包含3，4-二咖啡酰奎尼酸的从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的化妆品组合物的制作方法

本发明涉及一种包含3，4-二咖啡酰奎尼酸或其化妆品学上可接受的盐作为有效成分，并且，从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的化妆品组合物、准药物组合物以及皮肤外用制剂组合物。

背景技术：

皮肤是直接暴露于外部环境的身体部分，不仅充当保护人体重要器官的防护膜作用，而且，还充当调节水分蒸发并保护人体免受外部感染的作用。但是，尽管皮肤阻止病毒从外部渗透，但是，过多的紫外线、受污染的环境等来自外部的压力都会导致皮肤刺激，最终导致皮肤老化。

紫外线b(ultravioletb，uvb辐射(radiation)，波长：280-320nm)是对皮肤造成有害作用的主要环境因素之一，例如引起皮肤癌(skincancer)、免疫系统抑制及光老化(photo-aging)。由这种uvb产生的活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)会引起脂质(lipids)、蛋白质(proteins)和dna等细胞成分的氧化损伤(oxidativedamage)，进而促进皮肤老化，引起多种皮肤病变。

所述活性氧是处于不稳定状态的氧，是因环境污染和化学物质、紫外线、血液循环障碍、压力等，产生过量氧而引起的。这样过度产生的活性氧会在人体内一起氧化作用，因此，细胞膜、dna及其他所有细胞结构受损，根据受损范围，细胞会失去功能或变质。另外，在皮肤细胞中，活性氧引发氧化应激，促进皮肤老化。

已提出了许多由活性氧(ros)引起的细胞损伤保护皮肤的抗氧化剂，例如，众所周知，表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate)及白藜芦醇(resveratrol)等可以抑制uvb对皮肤的损伤。另外，周知含有类胡萝卜素(carotenoids)、酚类化合物(phenolics)或抗氧化维生素(antioxidantvitamins)等的化合物的各种海藻类(marinealgae)或海草类(seaweed)也通过生物抗氧化系统及直接清除自由基(freeradicals)缓和皮肤细胞中的氧化应激(oxidativestress)。

另外，近年来因中国的工业化而发生的含重金属等有害物质的微尘、沙尘、烟雾被认为皮肤老化及皮肤问题的主要原因。

微尘是我们的眼睛看不见的微小物质，是直径10μm或更小的颗粒物质，可长时间漂浮或散布在空气中。是在煤、石油等的化石燃料燃烧时或者制造业、汽车的废气中排放，通过支气管被吸附于肺引发各种肺疾病的大气污染物质。据韩国环境部的数据，2017年3月，韩国和国际上使用的对微尘的术语分别不同而令人困惑，因此，将直径10μm或更小的微尘(pm10)定义为浮尘，并将直径2.5μm或更小的超细粉尘(pm2.5)定义为微尘。

微尘、沙尘等污染物质会在皮肤上产生压力，这些压力由活性氧而产生。活性氧充当细胞内信号传导剂作用，在维持正常的细胞功能(例如激活线粒体中的电子载体及蛋白细胞)中发挥重要作用。但是，活性氧不稳定且氧化性高，容易与生物材料发生反应，因此，若不从体内清除，会引起氧化应激。

技术实现要素：

技术问题

于是，本发明的目的在于，开发一种具有从活性氧、紫外线或微尘中保护皮肤的效果的化妆品组合物。

解决问题的方案

本发明的目的在于，提供一种从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的化妆品组合物，其中，包含3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其化妆品学上可接受的盐作为有效成分。

本发明的其他目的在于，提供一种用于从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的准药物组合物，其中，包含3，4-二咖啡酰奎尼酸或其生理学上可接受的盐作为有效成分。

本发明的其他另一目的在于，提供一种用于从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的皮肤外用制剂组合物，其中，包含3，4-二咖啡酰奎尼酸或其生理学上可接受的盐作为有效成分。

本发明的其他另一目的在于，提供一种用于制备从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的化妆品组合物的3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其化妆品学上可接受的盐的用途。

本发明的其他另一目的在于，提供一种用于制备从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的准药物组合物的3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其生理学上可接受的盐的用途。

本发明的其他另一目的在于，提供一种用于制备从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的皮肤外用制剂组合物的3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其生理学上可接受的盐的用途。

本发明的其他另一目的在于，提供一种从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的方法，其中，包括向个体给药3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其生理学上可接受的盐的步骤。

发明的效果

本发明涉及一种从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的化妆品组合物，所述组合物包含3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其化妆品学上可接受的盐作为有效成分，可以利用从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的化妆品组合物。

附图说明

图1至图6示出dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)对细胞毒性和ros清除的作用。(图1)将细胞用1μm、2.5μm、5μm、10μm和20μm的dqa(3，4-二咖啡酰奎宁酸)处理24小时。使用细胞存活率分析(mtt)法判断细胞存活率。*表示与未处理细胞有显著差异(p<0.05)。(图2)用1μm、2.5μm、5μm、10μm和20μm的dqa(3，4-二咖啡酰酰基奎尼酸)预处理细胞。30分钟后，将1mm的h2o2或30mj/cm²的uvb施加到板上。30分钟后，用dcf-da处理后通过荧光光谱仪检测所产生的细胞内ros。抗氧化剂nac用于阳性对照组。*表示与h2o2处理细胞有显著差异(p<0.05)。#表示与uvb处理细胞有显著差异(p<0.05)。(图3)通过增强型镜面反射(esr)光谱仪检测由超氧阴离子和dmpo产生的dmpo-·ooh。*表示与对照组有显著差异(p<0.05)。#表示与超氧阴离子有显著差异(p<0.05)。(图4)通过esr光谱仪检测由羟基自由基和dmpo产生的dmpo-·oh。*表示与对照组有显著差异(p<0.05)。#表示与羟基自由基有显著差异(p<0.05)。(图5)在dcf-da染色后，用共焦显微镜检测所生成的细胞内ros，(图6)dcf-da处理后用荧光光谱仪进行检测。*表示与对照组细胞有显著差异(p<0.05)，#表示与uvb处理细胞有显著差异(p<0.05)。

图7及图8示出dqa(3，4-二咖啡酰基奎宁酸)对由uvb诱导的脂质过氧化和dna损伤的作用。(图7)在dppp染色后用共焦显微镜检测脂质过氧化。*表示与对照组细胞有显著差异(p<0.05)，#表示与uvb处理细胞有显著差异(p<0.05)。(图8)获取代表图，并通过comet分析判断dna破坏程度。*表示与对照组细胞有显著差异(p<0.05)，#表示与uvb处理细胞有显著差异(p<0.05)。

图9及图10示出对dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)的细胞凋亡的效果。(图9)通过mtt分析判断细胞存活率。*表示与未处理细胞有显著差异(p<0.05)，#表示与uvb处理细胞有显著差异(p<0.05)。(图10)在hoechst33342染色后，用荧光显微镜观察凋亡小体的形成。凋亡小体用箭头表示。(图11)用jc-1染色细胞后，通过流式细胞分析评估线粒体膜电位。*表示与对照组细胞有显著差异(p<0.05)，#表示与uvb处理细胞有显著差异(p<0.05))。

图12及图13表示dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)对微尘(pm，particulatematter)及由uvb诱导的ros和细胞凋亡的影响。(图12)在dcf-da染色后用共焦显微镜检测所生成的细胞内ros。(图13)在hoechst33342染色后，用荧光显微镜观察凋亡小体。凋亡小体用箭头表示。

具体实施方式

下面，作为用于达成本发明的目的的一实施方式，本发明提供一种从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的化妆品组合物，所述组合物包含3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其化妆品学上可接受的盐作为有效成分。

本发明的所述化妆品组合物，作为有效成分包含3，4-二咖啡酰奎尼酸或其化妆品学上可接受的盐。

包含所述3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)的化妆品组合物具有从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的效果。

本发明中，“3，4-二咖啡酰奎尼酸”的化学式为如下。

[化学式1]

在本发明的一实施方式中，在用人类角质形成细胞细胞株(humankeratinocytecellline，hacat)的实验中，确认3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid，dqa)没有细胞毒性，确认对由过氧化氢(h2o2)诱导的细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)和超氧阴离子和羟基自由基等的活性氧的清除效果，可以用作从活性氧保护皮肤的化妆品组合物的有效成分。

另外，本发明中，所述活性氧可以为选自由过氧化氢(h2o2)、超氧阴离子(superoxideanion)、羟基自由基(hydroxylradical)组成的组中的一种以上。

另外，在本发明的一实施例中确认了3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid，dqa)具有对由uvb诱导的细胞内活性氧(ros)的清除效果，并确认了显著降低因uvb刺激而增加的dna损伤以及脂质过氧化。

此外，确认了通过减少因uvb照射而在hacat细胞中增加的凋亡小体(apoptoticbody)，从而具有对由uvb诱导的细胞凋亡的保护作用。

因此，所述3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-dicaffeoylquinicacid，dqa)可以用作从紫外线保护皮肤的化妆品组合物的有效成分。

本发明中所述紫外线可以为紫外线b(ultraviolet-b，uvb)。

另外，在本发明中，所述3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-dicaffeoylquinicacid，dqa)通过对因紫外线b而产生的活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)的清除作用可以表现出皮肤保护活性。

另外，在本发明中，所述3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-dicaffeoylquinicacid，dqa)通过减少由紫外线b引起的细胞内脂质过氧化或dna损伤的作用，可以表现出皮肤保护活性。

另外，在本发明的一实施例中确认了3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-dicaffeoylquinicacid，dqa)抑制在人类角质形成细胞细胞株中因uvb或uvb和微尘(pm，particulatematte)处理而引发的ros和凋亡小体，并确认了从紫外线及微尘保护皮肤的效果。因此，将所述3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-dicaffeoylquinicacid，dqa)可以用作从紫外线或微尘保护皮肤的化妆品组合物的有效成分。

另外，在本发明中，所述3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-dicaffeoylquinicacid，dqa)通过抑制暴露于紫外线b或微尘的细胞的凋亡小体(apoptosis)的作用，可以表现出皮肤保护活性。

作为本发明的化妆品组合物的有效成分，可以使用3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-dicaffeoylquinicacid，dqa)或其化妆品学上可接受的盐形态。作为盐由化妆品学上可接受的游离酸(freeacid)形成的酸加成盐有用。酸加成盐可以通过常规方法，例如将化合物溶解在过量的酸水溶液中，并利用水混溶性有机溶剂，例如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈使所得的盐沉淀而制备。可以加热相同摩尔量的化合物和酸水溶液或醇(例如，乙二醇单甲醚)，然后将混合物蒸发干燥或将沉淀的盐抽滤。此时，作为游离酸可以使用有机酸及无机酸，并且，作为无机酸可以使用盐酸、磷酸、硫酸、硝酸、酒石酸等，作为有机酸可以使用甲基磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、酒石酸、富马酸(fumaricacid)、扁桃酸、丙酸(propionicacid)、柠檬酸(citricacid)、乳酸(lacticacid)、乙醇酸(glycollicacid)、葡糖酸(gluconicacid)、半乳糖醛酸、谷氨酸、戊二酸(glutaricacid)、葡萄糖醛酸(glucuronicacid)、天冬氨酸、抗坏血酸、碳酸、香草酸、氢碘酸等，但不限于此。

并且，还可以利用碱制备化妆品学上可接受的金属盐。碱金属或碱土金属盐，例如通过将化合物溶解于过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中，过滤未溶解化合物盐，然后进行蒸发并干燥而获得。并且，与其对应的银盐可以通过使碱金属或碱土金属盐与合适的银盐(例如硝酸银)反应而得到。

本发明的从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的化妆品组合物，相对于组合物的总重量可包含0.001重量百分比至100重量百分比的3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其化妆品学上可接受的盐，具体而言，可包含0.01重量百分比至50重量百分比的3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其化妆品学上可接受的盐，但不限于此。

另外，本发明的化妆品组合物除所述有效成分以外还可以包括常规可接受的成分，但不限于此，例如，可包含抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料及香料等常规助剂以及载体。

根据本发明的化妆品组合物可以制备成选自由溶液、外用软膏、霜、泡沫、营养水、柔软性化妆水、面膜、柔软水、乳液、隔离霜、精华液、肥皂、液体清洁剂、入浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶剂、润肤液、粉剂、皂剂、含表面活性剂的洗面奶、油、粉状粉底、乳浊液粉底、蜡状粉底、贴剂及喷剂组成的组中的一种以上剂型，但不限于此。

并且，本发明的化妆品组合物可以进一步包含一种以上配制在一般皮肤化妆品中的化妆品学上可接受的载体，作为常规成分，例如可适当配合油、水、表面活性剂、保湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、着色剂、防腐剂、香料等，但不限于此。本发明的化妆品组合物中包含的化妆品学上可接受的载体根据剂型有很多种。

当本发明的剂型为软膏、糊剂、霜或凝胶剂的情况下，作为载体成分可以利用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌或这些混合物。

本发明的剂型为粉末或喷剂的情况下，作为载体成分可以利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末或这些的混合物，尤其在喷剂的情况下，可进一步包含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲基醚等促进剂。

本发明的剂型为溶液或乳浊液的情况下，作为载体成分利用溶剂、增溶剂或乳化剂，例如，可以利用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油，尤其可以利用棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或山梨聚糖的脂肪酸酯。

本发明的剂型为悬浊液的情况下，作为载体成分可以利用水、乙醇或丙二醇等液态稀释剂；乙氧基异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯失水山梨醇酯等悬浊剂；微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等。

本发明的剂型为肥皂的情况下，作为载体成分可以利用脂肪酸的碱金属盐、脂肪酸半酯盐、脂肪酸蛋白水解物、羟乙磺酸盐、羊毛脂衍生物、脂族醇、植物油、甘油、糖等。

本发明的剂型为含表面活性剂的清洁剂的情况下，作为载体成分可以利用脂族醇硫酸盐、脂族醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙磺酸盐、咪唑啉鎓衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。

作为其他的实施方式，本发明提供一种用于从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的准药物组合物，其中，包含3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其生理学上可接受的盐作为有效成分。

所述3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的内容如上所叙述。

本发明的术语“生理学上可接受的”是指生理学上可接受的，并且向生物体给药时，通常不会引起胃肠障碍、头晕等过敏反应或类似反应，并且，所用的化合物为能发挥所期望的效果的通常使用的。

本发明中使用的术语“准药物”是指在诊断、治疗、改善、减轻、治疗或预防人或动物疾病的目的使用的物品中其作用比医药品微弱的药物，例如，根据药事法，所谓准药物是除用于医药品的用途的物品，包含用于治疗或预防人和动物的疾病的纤维、橡胶产品、对人体的作用轻微或不直接作用，不是器具或机械或类似者，用于防止传染病的杀菌、杀虫剂等。

本发明的准药物组合物的种类或剂型没有特别限制，优选地，可为消毒清洁剂、淋浴泡沫、漱口水、湿巾、洗衣肥皂、洗手液、加湿器填充剂、口罩、软膏或过滤器填充剂等。

将本发明的组合物以从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的目的包含在准药物时，所述组合物可以原样使用或与其他准药物成分一起使用，并且，可以根据常规方法适当地使用。有效成分的混合量可以根据使用目的适当确定，本发明的准药物组合物，相对于组合物的总重量，可以包含0.01重量百分比至20重量百分比的所述3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其生理学上可接受的盐。

作为其他另一实施方式，本发明提供一种用于从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的皮肤外用制剂组合物，其中，包含3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其生理学上可接受的盐作为有效成分。

所述3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)、从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤、生理学上可接受的盐如上所叙述。

根据本发明的皮肤外用制剂组合物，例如，可例举软膏、护肤液、增溶剂、悬浮液、乳液、霜、凝胶、喷剂、粉扑、凝固剂、贴剂或止痛药水等，但不限于此，还可以配合于本领域公知的任何机制。根据本发明的皮肤外用制剂组合物，相对于组合物的总重量，可以包含0.01重量百分比至20重量百分比的所述3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其生理学上可接受的盐。

作为其他另一实施方式，本发明提供一种用于制备从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的化妆品组合物的3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其化妆品学上可接受的盐的用途。

作为其他另一实施方式，本发明提供一种用于制备从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的准药物组合物的3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其生理学上可接受的盐的用途。

作为其他另一实施方式，本发明提供一种用于制备从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的皮肤外用制剂组合物的3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其生理学上可接受的盐的用途。

本发明中，对术语“3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinic”、“生理学上可接受的盐”、“化妆品学上可接受的盐”、“活性氧”、“紫外线”、“微尘”、“化妆品组合物”、“准药物组合物”、“皮肤外用制剂组合物”、“皮肤保护”的说明为如上所叙述。

作为其他另一实施方式，本发明提供一种从活性氧、紫外线或微尘保护皮肤的方法，其中，包括向个体给药3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其生理学上可接受的盐的步骤。

本发明中，对术语“3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinic)、“生理学上可接受的盐”、“活性氧”、“紫外线”、“微尘”、“皮肤保护”的说明为如上所叙述。

给予本发明的所述组合物的个体为包括人类的所有哺乳动物，可以举牛、猪、马、兔子、鼠、人。

利用本发明的3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其生理学上可接受的盐的皮肤保护方法，可以向个体或个体的皮肤给予3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其生理学上可接受的盐。

本发明中术语“给药”是指通过任何适当的方法引进本发明的3，4-二咖啡酰奎尼酸(3，4-dicaffeoylquinicacid)或其生理学上可接受的盐，本发明的所述化合物和盐的给药途径没有特别限制，可以通过多种途径给药以达到所目的的皮肤组织。

实施方式

下面，参考附图详细说明本发明的实施例以使本发明所属领域的技术人员能容易实施。但是，本发明可由各种不同的形态体现，不限于此处说明的实施例。

a.材料及方法

实施例1.细胞培养及uvb照射(uvbirradiation)

将人角质形成细胞株(humankeratinocytecellline，hacat)在含有5％的二氧化碳的培养基中保持在37℃。细胞在含有10％的胎牛血清、1％的青霉素和1％的链霉素的dmem培养基中成长。将细胞暴露于30mj/cm²的uvb(cl-1000muv交联仪，美国加利福尼亚州的阿普兰)。

实施例2.细胞存活率(cellviability)

通过以下方法评价dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)对hacat细胞的存活率引起的影响。将细胞以0.8×10⁵cells/ml的密度接种到24孔板中，在24小时后处理1、2.5、5、10、20μm的dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)。将mtt原液(stocksolution，储备溶液)(50μl，2mg/ml)分别添加到每个孔板中，以使总反应体积达到500μl。4小时后，吸出(aspirated)上清液。将每个孔中的甲簪晶体溶解至二甲基亚砜(dmso)中，通过扫描多孔分光光度计(scanningmulti-wellspectrophotometer)读取在540nm的吸光度。

实施例3.检测超氧阴离子(superoxideanion)

使由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系产生的超氧阴离子与dmpo反应，将其结果形成的dmpo/-oh加成产物使用esr光谱仪进行检测。将磷酸盐缓冲液(ph7.4)与分别0.02ml的3mdmpo，5mm黄嘌呤、0.25u黄嘌呤氧化酶及10μmdqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)混合，在2.5分钟后记录esr光谱。esr光谱仪的参数设置为如下：中心磁场，336.8mt；功率，5.00mw；频率，9.4380ghz；调制宽度(modulationwidth)，0.2mt；振幅(amplitude)，1000；扫描宽度(sweepwidth)，10mt；扫描时间(sweeptime)，0.5分钟；时间常数(timeconstant)，0.03秒；及温度，25℃。

实施例4.检测羟基自由基

将通过芬顿(fenton)反应(h2o2+feso4)生成的羟基自由基与dmpo反应。将其结果形成的dmpo/-oh加成产物使用esr光谱仪进行检测。将磷酸盐缓冲液(ph7.4)与分别0.02ml的0.3mdmpo，10mmfeso4、10mmh2o2及10μmdqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)混合，在2.5分钟后记录esr光谱。esr光谱仪的参数设置为如下：中心磁场，336.8mt；功率，1.00mw；频率，9.4380ghz；调制宽度(modulationwidth)，0.2mt；振幅(amplitude)，600；扫描宽度(sweepwidth)，10mt；扫描时间(sweeptime)，0.5分钟；时间常数(timeconstant)，0.03秒；及温度，25℃。

实施例5.测量细胞内ros

为了在经h2o2或uvb处理的hacat细胞中检测活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)，将细胞以1.0×10⁵cells/ml的密度接种到孔板上，20小时后处理10μm的dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)。在37℃的温度下培养1小时后，将细胞暴露于h2o2(1μm)或pm(微尘，particulatematter)2.5(50ppm)及/或uvb(30mj/cm²)。uvb源(source)为cl-1000muv交联仪(uvp，upland，ca，usa)。在37℃的温度下培养30分钟后添加了dcf-da溶液(50μm)。然后，利用ls-5b分光荧光系(perkinelmer，waltham，ma，usa)检测并定量2’，7’-二氯荧光素荧光(dichlorofluoresceinfluorescence)。利用perkinelmerls-5b分光荧光计检测dcf-da荧光(激发，485nm，辐射(emission)，535nm)，利用共焦显微镜收集图像。

实施例6.脂质过氧化分析

将dppp使用探针评价脂质过氧化。dppp与脂质氢过氧化物反应生成荧光物质的dppp氧化物，提供膜损坏的症候。将细胞用10μm的dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)处理24小时后，与20μm的dppp一起在黑暗中培养30分钟。用zeissaxiovert200倒置显微镜在351nm的激发波长和380nm的发射波长下获得dppp荧光图像。利用共焦显微镜收集图像。

实施例7.单细胞凝胶电泳(comet分析)

通过comet分析评价氧化性dna损伤度。将细胞悬浮液在37℃的温度下与70μl的1％低熔点琼脂糖(lma)混合，并将混合物铺(spreading)在预涂布200μl的1％正常熔点琼脂糖(nma)的完全冷冻的显微镜载玻片上。琼脂糖固化后，用170μl的其他0.5％lma覆盖载玻片，然后，用溶解溶液(2.5mnacl，100mmna-edta，10mmtris，1％tritonx-100和10％dmso，ph10)在4℃的温度下浸泡1小时。接着，将载玻片放置于含有300mmnaoh和10mmna-edta(ph10)的凝胶电泳装置中，培养30分钟后诱导dna解旋(unwinding)和碱不稳定损伤(alkali-labiledamage)的表达。然后，在25℃的温度下施加电场(300ma，25v)30分钟，向阳极吸引带负电荷的dna。将载玻片在中性缓冲液(0.4mtris，ph7.5)中在25℃的温度下10分钟内洗涤3次后，在25℃的温度下用100％乙醇洗涤1次10分钟。然后，用80μl的10μg/ml溴乙锭对玻片染色，并使用荧光显微镜和图像分析仪(komet5.5，kineticimagingltd，wirral，uk)进行观察。记录在每个载玻片50个细胞的尾巴长度和comet尾巴中总荧光百分比。

实施例8.利用hoechst33342的核染色

将细胞用10μmdqa(3，4-二咖啡酰基奎尼酸)处理，1小时后用pm(particulatematter)2.5(50ppm)及/或uvb(30mj/cm²)处理。在37℃的温度下培养24小时后，将dna特异性荧光染料hoechst33342(1μl的20mm原液)添加到每个孔中，并将细胞在37℃的温度下培养10分钟。用装有coolsnap-pro彩色数码相机的荧光显微镜将经染色的细胞可视化。评价核凝缩度，并测量凋亡细胞的数量。

实施例9.线粒体膜电位分析

将细胞以1×10⁵cells/ml的密度接种到6孔板中。铺板16小时后，将细胞用10μm的dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)处理，并在37℃的温度下进一步培养24小时。利用进入线粒体的亲脂性阳离子荧光染料jc-1分析线粒体膜电位，随着膜电位的增加，荧光从绿色变为红色。通过流式细胞分析分析线粒体膜电位。

统计分析

所有测量均进行3次，所有值均用平均值±标准误差表示。其结果，在分散分析后执行tukey实验分析了平均之差。在所有情况下，小于0.05的p值被认为统计学上有意义的。

b.实验结果

实验例1.dqa对细胞毒性与ros清除的影响

dqa(3，4-二咖啡酰基奎宁酸)在最多20μm时无细胞毒性(图1)。dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)对由h2o2诱导的细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)的清除效果在1-20μm的浓度范围内呈浓度依赖性增加。另外，dqa(3，4-二咖啡酰基奎宁酸)具有对由uvb诱导的细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)的清除效果(图2)。因此，在所有后续实验中，决定使用10μm的dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)。这是因为dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)在10μm和20μm下显示出相似的清除效果和细胞毒性。

接着，利用esr光谱仪测量dqa(3，4-二咖啡酰奎宁酸)对超氧阴离子和羟基自由基的清除能力。在超氧阴离子信号(signal)中不存在dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)的情况下出现1922信号，存在dqa(3，4-二咖啡酰酰奎尼酸)的情况下出现1390信号(图3)。并且，当羟基自由基信号中没有dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)的情况下出现3375信号，存在dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)的情况下出现2278信号(图4)。由此可知dqa(3，4-二咖啡酰奎宁酸)具有超氧阴离子和羟基自由基的清除效果。

dcf-da染色后，利用共焦显微镜和荧光分光计检测uvb诱导的细胞内ros生成(图5及图6)。其结果，确认了通过dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)清除了uvb诱导的细胞内ros。

总之，dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)没有细胞毒性，具有对由h2o2诱导的细胞内ros、由uvb诱导的细胞内ros的清除作用，并确认了对超氧阴离子和羟基自由基的清除能力。

实验例2.dqa对由uvb诱导的脂质过氧化和dna损伤的影响

uvb辐射引发脂质过氧化和细胞损伤。首先，在dppp处理后，使用共焦显微镜在hacat细胞中检测到脂质过氧化。图7示出在uvb处理的细胞中产生了uvb诱导的脂质过氧化，而在dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)预处理的细胞中降低了由uvb诱导的脂质过氧化。然后，通过comet分析确认了dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)是否减少了由uvb诱导的dna损伤。结果确认了通过uvb刺激增加了dna分解的数量，dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)显着降低了dna分解的数量(图8)。由此可知dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)抑制由uvb诱导的脂质过氧化，并抑制dna损伤。

实验例3.dqa对细胞凋亡的效果

uvb辐射在hacat细胞中引发细胞凋亡。图9示出dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)对由uvb诱导的细胞凋亡的影响(图9)。在hacat细胞中通过uvb照射确认了凋亡小体。dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)显著减少了由uvb照射诱导的凋亡小体(图10)。

细胞凋亡导致线粒体膜电位的变化。因此，通过荧光染料jc-1染色来检测线粒体膜电位。其结果，被照射uvb的细胞比对照组细胞更增加了荧光性。但是，dqa(3，4-二咖啡酰基奎宁酸)比uvb照射的细胞减少了荧光(图11)。

总之，可知dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)对由uvb诱导的细胞凋亡具有保护作用。

实验例4.dqa对pm及uvb诱导ros及细胞凋亡的影响

微尘(pm，particulatematter)和uvb的组合会诱导细胞内ros和细胞损伤。因此，在经处理的pm2.5和uvb下照射ros水平和凋亡小体。图12和13表示与uvb一起处理pm2.5的组与单独处理uvb的组相比产生更多的ros和凋亡小体。另外，确认了dqa(3，4-二咖啡酰基奎宁酸)在与uvb一起处理pm2.5的组和单独处理uvb的组显著减少细胞内ros水平和凋亡小体。

由此可知，dqa(3，4-二咖啡酰奎尼酸)抑制在人角质形成细胞系中通过uvb或uvb和微尘(pm，particulatematter)处理诱导的ros和凋亡小体，具有从紫外线及微尘保护皮肤的效果。

以上，虽详细说明了本发明的优选实施例，但是，本发明的权利范围不限定于此，本发明所属领域的技术人员利用发明要求保护范围所定义的本发明的基本概念执行的各种变形及改良形态也应属于本发明的权利范围。