circ_2157在制备鼻咽癌治疗制剂中的应用和治疗制剂的制作方法

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种抑制环状rnacirc_2157的试剂及其在制备鼻咽癌治疗制剂中的应用。

背景技术：

目前环状rna(circularrna)是个研究热点，circrna主要来源于蛋白质编码基因的外显子区，也可以由内含子区、utr区、基因间区、非编码rna位点及已知转录物的反义位点形成。circrna是由前体mrna(precursormessengerrna,pre-mrna)反向拼接而形成的一类不具有5‘末端帽子和3’末端poly(a)尾巴并以共价键形成环形结构的非编码rna分子。

circrna形成过程可以分为两大类，即外显子环化(exoncircularization)和内含子环化(introncircularization)两大机制。jeck等提出外显子来源的circrna(exoniccircrna,ecircrna)可以分为套索驱动环化(lariat-drivencircularization)和内含子配对驱动环化(intron-pairing-drivencircularization)两种形成方式，套索驱动环化是外显子3’端作为剪接供体(splicedonor)攻击5’端剪接受体(splicereceptor),alu区共价结合而形成套索结构，套索结构进行内部拼接后切除内含子形成circrna；内含子配对驱动环化是两个内含子碱基互补配对形成环状结构后，剪除内含子形成circrna。其实内含子本身也可以环化，可以形成内含子来源circrna(circularintronicrna,cirna)。circrna是由前体mrna反向拼接而形成的一类不具有5‘末端帽子和3’末端poly(a)尾巴并以共价键形式形成的封闭环形结构的非编码rna分子。有着高度的稳定性、保守性、特异性，并且含量高的特点。

circrna最早在1976年于rna病毒中首次发现，随后hsumt等人使用电子显微镜技术在猴的肾细胞质中发现了circrna的存在。在1996年，circrna在人类细胞中被发现，随着rna-seq新一代测序技术的发展，近年来越来越多的circrna被发现，目前为止已知的circrna数目已经达到三万多个。circrna也不再被认为是错误的rna转录本，而是作为非编码rna研究中的耀眼之星冉冉升起。筛选和验证更多的新型circrna作为肿瘤诊断和预后的生物标志物及其应用，并能尽早在专利领域得到好的保护，能显著提升我国在该技术领域的国际竞争力。

鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，npc)属于头颈部肿瘤，起源于鼻咽部上皮组织。一般在鼻咽部的后外侧隐窝(罗森缪勒窝，fossaofrosenmüller)处发病，此处的鼻咽癌细胞易侵袭邻近的组织和器官。由于鼻咽癌的发生发展是由积累的家族遗传和体细胞遗传突变及表观遗传学突变导致的多阶段复杂基因调控过程，涉及到原癌基因和抑癌基因的激活和沉默、及ncrna参与的表观遗传学调控等等。所以鼻咽癌发生发展的具体分子机制尚不明确，而且由于肿瘤异质性和个体差异性，传统的放疗联合化疗的疗效不显著。因此通过circrna探究其与鼻咽癌发生发展机制，进一步为鼻咽癌的诊断，以及控制鼻咽癌增殖、侵袭和转移将是研究的热点。

我们在5-8f细胞的rna-seq中检测到长度667bp的circ_2157，通过试验发现该环状rna与鼻咽癌的发生发展存在关联，有可能作为鼻咽癌诊断标记物，以及治疗的靶点。

技术实现要素：

本发明从5-8f细胞的rna-seq中发现了大小667bp的circ_2157，并发现了它与鼻咽癌之间存在的关系，有可能作为鼻咽癌诊断标记物和治疗的靶点。

本发明的第一个目的是提供一种抑制环状rnacirc_2157的制剂在制备治疗鼻咽癌制剂中的应用，所述的环状rnacirc_2157序列如seqidno.1所示。

进一步的，所述的抑制环状rnacirc_2157的制剂包括sirna。

进一步的，所述的sirna如下：

正义链(5'-3')cgggaaagguugaaaggauuu

反义链(5'-3')auccuuucaaccuuucccguu。

进一步的，所述的抑制circ_2157的试剂还包括阴性对照：

正义链(5'-3')uucuccgaacgugucacguuu

反义链(5'-3')acgugacacguucggagaauu。

本发明的第二个目的是提供一种治疗鼻咽癌的制剂，包括抑制环状rnacirc_2157的制剂，所述的环状rnacirc_2157序列如seqidno.1所示。

进一步的，所述的抑制环状rnacirc_2157的制剂包括sirna。

进一步的，所述的sirna如下：

正义链(5'-3')cgggaaagguugaaaggauuu

反义链(5'-3')auccuuucaaccuuucccguu。

进一步的，所述的抑制circ_2157的试剂还包括阴性对照：

正义链(5'-3')uucuccgaacgugucacguuu

反义链(5'-3')acgugacacguucggagaauu。

但本发明不仅仅限于上述提供的sirna和阴性对照。

鼻咽癌治疗制剂还包括转染sirna所需的试剂。

目前，sirna已发展成为基因功能研究的重要工具。为了探究circ_2157在肿瘤发生发展中的作用，我们根据circ_2157的拼接位点设计了一对sirna，利用hiperfect试剂将sirna和sinc瞬时转染到hone1、hne2和cne2细胞系中沉默circ_2157的表达。转染后继续培养36小时收集细胞，利用实时荧光定量pcr技术检测circ_2157的表达水平以检测sirna的转染效率，同时检测circ_2157的表达水平，发现设计的sirna能显著抑制circ_2157的表达水平。

本发明通过大量的试验证实上述结论：即抑制circ_2157的试剂能够用于制备鼻咽癌治疗制剂。这些试验包括：体外过表达circ_2157试验发现能促进鼻咽癌细胞增殖，体外沉默circ_2157则抑制鼻咽癌细胞的增殖；体外过表达circ_2157促进鼻咽癌细胞的迁移，体外沉默circ_2157抑制鼻咽癌细胞的迁移；体外过表达circ_2157促进鼻咽癌细胞的侵袭，体外沉默circ_2157的表达抑制鼻咽癌的侵袭。

由于sirna具有良好的沉默效果。在确保circ_2157被干扰掉后，我们在沉默了circ_2157的鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2中进行mtt实验，相对于nc组，sirna组细胞的增殖速度明显减慢，即沉默circ_2157抑制了鼻咽癌细胞的增殖。即抑制circ_2157能治疗鼻咽癌，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

附图说明

图1为qrt-rcr检测鼻咽癌组织和非肿瘤鼻炎上皮组织中circ_2157的表达水平；

circ_2157的表达水平分析以β-actin作为参照将非肿瘤鼻咽上皮组织标准化为1，n为非肿瘤鼻咽上皮组织，样本数为12；t为鼻咽癌组织，样本数为29，n为样本数量，均采用t检验，p<0.05具有统计学意义。

图2为过表达载体图谱。

图3为qrt-pcr检测在鼻咽癌细胞系中circ_2157过表达效果；

qrt-pcr检测在鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2中circ_2157过表达效果以β-actin作为参照将pcdna3.1(+)组标准化为1，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图4为qrt-pcr技术检测鼻咽癌细胞系中circ_2157sirna的沉默效率；

qrt-pcr检测在鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2中circ_2157sirna的沉默效率；circ_2157表达水平分析以β-actin作为参照，将ncsirna组标准化为1，ns代表没有意义，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图5为体外过表达circ_2157对鼻咽癌细胞增殖的影响；

a-c.qrt-pcr检测在鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2中circ_2157过表达效率；d-f.对上述细胞进行mtt实验检测细胞增殖能力，circ_2157表达水平分析以β-actin作为参照，将pcdna3.1(+)组标准化为1，ns代表没有意义，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图6为体外沉默circ_2157对鼻咽癌细胞增殖的影响；

a-c.qrt-pcr检测在鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2中circ_2157过表达效率；d-f.对上述细胞进行mtt实验检测细胞增殖能力，circ_2157表达水平分析以β-actin作为参照，将pcdna3.1(+)组标准化为1，ns代表没有意义，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图7为qrt-pcr检测划痕实验细胞中circ_2157过表达效率；

a-c.划痕实验所用鼻咽癌细胞株hone1、hne2和cne2转染效率用qrt-pcr实验检测，circ_2157表达水平分析以β-actin作为参照，将pcdna3.1(+)组标准化为1，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图8为过表达circ_2157对鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2划痕愈合实验的影响；

a-c.鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2转染pcdna3.1(+)空载、pcdna3.1(+)/circ_2157，待细胞密度达到100％后划痕，于第0,12,24小时观察拍照。

图9为过表达circ_2157的鼻咽癌hone1、hne2和cne2细胞划痕实验统计图；

a-c.每组随机选取6个视野测量划痕宽度,将0小时的划痕宽度标准化为1，作统计图；每个实验重复三次,采用student'st-test方法统计。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图10为qrt-pcr检测划痕实验细胞中circ_2157干扰效率；；

a-c.划痕实验所用鼻咽癌细胞株hone1、hne2和cne2转染效率用qrt-pcr实验检测，circ_2157表达水平分析以β-actin作为参照，将ncsirna组标准化为1，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图11为干扰circ_2157对鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2划痕愈合实验的影响；

a-c.鼻咽癌hone1、hne2和cne2细胞转染ncsirna/circ_2157sirna，待细胞密度达到100％后划痕，于第0,12,24小时观察拍照。

图12为干扰circ_2157的鼻咽癌hone1、hne2和cne2细胞划痕实验统计图；

a-c.每组随机选取6个视野测量划痕宽度,将0小时的划痕宽度标准化为1，作统计图；每个实验重复三次,采用student'st-test方法统计。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图13为qrt-pcr检测transwell小室基质胶侵袭实验中circ_2157的过表达效率；

a-c.transwell小室基质胶侵袭实验所用鼻咽癌细胞株hone1、hne2和cne2转染效率用qrt-pcr实验检测，circ_2157表达水平分析以β-actin作为参照，将pcdna3.1(+)组标准化为1，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图14为过表达circ_2157对鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2侵袭能力的影响；

分别过表达circ_2157的hone1、hne2和cne2以及各自的对照组细胞进行transwell小室基质胶侵袭实验。

图15为过表达circ_2157的transwell小室基质胶侵袭实验统计图；

每组随机选取3个细胞视野进行细胞计数，作统计图；每个实验重复三次，采用student'st-test方法统计；以β-actin作为参照，将pcdna3.1(+)组标准化为1，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图16为qrt-pcr检测transwell小室基质胶侵袭实验中circ_2157的干扰效率；

a-c.transwell小室基质胶侵袭实验所用鼻咽癌细胞株hone1、hne2和cne2转染效率用qrt-pcr实验检测，circ_2157表达水平分析以β-actin作为参照，将nc组标准化为1，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图17为干扰circ_2157对鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2侵袭能力的影响；

分别干扰circ_2157的hone1、hne2和cne2以及各自的对照组细胞进行transwell小室基质胶侵袭实验。

图18为干扰circ_2157的transwell小室基质胶侵袭实验统计图；

每组随机选取3个细胞视野进行细胞计数，作统计图；每个实验重复三次，采用student'st-test方法统计；以β-actin作为参照，将nc组标准化为1，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

具体实施方式

以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

本发明所用的正常炎性鼻咽上皮组织和鼻咽癌组织标本均来自中南大学附属肿瘤医院治疗的初诊患者，未经放化疗和手术治疗。新鲜鼻咽癌组织采集好后，立即放入液氮罐中保存,随后搜集所有病人的相关临床资料所有实验用组织样本采集均获得中南大学伦理委员会授权和病人同意。

本发明所用hone1、hne2和cne2三株鼻咽癌细胞系均为中南大学肿瘤研究所分子遗传实验室所保存。细胞培养条件为：含10％胎牛血清(fbs)和1％双抗(青霉素、链霉素)的rpmi1640液体培养基，37℃、95％湿度、5％co2浓度的恒温培养箱内贴壁生长。

本发明环状rna的引物与线性rna引物的设计不同，其是根据拼接位点两侧设计，在primer3.0网站上在线设计，最终的引物合成工作，通过发送电子邮件订货，委托擎科生物公司长沙合成部合成。

(1)β-actin

上游引物：5’-tcaccaactgggacgacatg-3’，序列如seqidno.2所示；

下游引物：5’-gtcaccggagtccatcacgat-3’，序列如seqidno.3所示。

(2)环状rnacirc_2157实时定量pcr引物

上游引物：5’-gtcggagctttattgggcc-3’，序列如seqidno.4所示；

下游引物：5’-atagcctttccaccgaacca-3’，序列如seqidno.5所示。

(3)扩增circ_2157全长引物

上游引物：5’-ccatcgatgggttgaaaggattgttgacaa-3’，序列如seqidno.6所示；

下游引物：5’-tccccgcggggactttcccgttaacagctaag-3’，序列如seqidno.7所示。

本发明为了特定的敲低环状rna而不影响它的线性基因表达，根据拼接位点设计sirna，靶向沉默circ_2157。

circ_2157sirna序列：

正义链(5'-3')cgggaaagguugaaaggauuu，序列如seqidno.8所示；

反义链(5'-3')auccuuucaaccuuucccguu；序列如seqidno.9所示。

阴性对照：

正义链(5'-3')uucuccgaacgugucacguuu，序列如seqidno.10所示；

反义链(5'-3')acgugacacguucggagaauu，序列如seqidno.11所示。

本发明试验结果均采用统计学分析：t检验用来评价两组之间的差异。卡方检验用来评估基因表达或不表达在性别、年龄、肿瘤阶段、临床分期和转移情况等临床参数方面的差异。生存分析采用kaplan–meier方面检验。p<0.05用于表示统计学显著性，所有p值均使用双侧检验。统计分析采用spss13.0和graphpad5.0软件进行。

实施例1：circ_2157在鼻咽癌组织和细胞中的表达

1、按照标准样本采集方案，我们从湖南省肿瘤医院收集鼻咽癌患者组织样本41例。所有病例均为湖南省肿瘤医院头颈外科的初诊患者(时间区间：2016年1月至2016年11月)。经病理科确诊鼻咽癌29例，鼻咽炎症患者12例(已排除肿瘤性疾病、无活动性传染病、严重免疫性疾病和其他重大疾病)。

采集的过程中记录完整的个人信息和临床资料，包括姓名、性别、年龄、门诊编号、住院编号、病理类型、病例分期、以及ebv感染情况等，详见excel电子表格截图。所有样本的采集都征得病人允许，并与病人签署书面协议，建立资料较完整的标本库。

2、鼻咽癌或正常炎性鼻咽组织rna提取

(1)准备工作：研钵用洗涤剂清洗后浸泡于3％的双氧水(h2o2)中4小时以上，冲刷数次，用蒸馏水洗一次，用锡箔纸覆盖研钵(有助于受热均匀，取出时防止污染)，置于180℃干燥箱中干烤8小时以上。达到干烤时间后，关闭干燥箱，待干燥箱温度降至室温时取出研钵，存放于洁净区。

(2)液氮研磨：在研钵中加入液氮预冷，然后夹取冻存管中保存的鼻咽部组织，快速研磨，一边研磨，一边继续加入少量液氮，再研磨，直到将鼻咽组织磨成粉末状。依据最佳比例，即每50-100mg正常或鼻咽癌样本(npc)加1mltrizol。我们实验过程中，一个鼻咽癌组织样本约200mg左右，因此需要2mltrizol。然后进一步研磨混匀，置于冰箱4℃大约5-10min，让组织完全裂解。待裂解产物融化成粉红色液体时转移至2mltube。每个样品可以分离至2个tube，保存至-80℃。

(3)水相分离：每1000μl含trizol的组织裂解液添加200μl4℃预冷的氯仿，震荡约30s进行混匀。低温环境放置5分钟后，进行25分钟离心操作(12,000rpm，4℃)。离心完毕，可观察到管内液体分为3层，上层透明层中存在rna，中层是膜状的白色沉淀，下层粉红色。因此，进一步吸取含有rna的上层水相至1.5mltube中，用100μl枪轻柔吸取，尽量避免吸到中层和下层物质，造成rna污染。

(4)rna沉淀：在上清中加入1:1等体积的异丙醇约500μl，动作轻柔地上下颠倒混匀数次，置于冰箱-20℃放30分钟后，离心30分钟(4℃,12,000rpm)，可见管底有rna沉淀，用100μl移液枪吸弃去上清，尽量保留rna沉淀。

(5)rna洗涤：每管rna沉淀样品加入1ml用无酶水制备的75％乙醇，温和上下倒置离心管，以洗涤rna沉淀。然后离心5分钟(4℃,7,600rpm)，用100μl的移液枪尽量弃去上清，室温晾干10～15分钟。

(6)重新溶解rna并保存：每管样品加入15-30μldecp水，保存于-80℃。

3、细胞总rna提取

准备工作：灭菌后的无rnase水、75％乙醇(无rnase配制)、氯仿、异丙醇、1×pbs、无酶tip头和ep管，高速低温离心机预冷至4℃，实验开始前先将实验台面及移液枪用75％酒精擦拭。

(1)取待提取rna的细胞，用1×pbs或d-hanks清洗两次；

(2)12孔板中每孔加500μltrizol裂解液，室温裂解1-2分钟，用移液枪轻轻吹下细胞，上下轻柔颠倒10次，室温静置5分钟；

(3)加入100μl的氯仿(按1mltrizol:0.2ml氯仿:0.5ml异丙醇)，用力震荡15-30s，冰上放置5分钟；

(4)4℃，12000rpm/20min；

(5)取上层水相于预冷的tube管中，加入250μl异丙醇，用漩涡混合器或移液枪混匀(-20℃>1h)；

(6)4℃，12000rpm/30min，弃上清；

(7)加入75％乙醇(预冷)1ml，混匀；

(8)4℃，7600rpm/5min；弃上清，重复步骤8,9；

(9)闪离10s，尽量吸尽上清，倒置干燥10分钟；

(10)加入20-30μldepc，测rna浓度和od值。

4、基因circrna逆转录pcr反应

(依据abm公司5×all-in-onertmastermix(withaccurtgenomicdnaremovalkit)(#g492)的实验说明手册操作，)

配置如下反应体系：

逆转录pcr上机反应程序如下：

25℃10min，

42℃15min，

85℃5min。

待反应结束后，-20℃保存产物备用。

5、实时荧光定量pcr

先将逆转录反应产物稀释5倍，然后依据abm公司evagreenqpcrmastermix(mastermix-r)的实验说明手册操作，配置如下反应体系：

实时荧光定量pcr机上反应程序如下：(cycle×39)

bio-radiq5实时荧光定量pcr仪进行上述反应完成后，与内参基因β-actin标化,以

2-^δδct值显示目标基因的相对表达量，判定基因的表达差异。采用unpairedt-test检验计算p值。

结果：收集多例鼻咽癌组织和正常炎性鼻咽上皮组织，利用qrt-pcr技术检测了circ_2157的表达情况。结果显示，与12例正常炎性鼻咽上皮组织相比，circ_2157在29例鼻咽癌组织中明显高表达，在鼻咽癌组中circ_2157表达水平大约是正常炎性鼻咽上皮的5倍，两组数据的差异具有统计学意义(p＝0.0279)，结果见图1。因此，circrnacirc_2157在鼻咽癌组织中高表达，circ_2157对鼻咽癌的发生发展可能具有重要的生物学功能。

实施例2：在鼻咽癌细胞系中circ_2157过表达效果检测

首先我们选择酶切位点，将circ_2157全长序列放入nebcutter2.0在线网站分析，显示clai和sacii酶切位点为circ_2157全长序列中不存在的位点，同时在pcdna3.1质粒载体(购于invitrogen公司)中单一存在的dna限制性内切酶。据此构建过表达载体；图2为绘制的过表达载体图谱。

为了检测circ_2157的成环效率，首先我们将构建的pcdna3.1/circ_2157真核过表达载体在鼻咽癌细胞中进行表达。把生长状况良好的第三、四代鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2种到12孔板中，待细胞融合度达到60％-80％时，用脂质体法lipofectamine3000把无内毒素质粒pcdna3.1空载体和pcdna3.1/circ_2157过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2，继续培养到48小时后。收集细胞，利用实时荧光定量pcr技术检测circ_2157的表达水平及成环效率。qpcr结果显示，与pcdna3.1空质粒组细胞相比，转pcdna3.1/circ_2157过表达质粒组的细胞中circ_2157的表达水平显著升高，且在hone1、hne2和cne2细胞系中其表达倍数均在20倍以上，见图3，结果具有统计学意义。

实施例3：在鼻咽癌细胞系中沉默circ_2157表达的效果检测

根据拼接位点设计了circ_2157的si序列，sirna即一类长度为21-25个核苷酸，能与同源rna互补结合，特异性降解目的rna，从而抑制其表达的双链rna分子。目前，sirna已发展成为基因功能研究的重要工具。为了探究circ_2157在肿瘤发生发展中的作用，我们根据circ_2157的拼接位点设计了sirna，利用hiperfect试剂将sirna和sinc(空白对照)瞬时转染到hone1、hne2和cne2细胞系中沉默circ_2157的表达。转染后继续培养48小时收集细胞，利用实时荧光定量pcr技术检测circ_2157的表达水平以检测sirna的转染效率，确认此次转染效率降低到50％以下，结果见图4。

实施例4：体外过表达circ_2157促进鼻咽癌细胞增殖

我们首先用脂质体法lipofectamine3000把无内毒素质粒pcdna3.1和pcdna3.1/circ_2157过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2，继续培养48小时后，利用qrt-pcr确保circ_2157在鼻咽癌细胞系中表达水平升高后，进行mtt实验，验证其对细胞增殖的影响。基于第一至第五天的检测结果，我们并发现pcdna3.1空质粒组和pcdna3.1/circ_2157过表达质粒组之间的细胞增殖存在明显差异，过表达circ_2157对体外培养条件下的鼻咽癌细胞增殖有促进作用。(结果见图5)

实施例5：体外沉默circ_2157抑制鼻咽癌细胞的增殖

利用hiperfect试剂将sirna和sinc(空白对照)瞬时转染到hone1、hne2和cne2细胞系中沉默circ_2157的表达。转染后继续培养48小时收集细胞，利用实时荧光定量pcr技术检测circ_2157的表达水平以检测sirna的转染效率。结果显示，sirna具有良好的沉默效果。在确保circ_2157被干扰掉后，我们在沉默了circ_2157的鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2中进行mtt实验，验证其对细胞增殖的影响。基于第一至第五天的检测结果，相对于nc组，sirna组细胞的增殖速度明显减慢，即沉默circ_2157抑制鼻咽癌细胞的增殖。通过正反两个方向的验证，我们可以说circ_2157对体外培养条件下的鼻咽癌细胞增殖有促进作用。(结果见图6)

实施例6：细胞划痕愈合迁移实验：

(1)照细胞台：1000μl/10μltip头、高温高压灭菌的d-hank’s，直尺、1000μl/10μl移液枪、marker笔等，用酒精消毒后再放置在超净台内紫外照射30分钟；

(2)待细胞长至50％～70％左右分别转染sirna和nc组或者转染质粒；

(3)待细胞长满平铺板底后第二天开始划痕：将10μl枪头比着直尺垂直于6孔板底部干脆快速进行十字或井字划痕，不要倾斜，力度大小一致，以确保划痕宽带尽可能一样；

(4)吸弃掉培养液，用d-hanks轻轻洗涤3次，尽可能洗掉由于划痕引起的碎片细胞；

(5)加入1％双抗2％胎牛血清的1640培养基；

(6)拍照记录此时的十字旁边划痕宽度，记为0h；

(7)将6孔板放回培养箱培养，间隔12小时取出，拍摄0h时所拍图片的位置，记为12h；

(8)间隔24h时再拍相同位置，直到划痕愈合，整理所有的图片，并进行统计分析。

体外过表达circ_2157促进鼻咽癌细胞的迁移

在确定环状rnacirc_2157对鼻咽癌细胞的增殖能力有促进作用后，我们又在鼻咽癌细胞系中进行了划痕实验，以验证circ_2157对鼻咽癌细胞系的迁移有没有影响。利用脂质体法lipofectamine3000把无内毒素质粒pcdna3.1和pcdna3.1/has_circ_2157过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2，继续培养到48小时后。收集细胞，利用实时荧光定量pcr技术检测circ_2157的表达水平及成环效率。在确定了circ_2157过表达质粒的过表达良好效果后，我们在鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2进行了细胞划痕愈合实验。划痕愈合实验在这些细胞中的多个时间点(hone1为0h、12h、24h；hne2为0h、12h、24h；cne2为0h、12h、24h)均证实：相对于空载pcdna3.1(+)质粒组，pcdna3.1/circ_2157过表达质粒组细胞的迁移能力明显增强。划痕宽度差异较大,且具有统计学意义。以上结果显示,过表达鼻咽癌细胞系中circ_2157的表达,能够促进鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2在体外的迁移能力。(结果见图7，8,9)

体外沉默circ_2157抑制鼻咽癌细胞的迁移

利用hiperfect试剂将sirna和nc瞬时转染到hone1、hne2和cne2细胞系中沉默circ_2157的表达。转染后继续培养48小时收集细胞，利用实时荧光定量pcr技术检测circ_2157的表达水平以检测sirna的转染效率。结果显示，sirna具有良好的沉默效果。在确保circ_2157被干扰掉后，我们在沉默了circ_2157的鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2中进行划痕实验，验证其对细胞迁移的影响。划痕愈合实验在这些细胞中的多个时间点(hone1为0h、12h、24h；hne2为0h、12h、24h；cne2为0h、12h、24h)均证实：相对于nc组，sirna组细胞的迁移能力明显减弱。划痕宽度差异明显,且具有统计学意义。以上结果显示,沉默鼻咽癌细胞系中circ_2157的表达,能够抑制鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2在体外的迁移能力。通过正反两个方向验证证明，circ_2157可以促进鼻咽癌细胞的迁移。(结果见图10,11,12)

实施例7：细胞transwell侵袭实验：

(1)基质胶准备：提前一天把冻存于-20℃的bdmatrigel胶置于4℃冰箱融化成液态，把释胶用的tip头、ep管置于-20℃过夜，这样第二天操作时matrigel胶在铺胶时不会过快凝固；

(2)基质胶稀释：bdmatrigel胶：无血清培基＝1:8，即20μl基质胶加160μl1640培基轻吹混匀；

(3)将稀释好的基质胶加入transwell小室100μl，再沿边吸出80μl，依次铺好放入37℃培养箱里孵育2-3小时，当看到铺胶层为白色时，表明液体matrigel胶已呈固态；

(4)消化转染后的实验细胞，用无血清培基洗2遍，然后使用无血清的培基重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度为每200μl中2,0000个细胞；

(5)向下层小室添加800μl含有20％fbs的1640培养基，放入小室时将24孔板倾斜45°角，以避免放入小室过程中在小室和液面之间产生气泡；

(6)每室加200μl统一计数好的细胞悬液到transwell上室内，将24孔板放回37℃培养箱中，根据细胞状态和细胞侵袭速度，孵育约24～48小时。

(7)取出24孔板，用pbs或者d-hanks洗两遍，4％多聚甲醛浸洗10分钟，用清水洗3遍。

(8)染色：用0.1％的结晶紫滴加到transwell小室的底部，室温安静放置5-10min，用pbs清洗2-3遍，用棉签小心擦掉小室上面的基质胶；

(9)在24孔板中加入蒸馏水800μl，transwell上室中加入蒸馏水约200μl，然后在倒置显微镜下，进行观测，不同视野拍照，用imagej软件进行计数和统计学分析差异的显著性。

体外过表达circ_2157促进鼻咽癌细胞的侵袭

我们在鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2进行了transwell小室基质胶侵袭实验，以观察过表达circ_2157对细胞侵袭能力的影响。我们同样利用脂质体法lipofectamine3000把无内毒素质粒pcdna3.1和pcdna3.1/circ_2157过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2，继续培养到48小时后。收集细胞，利用实时荧光定量pcr技术检测circ_2157的表达水平及成环效率。在确定了circ_2157过表达质粒的过表达良好效果后，我们将细胞接种到铺基质胶的transwell小室中，发现过表达质粒组的细胞侵袭到小室下表面的数目明显比空载组多，且两株细胞系结果的趋势一致。随机拍摄3张照片并记录细胞数目，每一细胞系中两组别数据间均有明显差异，且具有统计学意义。以上结果表明，过表达鼻咽癌细胞系中circ_2157的表达,能够促进鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2在体外的侵袭能力。(结果见图13,14,15)

体外沉默circ_2157的表达影响鼻咽癌的侵袭

为了探究沉默circ_2157后是否能够逆转过表达circ_2157所带来的表型改变,我们又在三株细胞系中进行了transwell小室基质胶侵袭实验，利用hiperfect试剂将circ_2157sirna和nc瞬时转染到hone1、hne2和cne2细胞系中沉默circ_2157的表达。转染后继续培养48小时收集细胞，利用实时荧光定量pcr技术检测circ_2157的表达水平以检测sirna的转染效率。结果显示，circ_2157sirna具有良好的沉默效果。在确保circ_2157被干扰掉后，我们在沉默了circ_2157的鼻咽癌细胞系hone1、hne2和cne2中进行transwell小室基质胶侵袭实验，结果显示，sirna组可在transwell小室下表面观察到的肿瘤细胞数目明显少于nc组，且两株细胞系结果的趋势一致。随机拍摄6张照片并记录细胞数目，每一细胞系中两组别数据间均有明显差异，且具有统计学意义。以上结果表明，沉默鼻咽癌细胞系中circ_2157的表达,能够抑制鼻咽癌细胞hone1、hne2和cne2在体外的侵袭能力。通过正反两个方向证明，环状rnacirc_2157能够促进鼻咽癌细胞的侵袭。(结果见图16,17,18)

序列表

<110>中南大学

<120>circ_2157在制备鼻咽癌治疗制剂中的应用和治疗制剂

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>667

<212>rna

<213>智人(homosapiens)

<400>1

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<210>2

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<211>21

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<213>未知(unknown)

<400>11

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