原性和毒性，通过将软骨组织置于-70～-80℃下冷冻2-4h，然后置于15-25℃下解冻1-6h，，反复冻融1-6次，能够最大限度地保留细胞外基质三维结构的同时，提高脱细胞效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实验例4中显微镜下的脱细胞软骨基质和未经脱细胞处理的软骨组织的he染色图，其中a为软骨组织(500μm)，b为软骨组织(100μm)，c为脱细胞软骨基质(500μm)，d为为脱细胞软骨基质(100μm)；a与b中有大量蓝染，c与d中无蓝染；

图2是实验例5中显微镜下的脱细胞软骨基质和未经脱细胞处理的软骨组织的dapi染色图，其中a为软骨组织，b为脱细胞软骨基质；a中有较强蓝色荧光，b中无蓝色荧光；

图3是实验例6中显微镜下的脱细胞软骨基质和未经脱细胞处理的软骨组织的ɑ-gal免疫组织化学染色图，其中a为软骨组织，b为脱细胞软骨基质；a中有较强红色荧光，b中无红色荧光；

图4是实验例7中显微镜下的脱细胞软骨基质和未经脱细胞处理的软骨组织的改良masson三色染图，其中a为软骨组织，b为脱细胞软骨基质；a中有较强蓝色和蓝褐色，蓝色为胶原纤维，蓝褐色为细胞核；b中只有较强蓝色；

图5是实验例8中显微镜下的脱细胞软骨基质和未经脱细胞处理的软骨组织的ii型胶原免疫组化染图，其中a为软骨组织，b为脱细胞软骨基质；a中有较强红色荧光和蓝色荧光，b中只有红色荧光。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

以下的新鲜软骨组织均以成年健康猪肋软骨为材料，获取猪肋软骨后，将与软骨相连的肌肉、筋膜等去除干净，最终获得透明状的软骨组织。

实施例1

本实施例中脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：

(1)前清洗处理：取800g新鲜的软骨组织加入生理盐水中，浸泡，然后将软骨组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。

(2)反复冻融处理：将软骨组织先置于-80℃下冷冻3h，然后在室温下解冻4h，反复冻融4次。

(3)低渗处理：将软骨组织加入到已灭菌的10ltris-hcl溶液中，在室温下孵育20h。其中，tris-hcl溶液的ph为8，浓度为10mm。

(4)胰蛋白酶处理：将软骨组织放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热8h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.25％(m/v)胰蛋白酶的pbs溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10l。

(5)去污剂处理：将软骨组织放入含0.1％(m/v)sds的10mm的tris-hcl中，20℃下振荡处理72h，其中，含0.1％(m/v)sds的tris-hcl溶液体积为10l。

(6)中性蛋白酶处理，将软骨组织放入含400u/l的中性蛋白酶的生理盐水中，37℃下水浴加热8h。

(7)α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理，将软骨组织加入含20μg/ml的α-1,3-半乳糖苷酶的pbs溶液中，在35℃下，浸泡2小时。

(8)核酸酶处理：将软骨组织放入含有10mm氯化镁且ph为7.5的50mm的tris-hcl溶液中，加入50u/ml的dna酶和1u/ml的rna酶，在37℃下水浴加热12h。其中，tris-hcl溶液的体积为10l。

(9)灭菌处理：将软骨组织加入含有0.2vt％乙酸和0.2vt％的84消毒液的pbs中，在室温下浸泡3h，进行灭菌处理。

(10)后清洗处理：加入无菌pbs中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。

其中步骤(2)-(9)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将软骨组织清洗，然后置于超声波清洗仪中清洗。

采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞软骨基质。

实施例2

本实施例中脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：

(1)前清洗处理：取1kg新鲜的软骨组织加入生理盐水中，浸泡，然后将软骨组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。

(2)反复冻融处理：将软骨组织先置于-80℃下冷冻2h，然后在室温下解冻6h，反复冻融6次。

(3)低渗处理：将软骨组织加入到已灭菌的tris-hcl溶液中，在室温下孵育15h。其中，tris-hcl溶液的ph为8，体积为10l，浓度为10mm。

(4)胰蛋白酶处理：将软骨组织经超纯水清洗后，放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热6h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.20％(m/v)胰蛋白酶的pbs溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10l。

(5)去污剂处理：将软骨组织经超纯水清洗后，放入含0.3％(m/v)sds的10mm的tris-hcl中，室温下振荡处理15h，其中，含0.3％(m/v)sds的tris-hcl溶液的体积为10l。

(6)中性蛋白酶处理，将软骨组织放入含700u/l的中性蛋白酶的生理盐水中，37℃下水浴加热12h。

(7)核酸酶处理：将软骨组织经超纯水清洗后，放入10l的含有5mm氯化镁且ph为8的30mm的tris-hcl溶液中，加入30u/ml的dna酶和4u/ml的rna酶，在37℃下水浴加热6h。

(8)α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理，将软骨组织加入含20μg/ml的α-1,3-半乳糖苷酶的pbs溶液中，在37℃下，浸泡6小时。

(9)灭菌处理：将软骨组织加入含有0.4vt％乙酸和0.05vt％的84消毒液的pbs中，在室温下浸泡6h，进行灭菌处理。

(10)后清洗处理：然后加入无菌pbs中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。

其中步骤(2)-(9)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将软骨组织清洗，然后置于超声波清洗仪中清洗。

采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞软骨基质。

实施例3

本实施例中脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：

(1)前清洗处理：取500g新鲜的软骨组织加入生理盐水中，浸泡，然后将软骨组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。

(2)反复冻融处理：将软骨组织先置于-70℃下冷冻4h，然后在30℃下解冻1h，反复冻融2次。

(3)低渗处理：将软骨组织加入到已灭菌的8mm的tris-hcl溶液中，在室温下孵育30h。其中，tris-hcl溶液的ph为8，体积为10l。

(4)胰蛋白酶处理：将软骨组织经超纯水清洗后，放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热24h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.30％(m/v)胰蛋白酶的pbs溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10l。

(5)去污剂处理：将软骨组织放入含0.05％(m/v)sds的10mm的tris-hcl中，室温下振荡处理30h，其中，含0.05％(m/v)sds的tris-hcl溶液的体积为10l。

(6)中性蛋白酶处理，将软骨组织放入含300u/l的中性蛋白酶的生理盐水中，37℃下水浴加热4h。

(8)核酸酶处理：将软骨组织经超纯水清洗后，放入含有30mm氯化镁且ph为7.0的60mm的tris-hcl溶液中，加入60u/ml的dna酶和0.5u/ml的rna酶，在25℃下水浴加热20h。其中，tris-hcl溶液的体积为10l。

(9)灭菌处理：将软骨组织加入含有0.05vt％乙酸和0.4vt％的84消毒液的pbs中，在室温下浸泡2h，进行灭菌处理。

(10)后清洗处理：然后加入无菌pbs中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。

其中步骤(2)-(9)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将软骨组织清洗，然后置于超声波清洗仪中清洗。

采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞软骨基质。

实施例4

本实施例中脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：

(1)前清洗处理：取800g新鲜的软骨组织加入生理盐水中，浸泡，然后将软骨组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。

(2)反复冻融处理：将软骨组织先置于-80℃下冷冻3h，然后在室温下解冻4h，反复冻融4次。

(3)低渗处理：将软骨组织加入到已灭菌的10mm的tris-hcl溶液中，在15℃下、转速200rpm/min的条件下振荡20h。其中，tris-hcl溶液的ph为8，体积为10l。

(4)胰蛋白酶处理：将软骨组织放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下、转速200rpm/min的条件下振荡8h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.25％(m/v)胰蛋白酶的pbs溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10l。

(5)去污剂处理：将软骨组织放入含0.1％(m/v)sds的10mm的tris-hcl中，室温下振荡处理72h，其中，含0.1％(m/v)sds的tris-hcl溶液的体积为10l。

(6)中性蛋白酶处理，将软骨组织放入含400u/l的中性蛋白酶的生理盐水中，37℃下水浴加热8h。

(7)α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理，将软骨组织加入含20μg/ml的α-1,3-半乳糖苷酶的pbs溶液中，在35℃下，浸泡2小时。

(8)核酸酶处理：将软骨组织放入含有10mm氯化镁且ph为7.5的50mm的tris-hcl溶液中，加入50u/ml的dna酶和1u/ml的rna酶，在37℃下水浴加热12h。其中，tris-hcl溶液的体积为10l。

(9)灭菌处理：将软骨组织加入含有0.2vt％乙酸和0.2vt％的84消毒液的pbs中，在室温下浸泡3h，进行灭菌处理。

(10)后清洗处理：然后加入无菌pbs中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。

其中步骤(2)-(9)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将软骨组织清洗，然后置于超声波清洗仪中清洗。

采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞软骨基质。

实施例5

本实施例中脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：

(1)前清洗处理：取800g新鲜的软骨组织加入生理盐水中，浸泡，然后将软骨组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。

(2)低渗处理：将软骨组织加入到已灭菌的10mm的tris-hcl溶液中，在室温下孵育20h。其中，tris-hcl溶液的ph为8，体积为10l。

(3)胰蛋白酶处理：将软骨组织放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热8h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.25％(m/v)胰蛋白酶的pbs溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10l。

(4)去污剂处理：将软骨组织放入含0.1％(m/v)sds的10mm的tris-hcl中，室温下振荡处理72h，其中，含0.1％(m/v)sds的tris-hcl溶液的体积为10l。

(5)核酸酶处理：将软骨组织放入含有10mm氯化镁且ph为7.5的50mm的tris-hcl溶液中，加入50u/ml的dna酶和1u/ml的rna酶，在37℃下水浴加热12h。其中，tris-hcl溶液的体积为10l。

(6)灭菌处理：将软骨组织加入含有0.2vt％乙酸和0.2vt％的84消毒液的pbs中，在室温下浸泡3h，进行灭菌处理。

(7)后清洗处理：然后加入无菌pbs中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。

其中步骤(2)-(6)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将软骨组织清洗，然后置于超声波清洗仪中清洗。

采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞软骨基质。

实施例6

本实施例中脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：

(1)前清洗处理：取800g新鲜的软骨组织用超纯水持续冲洗。

(2)反复冻融处理：将软骨组织先置于-80℃下冷冻3h，然后在室温下解冻4h，反复冻融4次。

(3)低渗处理：将软骨组织加入到已灭菌的10mm的tris-hcl溶液中，在室温下孵育20h。其中，tris-hcl溶液的ph为8，体积为10l。

(4)胰蛋白酶处理：将软骨组织放入10l胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热8h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.25％(m/v)胰蛋白酶的pbs溶液。

(5)去污剂处理：将软骨组织放入10l含0.1％(m/v)sds的10mm的tris-hcl中，室温下振荡处理72h。

(6)中性蛋白酶处理，将软骨组织放入含400u/l的中性蛋白酶的生理盐水中，37℃下水浴加热8h。

(7)α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理，将软骨组织加入含20μg/ml的α-1,3-半乳糖苷酶的pbs溶液中，在35℃下，浸泡2小时。

(8)核酸酶处理：将软骨组织放入含有10mm氯化镁且ph为7.5的50mm的tris-hcl溶液中，加入50u/ml的dna酶和1u/ml的rna酶，在37℃下水浴加热12h。其中，tris-hcl溶液的体积为10l。

(9)灭菌处理：将软骨组织加入含有0.2vt％乙酸和0.2vt％的84消毒液的pbs中，在室温下浸泡3h，进行灭菌处理。

(10)后清洗处理：然后加入无菌pbs中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。

其中步骤(2)-(9)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将软骨组织清洗。

采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞软骨基质。

实施例7

本实施例中脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：

(1)前清洗处理：取800g新鲜的软骨组织加入超纯水中，浸泡，然后将软骨组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。

(2)反复冻融处理：将软骨组织先置于-80℃下冷冻3h，然后在室温下解冻4h，反复冻融4次。

(3)低渗处理：将软骨组织加入到已灭菌的10mm的tris-hcl溶液中，在室温下孵育20h。其中，tris-hcl溶液的ph为8，体积为10l。

(4)胰蛋白酶处理：将软骨组织放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热8h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.25％(m/v)胰蛋白酶的pbs溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10l。

(5)去污剂处理：将软骨组织放入含0.1％(m/v)sds的10mm的tris-hcl中，室温下振荡处理72h，其中，含0.1％(m/v)sds的tris-hcl溶液体积为10l。

(6)中性蛋白酶处理，将软骨组织放入含400u/l的中性蛋白酶的生理盐水中，37℃下水浴加热8h。

(7)α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理，将软骨组织加入含20μg/ml的α-1,3-半乳糖苷酶的pbs溶液中，在35℃下，浸泡2小时。

(8)核酸酶处理：将软骨组织放入含有10mm氯化镁且ph为7.5的50mm的tris-hcl溶液中，加入50u/ml的dna酶和1u/ml的rna酶，在37℃下水浴加热12h。其中，tris-hcl溶液的体积为10l。

(9)灭菌处理：将软骨组织加入含有0.2vt％乙酸的pbs中，在室温下浸泡3h，进行灭菌处理。

(10)后清洗处理：然后加入无菌pbs中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。

其中步骤(2)-(9)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将软骨组织清洗，然后置于超声波清洗仪中清洗。

采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞软骨基质。

对比例1

本对比例中脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：

(1)前清洗处理：取800g新鲜的软骨组织加入超纯水中，浸泡，然后将软骨组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。

(2)反复冻融处理：将软骨组织先置于-80℃下冷冻3h，然后在室温下解冻4h，反复冻融4次。

(3)低渗处理：将软骨组织加入到已灭菌的10mm的tris-hcl溶液中，在室温下孵育20h。其中，tris-hcl溶液的ph为8，体积为10l。

(4)去污剂处理：将软骨组织放入含0.1％(m/v)sds的10mm的tris-hcl中，室温下振荡处理72h，其中，含0.1％(m/v)sds的tris-hcl溶液体积为10l。

(5)中性蛋白酶处理，将软骨组织放入含400u/l的中性蛋白酶的生理盐水中，37℃下水浴加热8h。

(6)核酸酶处理：将软骨组织放入含有10mm氯化镁且ph为7.5的50mm的tris-hcl溶液中，加入50u/ml的dna酶和1u/ml的rna酶，在37℃下水浴加热12h。其中，tris-hcl溶液的体积为10l。

(7)灭菌处理：将软骨组织加入含有0.2vt％乙酸和0.2vt％的84消毒液的pbs中，在室温下浸泡3h，进行灭菌处理。

(8)后清洗处理：然后加入无菌pbs中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。

其中步骤(2)-(7)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将软骨组织清洗，然后置于超声波清洗仪中清洗。

采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞软骨基质。

对比例2

本对比例中脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：

(1)前清洗处理：取800g新鲜的软骨组织加入超纯水中，浸泡，然后将软骨组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。

(2)反复冻融处理：将软骨组织先置于-80℃下冷冻3h，然后在室温下解冻4h，反复冻融4次。

(3)低渗处理：将软骨组织加入到已灭菌的10mm的tris-hcl溶液中，在室温下孵育20h。其中，tris-hcl溶液的ph为8，体积为10l。

(4)去污剂处理：将软骨组织放入含0.1％(m/v)sds的10mm的tris-hcl中，室温下振荡处理72h，其中，含0.1％(m/v)sds的tris-hcl溶液体积为10l。

(5)胰蛋白酶处理：将软骨组织放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热8h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.25％(m/v)胰蛋白酶的pbs溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10l。

(6)中性蛋白酶处理，将软骨组织放入含400u/l的中性蛋白酶的生理盐水中，37℃下水浴加热8h。

(7)α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理，将软骨组织加入含20μg/ml的α-1,3-半乳糖苷酶的pbs溶液中，在35℃下，浸泡2小时。

(8)核酸酶处理：将软骨组织放入含有10mm氯化镁且ph为7.5的50mm的tris-hcl溶液中，加入50u/ml的dna酶和1u/ml的rna酶，在37℃下水浴加热12h。其中，tris-hcl溶液的体积为10l。

(9)灭菌处理：将软骨组织加入含有0.2vt％乙酸和0.2vt％的84消毒液的pbs中，在室温下浸泡3h，进行灭菌处理。

(10)后清洗处理：然后加入无菌pbs中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。

其中步骤(2)-(9)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将软骨组织清洗，然后置于超声波清洗仪中清洗。

采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞软骨基质。

对比例3

本对比例中脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：

(1)前清洗处理：取800g新鲜的软骨组织加入超纯水中，浸泡，然后将软骨组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。

(2)反复冻融处理：将软骨组织先置于-80℃下冷冻3h，然后在室温下解冻4h，反复冻融4次。

(3)胰蛋白酶处理：将反复冻融后的软骨组织放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热8h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.25％(m/v)胰蛋白酶的pbs溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10l。

(4)低渗处理：将软骨组织加入到已灭菌的10mm的tris-hcl溶液中，在室温下孵育20h。其中，tris-hcl溶液的ph为8，体积为10l。

(5)去污剂处理：将软骨组织放入含0.1％(m/v)sds的10mm的tris-hcl中，室温下振荡处理72h，其中，含0.1％(m/v)sds的tris-hcl溶液体积为10l。

(6)中性蛋白酶处理，将软骨组织放入含400u/l的中性蛋白酶的生理盐水中，37℃下水浴加热8h。

(7)α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理，将软骨组织加入含20μg/ml的α-1,3-半乳糖苷酶的pbs溶液中，在35℃下，浸泡2小时。

(8)核酸酶处理：将软骨组织放入含有10mm氯化镁且ph为7.5的50mm的tris-hcl溶液中，加入50u/ml的dna酶和1u/ml的rna酶，在37℃下水浴加热12h。其中，tris-hcl溶液的体积为10l。

(9)灭菌处理：将软骨组织加入含有0.2vt％乙酸和0.2vt％的84消毒液的pbs中，在室温下浸泡3h，进行灭菌处理。

(10)后清洗处理：然后加入无菌pbs中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。

其中步骤(2)-(9)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将软骨组织清洗，然后置于超声波清洗仪中清洗。

采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞软骨基质。

实验例1

脱细胞软骨基质的dna残留量能够反映其的脱细胞效果，通过降低dna残留量也能够降低脱细胞软骨基质的免疫原性。

分别取实施例1-6和对比例1-3中制得的脱细胞软骨基质以及未脱细胞的软骨组织25mg，分别作为试验组、对照组和空白对照组，分别切成小块，按照《中国药典》2015版第三部3407外源性dna残留量测定法中的荧光染色法测定不同批次的脱细胞软骨基质中dna残留量，结果见下表所示。

表1实施例1-6和对比例1-3中不同批次的脱细胞软骨基质中dna残留量结果

实验例2

取实施例1-6和对比例1-3中制得的脱细胞软骨基质以及未脱细胞的软骨组织，分别作为试验组、对照组和空白对照组，采用mtt法分别测定其的细胞毒性，采用无血清dmem培养基作为浸提介质，按照gb/t1688.12-2008标准制备得12组脱细胞软骨基质浸提液，按照gb/t14233.2标准，取1周龄新西兰大白兔股骨骨髓，采用密度离心法体外分离培养bmscs细胞培养，然后于96孔板中接种处于对数生长期的细胞，细胞接种浓度为7×10⁴个/ml。设置空白组，剩余每孔加入100μl细胞悬液。在37℃，含5％co2的培养箱中培养过夜后，测试组分别加入100μl的浸提液，对照组加入100μl培养液，每组设8个平行孔。培养48h后，加入20μlmtt(5mg/mlpbs)溶液，放入培养箱中继续培养4h后，小心吸出上层清夜，加入150μl二甲亚砜，震荡10min至孔底紫色结晶完全溶解。用酶联免疫酶标仪测定每个孔吸光度od值，计算各组脱细胞软骨基质处理后的bmscs细胞的相对增殖率。

表2实施例1-6和对比例1-3中不同批次的脱细胞软骨基质细胞毒性结果

实验例3

将实施例1-6和对比例1-3制得的脱细胞软骨基质以及未脱细胞的软骨组织，分别作为试验组、对照组和空白对照组，分别制成板状，采用拉伸强度测定仪测定各组脱细胞软骨基质的拉伸强度，记录下拉断时的最大拉力，最大拉力处于软骨基质的截面积，即为拉伸强度，见表3所示。

表3实施例1-6和对比例1-3中不同批次的脱细胞软骨基质的拉伸强度结果

从表1-3中可知，与对比例1-3相比，实施例1-6中的脱细胞软骨基质的拉伸强度、细胞相对增殖率明显增加，dna残留量、dna残留量的变异系数、细胞相对增殖率的变异系数和拉伸强度的变异系数均有显著降低，其中脱细胞软骨基质的dna残留量为24.86-100.45ng/mg，细胞相对增殖率为59.3-99.5％，细胞毒性等级不大于2级，拉伸强度为2.31-3.84mpa，说明本发明的脱细胞软骨基质细胞脱除效果可靠，免疫原性低、毒性低，软骨细胞基质本身的三维结构保留完整性高；而且本发明的脱细胞软骨基质的dna残留量的批间变异系数不大于5.45％，细胞相对增殖率的批间变异系数不大于5.74％，拉伸强度的批间变异系数不大于8.75％，较对比例1-3均有明显降低，说明本发明的脱细胞软骨基质质量更加稳定可靠，均一性明显提高。而且，与实施例4-6相比，实施例1-3中制得的脱细胞软骨基质的dna残留量、拉伸强度的变异系有显著降低，细胞相对增殖率和拉伸强度有明显提升，表明通过对低渗、胰蛋白酶处理条件，核酸酶浓度以及消毒液的优化，有利于进一步提高制得的脱细胞软骨基质质量的稳定性。

实验例4

将实施例1制得的脱细胞软骨基质以及实施例1中未经脱细胞处理的天然软骨组织分别进行苏木精-伊红染色(he染色)，具体实验方法如下：取实施例1制得的脱细胞软骨基质和未经脱细胞处理的软骨组织，分别为实验组和对照组，各组均采用4％的多聚甲醛固定24h，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包、切片，切片厚度为5μm，得到石蜡切片。然后将石蜡切片于二甲苯中脱蜡各10min，依次入无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇各5min，自来水冲洗1-2min。然后用苏木素染液染3-5min，自来水冲洗1-2min。1％盐酸酒精分化数秒。1％氨水溶液返蓝数秒，然后水洗1-2min。入伊红染液染1-3min。然后无水乙醇脱水两次各1min，二甲苯透明数分钟。中性树胶封片，镜检，结果如图1所示。

结果显示，实施例1制得的脱细胞软骨基质无细胞成分存在，细胞脱除干净，细胞外基质的结构与天然软骨组织一致，说明制得的脱细胞软骨基质的细胞外基质结构保持完整。

实验例5

采用dapi染剂对实施例1制得的脱细胞软骨基质以及实施例1中未经脱细胞处理的软骨组织中的dna进行染色，具体实验方法如下：取实施例1制得的脱细胞软骨基质和未经脱细胞处理的软骨组织，分别为实验组和对照组，各组均采用4％的多聚甲醛固定24h，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包、切片，切片厚度为5μm，得到石蜡切片。将石蜡切片于二甲苯中脱蜡，依次入无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇各5min，自来水冲洗1-2min。加dapi工作液，室温避光孵育10min，pbs漂洗三次，每次5min。封片后荧光显微镜下观察，结果如图2所示。

结果显示，天然的软骨组织中有较强的荧光，说明未经脱细胞处理的软骨组织有细胞核成分，而脱细胞软骨基质中无荧光，说明制得的脱细胞软骨基质无细胞核成分。

实验例6

对实施例1制得的脱细胞软骨基质以及实施例1中未经脱细胞处理的软骨组织进行抗原ɑ-gal检测，具体实验方法如下：取实施例1制得的脱细胞软骨基质和未经脱细胞处理的软骨组织，分别为实验组和对照组，各组均采用4％的多聚甲醛固定24h，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包、切片，切片厚度为5μm。

将切片置于65℃烤箱中，烤1-2h。然后将切片于二甲苯中脱蜡，依次入无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇各1min，80％乙醇各1min，70％乙醇各1min，pbs冲洗3min，3次。然后置于预先配置好的柠檬酸钠抗原修复液，在高压修复锅中，加入工作液加热至沸腾，放入切片，盖紧后继续加热至限压阀喷气转动开始计时2.5min。离开热源，自然冷却5min，自来水冲洗，冷却至室温后取出切片，pbs冲洗3min，3次。用3％双氧水封闭10分钟，pbs冲洗3min，3次，擦干组织周围的pbst，用中杉金桥正常羊血清封闭1h，倾去血清，勿洗。加入一抗，过夜(ɑ-gal抗体，自带荧光，货号(i21412)1：2000)。pbst，3分钟，3遍，封片，荧光显微镜下观察切片，结果如图3所示。

结果显示，未经脱细胞处理的软骨组织中有荧光，说明有ɑ-gal抗原表达，而脱细胞后的脱细胞软骨基质中没有荧光，说明无ɑ-gal抗原表达。

实验例7

对实施例1制得的脱细胞软骨基质以及实施例1中未经脱细胞处理的软骨组织进行改良masson三色染，具体实验方法如下：取实施例1制得的脱细胞软骨基质和未经脱细胞处理的软骨组织，分别为实验组和对照组，各组均采用4％的多聚甲醛固定24h，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包、切片，切片厚度为5μm，得到石蜡切片。

将石蜡切片浸入bouin固定液，37度温箱内2h媒染，流水冲洗至切片上的黄色消失；天青石蓝2-3min，稍水洗；mayer苏木素8min，稍水洗；酸性乙醇分化液分化数秒；流水冲洗(反蓝)；丽春红品红8min，稍水洗；磷钼酸浸泡；倾去上液，切片不用水洗，直接滴入苯胺蓝染液浸泡；弱酸溶液处理2min；95％乙醇快速脱水，无水乙醇脱水两次，每次5-10s；透明、封片。封片后荧光显微镜下观察，结果如图4所示。

结果显示，说明未经脱细胞处理的软骨组织有细胞核成分和纤维结构，而经脱细胞处理制得的脱细胞软骨基质，纤维结构保存完整，无细胞核成分。

实验例8

对实施例1制得的脱细胞软骨基质以及实施例1中未经脱细胞处理的软骨组织进行ii型胶原免疫组化检测，具体实验方法如下：取实施例1制得的脱细胞软骨基质和未经脱细胞处理的软骨组织，分别为实验组和对照组，各组均采用4％的多聚甲醛固定24h，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包、切片，切片厚度为5μm。

将切片置于65℃烤箱中，烤1-2h。然后将切片于二甲苯中脱蜡，依次入无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇各1min，80％乙醇各1min，70％乙醇各1min，pbs冲洗3min，3次。然后置于预先配置好的柠檬酸钠抗原修复液，在高压修复锅中，加入工作液加热至沸腾，放入切片，盖紧后继续加热至限压阀喷气转动开始计时2.5min。离开热源，自然冷却5min，自来水冲洗，冷却至室温后取出切片，pbs冲洗3min，3次。用3％双氧水封闭10分钟，pbs冲洗3min，3次，擦干组织周围的pbst，用中杉金桥正常羊血清封闭1h，倾去血清，勿洗。加入一抗，过夜(collagenii抗体，货号(ab34712)，1:500)。pbst，3分钟，3遍，封片，荧光显微镜下观察切片，结果如图5所示。

结果显示，说明未经脱细胞处理的软骨组织有细胞核成分和ii型胶原，经脱细胞处理制得的脱细胞软骨基质，ii型胶原保存完整，无细胞核成分。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。