一种银耳多糖提取物在制备治疗干眼症的药物中的用途的制作方法

本发明涉及一种银耳多糖提取物的新用途，尤其涉及一种银耳多糖提取物在制备治疗干眼症的药物中的用途。

背景技术：

干眼病又称角结膜干燥症，是指任何原因引起的泪液质或量异常，或动力学异常导致的泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和(或)眼表组织病变特征的多种疾病的总称。干眼病是最常见的眼表疾病，严重影响患者的生活质量。患者开始症状是灼烧感、异物感、干燥和畏光，随病情进展而加重，最终出现角膜溃疡甚至失明。

目前，流行病学及临床调查显示，美国在65-84岁的人群中，有14.6％患干眼病；加拿大所有验光诊所各30例连续非选择病人的问卷调查表明28.7％的病人有干眼病状；日本8个眼科中心2127例连续门诊病人调查结果，患干眼(泪膜和眼表都异常)有359例

(17％)。我国对眼科门诊患者5136例进行问卷调查，有干眼病745例(14.52％)。

目前认为，干眼病的病因与用眼工作时间过长、环境污染、配戴角膜接触镜、女性内分泌影响、社会老龄化等因素有关，且发病率呈上升趋势。随着干眼的发病率越来越高，干眼的诊断与治疗越来越受人们的重视，对干眼的研究已经成为国内外眼科研究的热点。

目前已有很多学者采取不同的治疗方法进行研究，但至今尚无特效疗法，采用人工泪液制剂减轻症状的治疗是干眼病的主要方法。虽然人工泪液能不同程度地减轻症状，

但都是治标不治本，作用并不能持久。

在中医理论中，干眼病属于“白涩症”范畴，“肝”开窍于目，肝阴濡养眼睛，泪液属于阴液范围，肝阴不足则会导致目失润泽、目干目涩。多个中医临床报道以枸杞为主药的中成药对干眼病有较好的疗效，如杞菊地黄丸等。但内服复方中药起效慢，且对于不同体质的人群难以统一推广应用。

因此，需要开发一种效果明显并且能够从根本上治疗干眼症的药物。

技术实现要素：

针对以上不足，本发明提供一种用于治疗干眼症的银耳多糖提取物，其效果显著，无副作用，成本低，具有显著的开发前景。

本发明通过以下方案达到上述目的：

在本发明的第一方面，提供一种银耳多糖提取物在治疗干眼症中的用途。

在本发明的第二方面，提供一种银耳多糖提取物在制备治疗干眼症的药物中的用途。

上述药物包括滴眼液或眼凝胶。

在本发明的第三方面，提供一种治疗干眼症的药物，包括银耳多糖提取物和药物载体。

上述药物包括滴眼液或眼凝胶。

在本发明的第四方面，提供一种银耳多糖提取物的制备方法，包括：

(1)制备滤液：取鲜银耳，加入鲜银耳量6-10倍体积水，煎煮1-2小时得到第一煎煮液和银耳渣，再在银耳渣中加入鲜银耳量6-10倍体积水，煎煮1-2小时得到第二煎煮液，合并两次煎煮液，浓缩至适当相当于投料量的3-5倍，过滤得到滤液；

(2)超滤：用截留分子量为10000-15000的超滤膜，将滤液进行超滤，得到超滤液；

(3)酶解：调ph至6～7，加入0.5％～1％体积百分比的中性蛋白酶，在60～65℃酶解1～2小时，灭酶活，离心取上清液；

(4)阴离子交换：将上清液通过deae-纤维素进行阴离子交换色谱，收集流出液，再以不同浓度的磷酸盐缓冲液冲洗柱子，检测冲洗液中的蛋白和多糖并且分段收集含多糖的冲洗液，合并流出液和冲洗液，得到合并液；

(5)分子筛树脂：将合并液上分子筛树脂，在线检测蛋白和多糖含量，收集多糖含量高峰部分液体；

(6)纳滤脱盐：将收集的多糖含量高峰部分液体进行纳滤脱盐，以截留分子量为200的纳滤膜进行脱盐。

在本发明的第五方面，提供一种上述制备方法制备得到的银耳多糖提取物。

本发明提供一种银耳多糖提取物的新用途，经实验证明，可以有效地从多方面用于治疗干眼症，效果不逊于现有技术的一些滴眼液，而且起效机制多样，副作用小，同时，提供的制备工艺还具有纯度高，提取率高的特点，不仅成本低，还具有工业化的前景。

附图说明

图1为各组荧光素钠染色阳性反应实验结果图。

图2为在光学显微镜下观察泪腺结果图。

图3为角膜上皮形态图。

图4为结膜杯状细胞图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

现有治疗干眼病的药物，或者是采用人工泪液，治标不治本，其更多地是起缓解效果而非根治作用，作用不能持久；或者是中医的内服药物，例如杞菊地黄丸，其起效慢，并且不同体质人群的效果不一，无法对所有人群都具有效果；或者是滴眼液，例如硫酸软骨素滴眼液、生长因子滴眼液等，它们的价格昂贵，疗效也并不尽如人意。

针对现有治疗干眼病药物的缺陷，发明人进一步对滴眼液进行研究发现，现有的滴眼液，例如例如硫酸软骨素滴眼液、生长因子滴眼液等，它们不仅价格昂贵，而且它们都是单一从提高泪腺分泌量方面起效果，因而疗效不尽如人意。

在此基础上，发明人发现，本发明的银耳多糖提取物对于干眼症具有出乎意料的治疗效果，进一步研究发现，这归功于银耳多糖提取物同时具有恢复杯状细胞数目和功能，恢复角膜上皮细胞完整性，以及提高泪腺分泌量的效用，是治疗干眼症的良方。

在本发明的第一方面，提供一种银耳多糖提取物在治疗干眼症中的用途。

在本发明的第二方面，提供一种银耳多糖提取物在制备治疗干眼症的药物中的用途。

其中，药物优选包括滴眼液或眼凝胶。

优选的，一种银耳多糖提取物在制备治疗干眼症的滴眼液中的用途。

其中，所述银耳多糖提取物在滴眼液中的浓度为0.1mg/ml-2mg/ml。

优选的，一种银耳多糖提取物在制备治疗干眼症的眼凝胶中的用途。

优选的，在本发明的上述两方面用途中，所述银耳多糖提取物优选为下述方法制备得到的银耳多糖提取物。

在本发明的第三方面，提供一种治疗干眼症的药物，包括银耳多糖提取物和药物载体。

优选的，所述药物包括滴眼液或眼凝胶。

优选的，一种治疗干眼症的滴眼液，包括银耳多糖提取物和可药用的载体。

进一步优选的，一种治疗干眼症的滴眼液，包括0.1mg/ml-2mg/ml的银耳多糖提取物和可药用的载体。

进一步优选的，一种治疗干眼症的滴眼液，包括0.1mg/ml-2mg/ml的银耳多糖提取物和氯化钠、冰片。

所述氯化钠和冰片用于调整滴眼液至等渗浓度。

优选的，一种治疗干眼症的眼凝胶，包括银耳多糖提取物和药物载体。

进一步优选的，一种治疗干眼症的眼凝胶，包括银耳多糖提取物和流变调节剂、防腐剂、ph调节剂，所述眼凝胶的ph为7。

优选的，所述流变调节剂为卡波姆。

优选的，所述防腐剂为尼泊金乙酯。

优选的，所述ph调节剂为三乙醇胺。

进一步优选的，一种治疗干眼症的眼凝胶，包括银耳多糖提取物和卡波姆、尼泊金乙酯、三乙醇胺，所述眼凝胶的ph为7。

在本发明的第四方面，提供一种银耳多糖提取物的制备方法，包括：

(1)制备滤液：取鲜银耳，加入鲜银耳量6-10倍体积水，煎煮1-2小时得到第一煎煮液和银耳渣，再在银耳渣中加入鲜银耳量6-10倍体积水，煎煮1-2小时得到第二煎煮液，合并两次煎煮液，浓缩至适当相当于投料量的3-5倍，过滤得到滤液；

(2)超滤：用截留分子量为10000-15000的超滤膜，将滤液进行超滤，得到超滤液；

(3)酶解：调ph至6～7，加入0.5％～1％体积百分比的中性蛋白酶，在60～65℃酶解1-2小时，灭酶活，离心取上清液；

(4)阴离子交换：将上清液通过deae-纤维素进行阴离子交换色谱，收集流出液，再以不同浓度的磷酸盐缓冲液冲洗柱子，检测冲洗液中的蛋白和多糖并且分段收集含多糖的冲洗液，合并流出液和冲洗液，得到合并液；

(5)分子筛树脂：将合并液上分子筛树脂，在线检测蛋白和多糖含量，收集多糖含量高峰部分液体；

(6)纳滤脱盐：将收集的多糖含量高峰部分液体进行纳滤脱盐，以截留分子量为200的纳滤膜进行脱盐。

优选的，一种银耳多糖提取物的制备方法，包括：

(1)制备滤液：取鲜银耳，加入鲜银耳量10倍体积水，煎煮1小时得到第一煎煮液和银耳渣，再在银耳渣中加入鲜银耳量8倍体积水，煎煮1小时得到第二煎煮液，合并两次煎煮液，浓缩至适当相当于投料量的3-5倍，过滤得到滤液；

(2)超滤：用截留分子量为10000的超滤膜，将滤液进行超滤，得到超滤液；

(3)酶解：调ph至6～7，加入0.5％～1％体积百分比的中性蛋白酶，在60℃酶解1～2小时，灭酶活，离心取上清液；

(4)阴离子交换：将上清液通过deae-纤维素进行阴离子交换色谱，收集流出液，再以不同浓度的磷酸盐缓冲液冲洗柱子，检测冲洗液中的蛋白和多糖并且分段收集含多糖的冲洗液，合并流出液和冲洗液，得到合并液；

(5)分子筛树脂：将合并液上分子筛树脂，在线检测蛋白和多糖含量，收集多糖含量高峰部分液体；

(6)纳滤脱盐：将收集的多糖含量高峰部分液体进行纳滤脱盐，以截留分子量为200的纳滤膜进行脱盐。

优选的，在步骤(1)中，所述浓缩为减压浓缩。

优选的，在步骤(1)中，所述过滤为采用离心机过滤。

在步骤(2)的超滤过程中，滤去的小于10000的部分主要是小分子中药成份例如黄酮、皂苷等，而超滤液为分子量大于10000的药液部分，主要含多糖和蛋白。

在步骤(3)的酶解中，采用中性蛋白酶酶解的主要作用是去除一部分蛋白。

优选的，在所述步骤(3)中，灭酶活采用90℃，10min。

优选的，在所述步骤(3)中，所述离心为高速离心。

在步骤(4)中，上清液通过deae-纤维素进行阴离子交换色谱分析，流出液含中性多糖，而含阴离子的多糖和蛋白质吸附在柱上，再以不同浓度的磷酸盐缓冲液冲洗柱子，冲洗液中含有蛋白和含阴离子的多糖，分段收集，将流出液(含中性多糖)和含阴离子多糖的冲洗液合并，从而实现收集含有多糖部分液体的目的。

优选的，在步骤(4)中，以考马斯亮蓝法检测蛋白。

优选的，在步骤(4)中，以苯酚硫酸法检测多糖。

在步骤(5)中，采用分子筛树脂将多糖峰和蛋白峰予以分离。

优选的，在步骤(5)中，采用蒸发光检测器和紫外检测器实时在线检测。

优选的，在步骤(5)中，以苯酚硫酸法检测多糖含量。

优选的，在步骤(5)中，以考马斯亮蓝法检测蛋白含量。

在步骤(6)中，脱盐目的主要是脱去冲柱时含有的磷酸盐缓冲液成分。

在本发明的第五方面，提供一种上述制备方法制备得到的银耳多糖提取物。

本发明从银耳中提取多糖成分，经离子交换技术、分子筛技术、透析技术等，去除多糖夹杂的蛋白等，再调整渗透压、除菌等工艺，得到多糖纯度在95％以上的银耳多糖提取物。

经经济学分析，按本发明的制备工艺，药理有效浓度0.1mg/ml-2mg/ml浓度的滴眼液，成本在2元/10ml左右，与市售的硫酸软骨素滴眼液、生长因子滴眼液等(约30元/瓶10ml)相比，有明显的成本和疗效优势。

经动物药理实验发现，本发明的银耳多糖提取物治疗能明显促进干眼病模型小鼠泪腺分泌、减少角膜损伤，明显恢复杯状细胞数目，是一种理想的治疗干眼症药物或药物原料。

本发明根据中医学养阴治疗的理论，从银耳中提取的多糖提取物，可以用于制成滴眼液、眼用凝胶等药物，用于眼睛局部外用，对于干眼病有良好治疗作用。由于多糖为无色无味的物质，且对眼表粘膜无刺激，相对于中药材中其他成份如黄酮、皂苷、生物碱等，具有开发成为眼用滴眼液、眼凝胶的天然优势。

以下采用具体实施例对本发明进行进一步详细的说明。

实施例1：银耳多糖提取物制备方法

1、取鲜银耳10kg，用水煎取2次，加水量分别为生药量的10倍、8倍体积，分别煎煮1小时，合并2次煎取液，减压浓缩，浓缩至100l，三足离心机过滤，取上清滤液。

2、用截留分子量为10000的超滤膜，将提取液进行超滤，滤去小于10000的小分子中药成份如黄酮、皂苷等，取分子量大于10000的药液部分，主要含多糖和蛋白。

3、调ph至6-7，加入0.5％～1％体积百分比的中性蛋白酶，在60℃酶解1-2小时，主要目的是去除一部分蛋白，90℃，10min灭酶，管式离心机高速离心，取上清液。

4、上清液通过deae-纤维素进行阴离子交换色谱分析，流出液为含中性多糖的流出液，而含阴离子的多糖和蛋白质吸附在阴离子柱上，再以不同浓度的磷酸盐缓冲液冲洗柱子，分段收集冲洗液，分别以考马斯亮蓝法检测蛋白，以苯酚硫酸法检测多糖，合并含多糖的冲洗液，合并流出液和含阴离子多糖的冲洗液。

5、将含有多糖的合并液上分子筛树脂，以蒸发光检测器和紫外检测器实时在线检测，以苯酚硫酸法检测多糖含量，以考马斯亮蓝法检测蛋白含量，收集流出液中的多糖含量高峰，以实现将多糖峰和蛋白峰予以分离的目的。

6、将收集的流出液以截留分子量为200的纳滤膜进行脱盐，以脱去冲柱时含有的磷酸盐缓冲液成分，得到银耳多糖提取物。

制备的银耳多糖提取物的多糖纯度达到95％以上，提取率达到15％以上。

实施例2：银耳多糖提取物的滴眼液

1、以冰点渗透压仪测定银耳多糖提取物的渗透压，以氯化钠和冰片作为辅料，调整渗透压至等渗浓度，以苯酚硫酸法检测滴眼液的多糖含量，调整多糖含量在0.1mg/ml-2mg/ml之间。

2、以0.22μm微孔滤膜过滤除菌，灌装成滴眼液。

经计算，1000g中药材约可制备50～100瓶(10ml每瓶)的滴眼液。

实施例3：银耳多糖提取物的眼用凝胶

取2克卡波姆940，加入100ml纯水中，溶胀为透明凝胶备用；取实施例1制备的银耳多糖提取物800ml，与卡波姆凝胶混合，并加入三乙醇胺调ph至7，加入适量的尼泊金乙酯防腐，用适量纯水补至1000ml，搅拌均匀，无菌分装，即得。

试验例1：

银耳多糖组：实施例2的银耳多糖滴眼液(多糖含量为0.6mg/ml)；

阳性对照组：复方硫酸软骨素滴眼液(曼秀雷敦药业有限公司)；

spf级小鼠，均由广州中医药大学医学实验动物中心提供，体重18g～22g，40只，雌雄各半。

取40只实验小鼠(雌雄各半)，共分为4组，各组分别为：正常组、模型组、阳性对照组、银耳多糖组。除正常组外，其他三组小鼠颈背部皮下注射硫酸阿托品溶液以抑制小鼠泪腺分泌泪液，每次用量为0.3ml，含硫酸阿托品0.6mg，每日三次(每次时间：9：00，14：00，19:00)，使小鼠全天均处于泪腺分泌抑制状态，一直持续三周。在实验的第七天，给予阳性对照组小鼠右眼给予复方硫酸软骨素滴眼液滴眼，每日三次，空白组和正常组的小鼠右眼均给予生理盐水，银耳多糖组小鼠右眼给予实施例2的银耳多糖滴眼液

(每次时间：10：00，15：00，20：00)。

在实验的第7、21天进行泪液分泌测定和角膜荧光染色测定，并记录数据。

统计学方法：单因素方差分析，以spss软件进行分析。

1、schirmeri试验

检查泪液基础分泌情况。方法：考虑到小鼠眼睛较小，取5mm×35mm泪液检测滤纸对折减半，将前端折叠，轻轻放入被测眼下结膜囊，并保持挂垂，3min后取出滤纸，观察滤纸条湿润长度。schirmeri试验结果如表1所示。

表1各组schirmeri试验结果(平均数±标准差，各组n＝10)

与正常组相比，△<0.05，^▲p<0.01。与模型组相比，^○p<0.05，^●p<0.01。与阳性对照组相比，^■p<0.01。

从表1可以看出，在实验第7天时，模型组和银耳多糖组、阳性对照组与正常组相比，滤纸湿润长度显著降低，说明干眼症造模成功，并且模型组和银耳多糖组、阳性对照组之间没有显著差异，而从实验第7天开始给予阳性对照组小鼠右眼给予复方硫酸软骨素滴眼液滴眼和给予银耳多糖组以实施例2的银耳多糖滴眼液，而在实验第21天时测定的纸湿润长度可以看出，模型组与第7天相比，有轻微减少，而银耳多糖组和阳性对照组都显著增加，并且与正常组相当。

这说明，本发明的银耳多糖提取物具有与阳性对照(硫酸软骨素滴眼液)相当的滤纸湿润长度评价的干眼症治疗效果。

2、眼表损伤的检查

荧光素钠染色阳性反应角膜上皮细胞缺损。

实验方法：用滴管滴2％荧光素钠溶液于小鼠结膜囊内，5min后用注射器吸取生理盐水轻轻清洗眼部。在裂隙灯显微镜钴蓝光下观察着色情况。评分方法：将角膜分为4个象限，为颞上方、颞下方、鼻上方、鼻下方等4个象限，每个象限按照0～3分评分，每个角膜评分为4个象限评分之和。每次检查各组均测量小鼠右眼，记录数据。规定无染色为0，有染色则分轻、中、重3级，因此共0～12分。

荧光素钠染色阳性反应积分结果如表2所示，各组荧光素钠染色阳性反应实验结果图如图1所示。

表2各组荧光素钠染色阳性反应实验比较(平均数±标准差，各组n＝10)

与正常组相比，△<0.05，^▲p<0.01。与模型组相比，^○p<0.05，^●p<0.01。与阳性对照组相比，^■p<0.01。

从表2可以看出，实验第7天时，模型组和银耳多糖组、阳性对照组的荧光素钠染色阳性反应积分相近并且与正常组相比有显著升高，说明三组的建模成功并且均一性好，而从实验第7天开始给予阳性对照组小鼠右眼给予复方硫酸软骨素滴眼液滴眼和给予银耳多糖组以实施例2的银耳多糖滴眼液，从实验第21天时的荧光素钠染色阳性反应积分可以看出，模型组与第7天相比，进一步显著升高，而银耳多糖组和阳性对照组都显著减少，快接近正常组水平。与阳性对照组相比，银耳多糖组的更显著减少。

从图1可看出，正常组角膜无荧光素钠染色阳性反应；模型组角膜荧光素钠染色阳性反应明显，可见绿色荧光物质充满角膜4个象限；银耳多糖治疗组角膜无荧光素钠染色阳性反应，与正常组无明显差异，说明可理想地恢复角膜完整性；与模型组相比，阳性对照组角膜中绿色反应物质减少，但未达到银耳多糖治疗组水平。

以上结果说明，与模型组相比，银耳多糖组和阳性对照组都具有恢复角膜完整性的效果，而与阳性对照组相比，银耳多糖组的效果更好。

3、组织病理学观察

he染色取动物的结膜、角膜置于中性甲醛中固定。常规石蜡包埋，切片，予常规的苏木精-伊红染色，显微镜下观察。

电镜标本制作与取材：先将小鼠断颈处死，然后剪下小鼠头部，顺着矢状线剪开两半放入组织固定液中浸泡两周。然后再解剖，取出小鼠眼穹隆部分，使用扫描电子显微镜观察其右眼角膜上皮细胞与结膜杯状细胞。

在光学显微镜下观察泪腺结果如图2所示，角膜上皮形态如图3所示，结膜杯状细胞如图4所示。

如图2所示，正常组的泪腺小叶结构排列整齐，泪腺上皮细胞为高柱状。模型组可见泪腺上皮细胞萎缩，可见空泡融合。银耳多糖治疗组和阳性药对照组的泪腺结构未见明显异常，腺腔上皮结果完整。

如图3所示，正常组的角膜表层上皮细胞排列整齐。模型组的角膜部分表层细胞松散、脱落。银耳多糖治疗组和阳性药对照组的角膜上皮排列整齐。

从图4可发现，正常组具有较多完好的杯状细胞，而模型组几乎没有，且伴有炎性细胞浸润。银耳多糖组和阳性对照组滴眼液组杯状细胞明显多于模型组，均无炎性细胞浸润，其中银耳多糖组疗效更为显著。

综上所述，本发明的银耳多糖提取物具有比现有技术的滴眼液相比，更加显著的杯状细胞恢复能力、角膜完整性恢复能力。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。