马脂肪间充质干细胞在制备治疗马损伤的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及马脂肪间充质干细胞的分离培养方法及治疗马肌腱炎的干细胞制剂的制备。

背景技术：

过度的训练和创伤性肌腱和韧带损伤在运动赛马中很常见，在大多数情况下，肌腱和韧带损伤的部位通过形成瘢痕组织出现自然地愈合(修复)。但是，自然愈合时间漫长且与正常肌腱韧带组织相比，这种修复过程中形成的瘢痕组织功能存在缺陷，对动物运动的性能方面有影响，会显著降低运动性能。再者存在很大再次受伤的风险。

间充质干细胞(msc)被称为多潜能干细胞，msc来源很广，可从骨髓、软骨、脂肪组织、滑膜组织、关节液、骨膜、脐带血以及脐带华尔通胶质中提取，具有成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和血管细胞等多种中胚层型谱系的能力，具有以下特性：具有归巢及趋化作用；可分化为不同细胞类型；能够分泌多种细胞因子，参与免疫反应；免疫原性低，具有免疫抑制特性。间充质干细胞被认为是最有前途的干细胞来源之一，能够广泛应用于研究和临床中，例如，间充质干细胞已经被应用于人临床中软骨延长、骨缺损疾病、椎间盘、急性心肌梗死、白血病及糖尿病的疾病治疗中，以及兽医临床中犬猫的多系统疾病的治疗。

马间充质干细胞(msc)为马的基础研究和肌肉骨骼疾病提供了希望。肌腱韧带损伤在运动赛马中患病率极高，由于肌腱炎需要长时间的损伤康复，因此对马匹动物而言，返回赛场往往预后不良这也是导致运动马提前退休的关键因素，传统常规治疗肌腱和韧带损伤的方法通常是通过产生功能较差的修复组织，但该愈合阶段相对较长，也导致相对较高复发率。间充质干细胞(msc)作为再生医疗的新型手段，它们的多向分化潜能使它们有助于修复肌腱，韧带和运动马遭受的骨损伤，msc也被认为是同种异体细胞移植中一种很有前途的治疗辅助手段，因为它们具有较低的免疫原性和免疫调节功能。越来越多的证据也显示相对于传统的常规治疗而言再生治疗更具优势。骨髓和脂肪组织是两种最常见的马来源的干细胞，马同种异体脂肪msc可以以微创方式获得并成功繁殖，相比于其他来源的msc，脂肪来源的msc具有取材方便、体外能快速增值分化的优势。

技术实现要素：

本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种可用于有效治疗马损伤特别是肌腱韧带损伤的技术方案。

本发明的另一个目的是提供马脂肪间充质干细胞的分离培养方法，该方法能够提供有效、稳定的、具备生物活性的马脂肪间充质干细胞。

为此，本发明提供了马脂肪间充质干细胞在制备治疗马损伤的药物中的应用。

作为一种优选的实施方式，所述损伤包括但不限于马韧带肌腱损伤。

本发明还提供了一种干细胞制剂，其包括马脂肪间充质干细胞作为活性成分。

作为一种优选的实施方式，所述干细胞制剂还包括用于储存所述马脂肪间充质干细胞的干细胞制剂储存液。更优选地，所述干细胞制剂储存液包括马血白蛋白、红细胞储存液、l-谷氨酰胺和葡萄糖。

作为一种优选的实施方式，所述干细胞制剂储存液按重量百分比包括50％马血白蛋白、49％红细胞储存液和1％l-谷氨酰胺，并按所述干细胞制剂储存液的体积添加1g/l葡萄糖。

优选地，所述马间充质干细胞和所述干细胞储存液的比例为每10⁶个马间充质干细胞添加0.5-1ml所述干细胞储存液。

本发明还提供了一种马脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其包括以下步骤：

步骤1：用pbs缓冲液清洗马脂肪组织，并将其剪碎；

步骤2：用i型胶原酶消化后，细胞筛过滤，离心，弃上清；

步骤3：用完全培养基重悬细胞沉淀后，于37℃、5％co2条件下培养，24h后清洗换液，以后每隔3天换一次液体，待细胞融合度达至70-80％时进行传代培养。

作为一种优选的实施方式，所述步骤2中，所述i型胶原酶的质量体积浓度为0.1％。

作为一种优选的实施方式，所述步骤2中，所述i型胶原酶与所述脂肪组织的体积比是1:1。

作为一种优选的实施方式，所述步骤2中，所述细胞筛为至少100目。

作为一种优选的实施方式，所述步骤3中，所述完全培养基按体积计由89％的dmem/f12基础培养基、10％的胎牛血清和1％的双抗组成。

此处的“双抗”是指含有青霉素(10,000iu)和链霉素(10,000μg/ml)在100倍的工作浓度的混合液。

作为进一步优选的实施方式，所述细胞的培养密度为1×10⁵个/ml。

作为一种优选的实施方式，所述步骤3中，传代培养至p4代。优选地，所述马脂肪间充质干细胞为p4代马脂肪间充质干细胞。

与现有的其他分离培养技术相比，本发明的方法能够提供有效、稳定的、具备生物活性的马脂肪间充质干细胞，其可用于有效治疗马损伤，特别是浅表肌腱损伤。

附图说明

图1是马脂肪间充质干细胞培养贴壁情况。

图2是马脂肪间充质干细胞生长曲线。

图3是马脂肪间充质干细胞的群体倍增时间图。

图4pcr鉴定结果。

图5是马脂肪间充质干细胞的成脂成骨诱导分化结果。

图6是治疗马浅表肌腱损伤注射部位的b超图示。

图7是干细胞治疗肌腱炎前后第0周、第3周、第6周的b超图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。

值得注意的是，本发明提供的羊水间充质干细胞分化为神经干细胞的方法并不用于疾病诊断目的和治疗目的。

如未特别指出，本发明所使用的试剂均为现有试剂，可通过商业渠道获得。出于简要目的，部分技术操作并未具体描述细节，但应理解，这些操作都在本领域技术人员所熟知的范围内，其可以根据本说明书中所记载的内容予以实现。

实施例1：马脂肪间充质干细胞的制备

1.马脂肪间充质干细胞的分离培养

试剂及材料：0.25％胰蛋白酶(0.25g胰蛋白酶溶于100mlpbs中，购自hyclone公司)，0.1％(g/ml)i型胶原酶(sigma公司)，dmem/f12基础培养基(购自hyclone公司)；灭菌过的组织剪；100目细胞过滤器。

本文所用的“dmem/f12”基础培养基是f12培养基(ham‘sf12nutrientmedium)与dmem培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium)以1：1的体积比混配而成的基础培养基。

分离培养步骤如下：

⑴从马的颈部采集脂肪组织，首先对马匹进行麻醉，无菌采取颈部脂肪组织。清洗马脂肪组织，晃动离心管清洗组织块，除去血液等杂质；

⑵剪碎脂肪组织：将组织块转移至15ml的离心管中，用高压灭菌过的剪子剪碎组织块，尽量剪碎；

⑶消化成单细胞：按脂肪组织与0.1％(g/ml)i型胶原酶1：1的体积比，37℃培养箱消化2h，待肉眼看至溶液均匀；

⑷过滤：100目细胞筛过滤，滤出液为单细胞悬液；

⑸离心：将上述滤液用15ml离心管收集后离心(1200rmp5min)，弃去上清，保留沉淀。

⑹培养：往上述沉淀中加完全培养基(按体积计由89％的dmem/f12(hyclone)基础培养基、10％的胎牛血清和1％的双抗组成)，用枪头吹散均匀制成单细胞悬液并调整细胞密度为1×10⁵/ml后转移至60mm培养皿上，在37℃含5％co2培养箱中培养24h后观察生长状态；

⑺换液：2天换一次液，待细胞达到70-80％融合时即进行传代培养；

⑻细胞传代培养：吸弃全部培养基，用pbs洗涤细胞后加入500μl胰酶消化，起雾后加入含5％v/v胎牛血清的dmem/f12培养基作为终止液(细胞与终止液的体积比为1：3)终止消化，把细胞全部吹打下来，转移至5mlep管，1200转离心5min，弃去上清液；离心管中加入1ml上述步骤(6)中的完全培养基，吹吸重悬；调整细胞密度为5×10⁵/ml后将细胞悬液转移至100mm培养皿，5％co2，37℃恒温箱培养。

2.马脂肪间充质干细胞生长曲线的制作

⑴取生长状态良好的p3、p6、p9代细胞消化后调整细胞浓度为1×10⁴，转移至24孔板，每个板0.5ml，37℃，5％co2培养；

⑵24h后开始计数，用pbs洗涤后加100μl胰酶消化，加300μl的终止液终止消化，把细胞都吹下来充分吹匀后取100μl与100μl台盼蓝混匀，细胞计数仪计数；

⑶连续计算8天，每次3个重复。

细胞生长曲线的制作及群体倍增时间计算：传代培养，显微镜下观察细胞形态并绘制p3、p6、p9代细胞的生长曲线，利用公式计算群体倍增时间dt＝t*[lg2/(lgnt-lgno)]。其中t为培养时间，no为首次记下的细胞数，nt为t时间后的细胞数。一般no在接种细胞24小时后进行。

结果如图1和图2所示。图1示出马脂肪间充质干细胞的生长状况，其中，(a)为原代培养72h，(b)为原代培养4d，(c)为原代培养5d，(d)为原代培养6d，(e)为原代培养7d；，(f)为传代p9代细胞的生长状况。

图2和图3示出了第3、6、9代马脂肪间充质干细胞的生长曲线和群体倍增时间。

3.马脂肪间充质干细胞成脂诱导分化

取生长状态良好p4代的细胞进行成脂诱导分化鉴定。

培养液：cyagencaxmx-90031

a液：200ml体系

b液：200ml体系

马脂肪间充质干细胞成脂诱导分化实验步骤如下：

⑴.取生长状态良好的p4代细胞，胰酶消化，调整细胞密度至1×10⁴：

⑵.用24孔板接种4板(2孔诱导组，2孔对照组)，每孔0.5ml，37℃，5％co2条件下培养细胞，3天换一次液，直至细胞达到100％融合。

⑶.融合度达至100％后，弃去孔内的培养基，pbs洗涤2次，每孔加入0.5mla液。

⑷.培养3天后，弃去原液，pbs洗涤2次，每孔加入0.5ml的b液。

⑸.培养1天后，弃去原液，pbs洗涤2次，每孔加入0.5ml的a液。

⑹.重复上述⑷、⑸操作，3-5个循环，最后将细胞养在b液中7天，每3天换一次液。

⑺.油红0染色分析：分化后弃去孔中的培养基，用pbs清洗2次，加入0.5ml4％的多聚甲醛固定细胞，30min弃去液体。用pbs清洗2次，用250μl油红0染色30min；弃去液体，用pbs清洗2-3次，显微镜下观察并拍照。结果如图5所示，图5中，a为第p4代细胞对照组油红o染色；b为第p4代细胞实验组油红o染色。

4.马脂肪间充质干细胞成骨诱导分化

取生长状态良好p4代的细胞进行成骨诱导分化鉴定。

诱导培养液cyagencaxmx-90021

马脂肪间充质干细胞成骨诱导分化实验步骤：

⑴.取生长状态良好的p4代细胞，用胰酶消化，调整细胞密度至1×10⁴；

⑵.用24孔板接种4板(2孔诱导组，2孔对照组)，每孔0.5ml，37℃，5％co2条件下培养细胞，24h后，小心弃去原液，用pbs洗涤2次，加入0.5ml成骨诱导分化培养液；

⑶.3天换一次液，直到出现钙结节。

⑷.茜素红染色：诱导分化后，弃去原来的培养液，用pbs洗涤两次；每孔加0.5ml多聚甲醛溶液，固定30min，弃去液体，用pbs洗2；，加250μl茜素红染色工作液，3-5min弃去液体，用pbs洗涤2-3次，在光学显微镜下观察拍照。染色结果如图5所示。图5中，c为第p4代细胞对照组茜素红染色；d为第p4代细胞实验组茜素红染色。

5.马脂肪间充质干细胞表面标记的pcr鉴定：

马脂肪间充质干细胞的特异性引物鉴定：培养p7代细胞，试剂盒提取rna，反转录成dna，并将dna全组基因作为模板进行pcr体系扩增，电泳检测扩增产物。

rna提取试剂盒takara引物设计如下表：

图4为pcr鉴定结果。其中，m为2000dl-marker，1为cd105，2为cd90，3为cd73，4为cd44，5为空白对照。其中cd105基因片段大小为390bp，cd90基因片段大小426bp，cd73基因片段大小393bp，cd44基因片段大小400bp。

实施例2：干细胞制剂的制备

1.干细胞制剂的组分：p4代脂肪间充质干细胞，马血白蛋白，l-谷氨酰胺，葡萄糖，红细胞储存液。

2.取生长状态良好的马p4代脂肪来源的间充质干细胞，细胞治疗剂量为5-10×10⁶，在间充质干细胞的基础上每10⁶个细胞添加0.2ml的干细胞制剂储存液，该干细胞储存液包括：马血白蛋白，l-谷氨酰胺，葡萄糖，红细胞储存液。

其中干细胞制剂储存液的配比为：50％wt马血白蛋白、49％wt红细胞储存液、1％wtl-谷氨酰胺，并且每升干细胞制剂储存液添加1g葡萄糖。

实施例3：临床病例治疗

1.注射方式

肌腱损伤，在b超帮助下，一点或者多点注射。

2.治疗的细胞量

2-10×10⁶个细胞(视损伤面积而定)，使用时将细胞稀释到10ml生理盐水中。

3.疗程

1-3次注射为一个疗程，间隔分别在第1周、第6周左右b超观察注射干细胞后恢复情况，视情况而定是否第二、三次注射，治愈需要6个月以上的时间。

4.具体操作

剃毛后，用碘酒擦洗损伤部位后用70％v/v酒精重复擦洗，在超声指导下用23号针头注射细胞，将重悬于10ml生理盐水中的2-10×10⁶个细胞以一点或等分试样缓慢注射到核心病变中。超声引导用于确保针从病变部位的侧面进入核心病变。

注射后休息2-3个星期。用超声检查恢复情况，一个月后马匹接受康复治疗，包括走路、小跑和慢跑3至6个月。中途用超声检查恢复情况。中期检查效果不理想的，进行第二或第三次注射。

5.注意事项

注射后，马不宜马上运动，需要休息2-3个星期。一个月后马匹接受康复治疗，包括走路、小跑和慢跑3至6个月。期间重复使用b超检查恢复情况。

6.诊断标准

通过临床观察(肿大部位的管围变化，发热情况，疼痛，站姿)，运动机能(按国际评分标准评定运动指数)，通过采集血液，关节液测定血常规、炎性因子等指标以及在干细胞注射之前和之后通过重复的超声检查，x光监测核心病变来检测干细胞的治疗作用。

临床观察：检查跛足、疼痛、发热和注射部位肿胀情况。

采血：干细胞治疗前，以及干细胞治疗后第1周、6周、12周静脉采血15ml(分2管，第1管10ml不添加抗凝剂用于分离血清，第2管5ml加抗凝剂用于测血常规)，分别做炎性因子(il－6、il－7、tnf-α)、血常规检查检测。

b超：在干细胞治疗前(第0周)、以及干细胞治疗后第在3周、7周进行超声检查，检查马匹的恢复情况。治疗结果如图6至图7所示。

实验结果表明：治疗期间注射干细胞未出现任何不良反应，注射部位无硬实感；肿胀部位管围有缩小的趋势；根据国际跛行评分标准，治疗马匹跛行指数由原来的4级(时散步跛足很明显)降至0级(即任何情况下均未发现跛行。)b超结果也显示病灶区情况得到大大的改善。

序列表

<110>佛山科学技术学院

<120>马脂肪间充质干细胞在制备治疗马损伤的药物中的应用

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