用于药物递送的组合物和方法与流程
背景技术：
中枢神经系统(centralnervoussystem,cns)相关疾病及功能障碍已成为全球人类死亡的主要原因之一。血脑屏障(blood-brainbarrier，bbb)是血液与脑组织间的屏障，可限制物质在血液和脑组织之间的自由交换，防止有害物质进入脑组织，对脑、脊髓等中枢神经系统起到保护作用(banks,w.a.,nat.rev.drug.discov.15,275-292(2016)；abot,n.j.,ronback,l.&hanson,e.,nat.rev.neurosci.7,41-53(2006))。然而，血脑屏障的存在也阻碍了针对中枢神经系统治疗药物的发展。虽然一些小分子可以利用细胞间亲水性转运途径和跨细胞亲脂性转运途径，以及转运蛋白来实现跨越血脑屏障，但对于生物大分子跨越血脑屏障通常依赖于受体介导或自适性胞吞转运作用。受体介导胞吞转运途径常受限于特殊的内源性分子，而自适转运途径往往运输效率较差。
目前，已有多种策略用来增强跨越血脑屏障的能力，主要包括(1)提高治疗药物的循环时间；(2)通过化学修饰使治疗药物实现吸附性胞吞转运；(3)共轭连接多肽分子或拟肽单克隆抗体(mab)来诱导实现受体介导的胞吞转运；(4)利用“trojanhorse”载体来输运治疗性抗体；(5)利用转运免疫细胞来递送治疗药物；(6)利用物理方法如超声波来打开血脑屏障的紧密通道。但是，已报道的这些方法由于其自身的限制，跨越血脑屏障和药物递送效率仍然很低。为此，开发有效的分子输运策略，实现跨越血脑屏障是治疗中枢系统疾病的亟需解决的关键问题之一。
技术实现要素：
定义一，本发明提供一类聚合物纳米粒子，其包含交联聚合物基质，多种生物活性的药物，以及多种可以增加血脑屏障通透性的功能基团的聚合物纳米材料。具体而言，所述共聚物包含聚合物单体，并且与每个药物单体缔合的基团以非共价键联方式与药物相缔合。
定义二，本发明提供一类聚合物纳米粒子，其包含交联聚合物，共价偶联到聚合物上多种生物活性的药物，以及多种与聚合物偶联的增加血脑屏障通透性的功能基团。
定义三，本发明提供聚合物生物活性药物共聚体，其包含一个生物活性药物，多种与生物活性药物共价偶联的聚合物，以及多种与聚合物偶联的增加血脑屏障通透性的功能基团。
发明内容具体描述
已知某些分子可以快速地跨越血脑屏障进入脑组织，例如尼古丁(nicotine)，乙酰胆碱(acetylcholine)，哌替啶(meperidine)，吗啡(morphine)，以及可卡因(cocaine)等。胆碱(choline)，乙酰胆碱(acetylcholine)以及其类似物可以通过多种通路穿越血脑屏障，例如胆碱转运蛋白(cht)和烟碱乙酰胆碱受体(nachr).(lloyd,g.k.&wiliams,jpharmacolexpther292,461-467(2000))2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine,mpc)及其聚合物，聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(poly(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine),pmpc)具有与胆碱和乙酰胆碱类似的结构特征，可以与胆碱转运蛋白(cht)和烟碱乙酰胆碱受体(nachr)相互作用。因此，类似于胆碱进入脑组织的方式，通过胆碱转运蛋白(cht)有利于2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(mpc)和聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(pmpc)跨越血脑屏障进入脑组织。同样地，通过烟碱乙酰胆碱受体(nachr)介导胞吞转运机制也有利于2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(mpc)和聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(pmpc)跨越血脑屏障。
基于以上设计原则，一类新型包含胆碱(choline)、乙酰胆碱(acetylcholine)以及其结构类似基团的聚合物可以通过快速通路跨越血脑屏障，有效递送到中枢神经系统。因此，利用这些聚合物可以开发出两种药物递送系统，跨血脑屏障纳米粒子(bbb-penetrativenanoparticles)和跨血脑屏障聚合物-生物活性共轭物(bbb-penetrativepolymer-bioactiveagentconjugates)。
通过一薄壳层含有胆碱和乙酰胆碱类似结构的聚合物包覆就可以有效的将具有蛋白质药物和基因药物递送到中枢神经系统。多种交联剂可以用来形成聚合物壳层，例如n，n'-亚甲基双丙烯酰胺(n,n'-methylenebisacrylamide，bis)，双[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]磷酸酯(bis[2-(methacryloyloxy)ethyl]phosphate，bmep)，甘油二甲基丙烯酸酯(glyceroldimethacrylate，gdma)，聚丙交酯类嵌段共聚物(polylactide-basedblockcopolymers)以及双丙烯酸酯化类多肽(bisacrylatedpeptides)。在某些实施中，交联基团是可以降解的。交联基团可以通过水解反应，肿瘤特异性蛋白酶或基质金属蛋白酶等实现降解。采用可降解的交联基团制备的纳米粒子，可以通过聚合物壳层的降解有效释放包覆的蛋白质。因此，通过引入可降解的交联基团，就可以实现蛋白质药物跨越血脑屏障，并在中枢神经系统有效释放。
跨血脑屏障聚合物-生物活性共轭物(bbb-penetrativepolymer-bioactiveagentconjugates)可以将含有胆碱转运蛋白(cht)和烟碱乙酰胆碱受体(nachr)配体的聚合物与治疗药物(蛋白质，基因等)进行共轭偶联而得到。通过功能化反应单元，控制聚合物的分子量和链结构，可以有效地与蛋白质药物进行共轭偶联。
聚合物纳米粒子
本发明提供一类聚合物纳米粒子，其包含交联聚合物基质，多种生物活性的药物，以及多种可以增加血脑屏障通透性的功能基团的聚合物纳米材料。具体而言，所述共聚物包含聚合物单体，并且与每个药物单体缔合的基团以非共价键联方式与药物相缔合。
在某些实施例中，聚合物为一类共聚物，包含功能单体和偶联到每个功能单体的交联剂单体。在某些实施例中，生物活性药物并不与聚合物偶联。在某些实施例中，共聚物还包含稳定化单体。在某些实施例中，共聚物包含药物单体，并且每个药物单体包含与药物关联(非共价)的药物关联基团。
定义二，本发明提供一类聚合物纳米粒子，其包含交联聚合物，共价偶联到聚合物上多种生物活性的药物，以及多种与聚合物偶联的增加血脑屏障通透性的功能基团。
在某些实施例中，共聚物包含功能单体和偶联到每个功能单体的交联剂单体。在其他实施例中，共聚物包含功能单体，亲水单体和偶联到每个亲水单体的交联单体。在某些实施例中，聚合物包含药物单体，并且偶联到生物活性药物。在其他实施例中，共聚物包含药物单体，并且每个药物单体包含与药物关联(非共价)的药物关联基团。在某些实施例中，共聚物还包含稳定化单体。
药物关联基团的筛选主要依赖于可以在特定条件下进行与药物可以发生聚合。例如，如果药物表面具有负电基团，那么含有正电荷的药物关联基团(例如，氨基在水溶液中可以质子化形成氨盐离子)可以在中性水溶液条件下与药物单体形成复合体。同样地，对于一个带有正电荷基团或者表面的药物，那么含有负电荷的基团(例如，羧酸(carboxylicacids)、磺酸(surfonicacids)以及磷酸(phosphonicacids)在水溶液中可以去质子化形成阴离子)可以在中性水溶液条件下与药物单体形成复合体。对于非极性的药物，疏水的药物关联基团(例如，疏水烷基、芳基以及芳烷基)可以在水溶液中与药物单体形成复合体。
而且，无论生物活性药物在纳米粒子的内部或者表面都可以通过水解酸降解、酶水解酯酶或者肽酶酶解蛋白酶作用降解聚合物纳米粒子，从而实现完全的释放。
更为重要的是，通过选择和设计一种适当的聚合物，可以实现特异性靶向递送生物活性药物(例如，通过在聚合物纳米粒子上共轭偶联功能基团)。
在某些实施例中，聚合物纳米粒子的尺寸为10nm-20nm,20-25nm,25nm-30nm,30nm-35nm,35nm-40nm,40nm-45nm,45nm-50nm,50nm-55nm,55nm-60nm,60nm-65nm,70-75nm,75nm-80nm,80nm-85nm,85nm-90nm,90nm-95nm,95nm-100nm,或者100nm-110nm。在某些实施例中，聚合物纳米粒子的尺寸约为10nm,11nm,12nm,13nm,14nm,15nm,16nm,17nm,18nm,19nm,20nm,21nm,22nm,23nm,24nm,25nm,26nm,27nm,28nm,29nm,30nm,31nm,32nm,33nm,34nm,35nm,36nm,37nm,38nm,39nm,40nm,41nm,42nm,43nm,4nm,45nm,46nm,47nm,48nm,49nm,50nm,51nm,52nm,53nm,54nm,55nm,56nm,57nm,58nm,59nm,60nm,61nm,62nm,63nm,64nm,65nm,66nm,67nm,68nm,69nm,70nm,71nm,72nm,73nm,74nm,75nm,76nm,77nm,78nm,79nm,80nm,81nm,82nm,83nm,84nm,85nm,86nm,87nm,88nm,89nm,90nm,91nm,92nm,93nm,94nm,95nm,96nm,97nm,98nm,99nm,100nm,101nm,102nm,103nm,104nm,105nm,106nm,107nm,108nm,109nm,110nm,111nm,112nm,113nm,114nm,115nm,116nm,117nm,118nm,119nm,120nm,120nm-130nm,130nm-140nm,140nm-150nm,150nm-160nm,160nm-170nm,170nm-180nm,180nm-190nm,190nm-200nm,200nm-210nm,220nm-230nm,230nm-240nm,240nm-250nm,或者大于250nm。在某些优选的实施例中，纳米粒子的尺寸大约为5-20nm。
在某些实施例中，聚合物纳米粒子的交联度为10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。
在某些实施例中，聚合物的拓扑形貌为线形、树枝状、星形或者多枝状。
在某些实施例中，所涉及的聚合物纳米粒子具有非靶向性和靶向能力、高效率、和/或低免疫原性。例如，高效率可以导致增加摄取能力和更直接的递送。
在某些实施例中，聚合物纳米粒子的降解时间可以设计为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1星期、2星期、3星期、1个月或者任意组合时间。在某些实施例中，聚合物纳米粒子被设计为在生理ph值条件下任意时间内降解。在某些实施例中，聚合物纳米粒子被设计为在给药到治疗对象后的任意时间内降解。一般地，降解率随交联百分比增加而增加，随交联百分比降低而降低。在其他实施例中，降解率随交联百分比增加而增加。最终，可以通过调控多种交联百分比来获得理想的降解特性。
利用聚合物纳米粒子包覆或排布在聚合物纳米粒子表面可以增强生物活性药物稳定性，可确保其在到达目标位置之前能够在人体内长时间循环。总体而言，所描述的生物活性药物的递送策略可以提供显著的效率、增强稳定性和最小的毒性。
生物活性药物
在某些实施例中，药物单体是通过桥连基团与生物活性药物偶联。在某些实施例中，桥连基团为烷基链、杂烷基链或烯基链。在某些实施例中，桥连基团包含多种桥连单体。在某些实施例中，桥连单体分别选择n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(n,n'-methylenebis(acrylamide),mbaa)和双[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]磷酸酯(bis[2-(methacryloyloxy)ethyl]phosphate,bmep)。
在某些实施例中，桥连基团是可降解的。在某些实施例中，可降解的桥连基团包含一个可剪切的酯键或肽键。在某些实施例中，可降解的桥连基团包含多种可降解桥梁基团单体。在某些实施例中，可降解桥梁基团单体可以选择二甲基丙烯酸甘油酯(glyceroldimethacrylate)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethyleneglycoldimethacrylate)和2,2-二(氨基乙氧基)丙烷(2,2-bis(aminoethoxy)propane)单体。
在某些实施例中，桥连基团可以通过蛋白酶，酯酶，酸，纤溶酶，胶原蛋白酶和基质金属蛋白酶来降解。
在某些实施例中，生物活性药物可以是小分子、蛋白质、多核苷酸和成像剂。在某些实施例中，生物活性药物可以选择蛋白质、多核苷酸和成像剂。
在某些实施例中，生物活性药物为小分子，例如carmustine,lomustine,everolimus,temozolomide,paclitaxel,docetaxel,pemetrexedcisplatin,carboplatin,doxorubicin,cyclophosphamide,teniposide,mitomycin,irinotecan,vinorelbine,etoposide,ifosfamide,fluorouracil,prednisone,epirubicin,capecitabine,gemcitabine,ixabepilone,eribulin,pemetrexed,erlotinib,gefitinib,afatinib,crizotinib,ceritinib,alectinib,brigatinib,osimertinib,dabrafenib,tremetinib,sorafenib,sunitinib,temsirolimus,pazopanib,axitinib,cabozantinib,lenvatinib,leucovorin,oxaliplatin,irinotecan,regorafenib,trifluridine,tipiracil,cefaclor,cefradine,cefazolin,lincomycin,erythromycin,imipenem/cilastatin,oxacilin,cloxacilin,mecilinam,cefalexin,demeclocycline,doxycycline,minocycline,oxytetracycline,tetracycline,colistin,teicoplanin,gentamicin,kanamycin,neomycin,netilmicin,paromomycin,streptomycin,tobramycin,abacavir,didanosine,emtricitabine,lamivudine,stavudine,tenofovirdisoproxil,zidovudine,efavirenz,etravirine,nevirapine,rilpivirine,atazanavir,darunavir,fosamprenavir,indinavir,nelfinavir,saquinavir,tipranavir,enfuvirtide,maraviroc,dolutegravir,elvitegravir,raltegravir,docosanol,acyclovir,valaciclovir,famciclovir,penciclovir,tacrine,rivastigmine,donepezil,galantamine,memantine,levodopa,bromocriptine,pergolide,pramipexole,ropinirole,piribedil,cabergoline,apomorphine,lisuride,safinamide,selegiline和rasagiline。
在某些实施例中，生物活性药物可以选择生长因子、细胞因子、抗体和酶。在某些实施例中，生物活性药物可以为bonemorphogeneticproteins(bmp),epidermalgrowthfactors(egf),fibroblastgrowthfactors(fgf),glialcell-derivedneurotrophicfactors(gdnf),interleukins(il),nervegrowthfactors(ngf),brain-derivedneurotrophicfactors(bdnf),neurotrophins(nt),platelet-derivedgrowthfactors(pdgf),vascularendothelialgrowthfactors(vegf)和neuregulins.在某些实施例中，生物活性药物可以为bonemorphogeneticprotein2(bmp-2),bonemorphogeneticprotein7(bmp-7),epidermalgrowthfactor,fibroblastgrowthfactor1(fgf-1),fibroblastgrowthfactor2(fgf-2),fibroblastgrowthfactor3(fgf-3),fibroblastgrowthfactor4(fgf-4),fibroblastgrowthfactor5(fgf-5),fibroblastgrowthfactor6(fgf-6),fibroblastgrowthfactor7(fgf-7),fibroblastgrowthfactor8(fgf-8),fibroblastgrowthfactor9(fgf-9),fibroblastgrowthfactor10(fgf-10),fibroblastgrowthfactor11(fgf-11),fibroblastgrowthfactor12(fgf-12),fibroblastgrowthfactor13(fgf-13),fibroblastgrowthfactor14(fgf-14),fibroblastgrowthfactor15(fgf-15),fibroblastgrowthfactor16(fgf-16),fibroblastgrowthfactor17(fgf-17),fibroblastgrowthfactor18(fgf-18),fibroblastgrowthfactor19(fgf-19),fibroblastgrowthfactor20(fgf-20),fibroblastgrowthfactor21(fgf-21),fibroblastgrowthfactor22(fgf-22),fibroblastgrowthfactor23(fgf-23),glialcel-derivedneurotrophicfactor,neurturin,interleukin1(il-1),interleukin2(il-2),interleukin3(il-3),interleukin4(il-4),interleukin5(il-5),interleukin6(il-6),interleukin7(il-7),nervegrowthfactor,brain-derivedneurotrophicfactor,neurotrophin-3(nt-3),neurotrophin4(nt-4),platelet-derivedgrowthfactor,vascularendothelialgrowthfactor,neuregulin(nrg1),neuregulin(nrg2),neuregulin(nrg3)和neuregulin(nrg4).
在某些实施例中，生物活性药物可以选择afutuzumab,3f8,8h9,adecatumumab,abituzumab,ado-trastuzumabemtansine,altumomabpentetate,atezolizumabglembatumumabvedotin,margetuximab,sacituzumabgovitecan,trastuzumabemtansine,lorvotuzumabmertansine,anetumabravtansine,ascrinvacumab,avelumab,azintuxizumabvedotin,bevacizumab,bevacizumab-awb,bcd-10,belantamabmafodotin,bectumomab,belimumab,bemarituzumab,brontictuzumab,brentuximabvedotin,cantuzumabravtansine,carotuximab,cabiralizumab,cbr96-doxorubicinimunoconjugate,camidanlumabtesirine,cemiplimab,cetuximab,cetrelimab,cibisatamab,citatuzumabogatox,cixutumumab,codrituzumab,cofetuzumabpelidotin,coltuximabravtansine,conatumumab,cusatuzumab,depatuxizumabmafodotin,dacetuzumab,dalotuzumab,detumomab,daratumumab,demcizumab,derlotuximabbiotin,denintuzumabmafodotin,emapalumab,bivatuzumabmertansine,carlumab,clivatuzumabtetraxetan,dinutuximab,dostarlimab,drozitumab,ds-8201,durvalumab,dusigitumab,duvortuxizumab,ecromeximab,eculizumab,edrecolomab,elgemtumab,elotuzumab,emactuzumab,emibetuzumab,enapotamabvedotin,enavatuzumab,enfortumabvedotin,enoblituzumab,ensituximab,epratuzumab,ertumaxomab,etaracizumab,farletuzumab,fbta05,ficlatuzumab,figitumumab,flanvotumab,flotetuzumab,fresolimumab,futuximab,galiximab,gancotamab,ganitumab,gatipotuzumab,gemtuzumabozogamicin,girentuximab,glembatumumabvedotin,ibi308,ibritumomabtiuxetan,icrucumab,igovomab,iladatuzumabvedotin,iviab362,imalumab,imgatuzumab,indatuximabravtansine,indusatumabvedotin,inebilizumab,intetumumab,inotuzumabozogamicin,ipilimumab,iratumumab,isatuximab,istiratumab,labetuzumab,lacnotuzumab,ladiratuzumabvedotin,lenzilumab,lexatumumab,lifastuzumabvedotin,loncastuximabtesirine,losatuxizumabvedotin,lilotomabsatetraxetan,lintuzumab,lirilumab,lorvotuzumabmertansine,lucatumumab,lumiliximab,lumretuzumab,mabpl,mapatumumab,margetuximab,matuzumab,milatuzumab,mirvetuximabsoravtansine,mitumomab,modotuximab,mogamulizumab,monalizumab,mosunetuzumab,moxetumomabpasudotox,nacolomabtafenatox,naptumomabestafenatox,narnatumab,navicixizumab,naxitamab,necitumumab,nesvacumab,nimotuzumab,nivolumab,nofetumomabmerpentan,obinutuzumab,ocaratuzumab,ofatumumab,olaratumab,oleclumab,omburtamab,onartuzumab,ontuxizumab,oportuzumabmonatox,oregovomab,otertuzumab,pascolizumab,pasotuxizumab,pateclizumab,patritumab,pdr01,pembrolizumab,pemtumomab,pertuzumab,pidilizumab,pinatuzumabvedotin,pintumomab,polatuzumabvedotin,pritumumab,racotumomab,radretumab,ramucirumab,relatlimab,rilotumumab,rituximab,robatumumab,rosmantuzumab,rovalpituzumabtesirine,sacituzumabgovitecan,samalizumab,samrotamabvedotin,satumomabpendetide,seribantumab,sibrotuzumab,sgn-cd19a,siltuximab,sirtratumabvedotin,sofituzumabvedotin,solitomab,spartalizumab,tabalumab,tacatuzumabtetraxetan,taplitumomabpaptox,tarextumab,tavolimab,telisotuzumabvedotin,tenatumomab,tepoditamab,tetulomab,tgn1412,tigatuzumab,timigutuzumab,tiragotumab,tislelizumab,tisotumabvedotin,tnx-650,tomuzotuximab,tositumomab,tovetumab,trastuzumab,trastuzumabemtansine,trbs07,tremelimumab,tucotuzumabcelmoleukin,ublituximab,ulocuplumab,urelumab,utomilumab,vadastuximabtalirine,vandortuzumabvedotin,vantictumab,vanucizumab,varlilumab,veltuzumab,vesencumab,volociximab,vonlerolizumab,vorsetuzumabmafodotin,votumumab,xmab-574,zalutumumab,zanolimumab,zatuximab,zenocutuzumab,zolbetuximab,aducanumab,bapineuzumab,crenezumab,elezanumab,eptinezumab,erenumab,erlizumab,fremanezumab,fulranumab,foravirumab,galcanezumab,gantenerumab,gosuranemab,ibalizumab,lampalizumab,larcaviximab,ozanezumab,pamrevlumab,panitumumab,pankomab,placulumab,ponezumab,prasinezumab,porgaviximab,pro140,ranibizumab,refanezumab,rinucumab,rafivirumab,rmab,sa237,satralizumab,solanezumab,sonepcizumab,stamulumab,suvizumab,tanezumab,tefibazumab,teprotumumab,trevogrumab,varisacumabantibodies。
在某些实施例中，生物活性药物可以选择α-l-iduronidase,iduronate-2-sulfatase,heparinn-sulfatase,glucocerebrosidase,galactocerebrosidase,arylsulfatasea,β-hexosaminidase,recombinanttripeptidylpeptidase1,α-galactosidasea,tripeptidylpeptidase1proenzyme和α-galactosidaseenzymes。
在某些实施例中，生物活性药物可以选择gendicine,advexin,oblimersensodium,mir-15a,mir-16-1,mir-143,mir-145,mir-21,membersofthelet-7family,mir-142,bic/mir-15,amemberofthemir-17-19bcluster,glutamatedecarboxylate(gad),netrin(ntn),artermin,aromaticl-aminoacidecarboxylase(adc),ciliaryneurotrophicfactor(cntf),insulinlikegrowthfactor1
(igf-1),vascularendothelialgrowthfactora(vegf-a),vascularendothelialgrowthfactorb(vegf-b),survivalofmotorneuron1(smn1),survivalofmotorneuron2(smn2)和chemokinereceptortype5(cr5)。
在某些实施例中，生物活性药物可以选择dnawithanendosome-escapingprotein(e.g.,phospholipase),rnawithanendosome-escapingprotein(e.g.,phospholipase),acrispr/cas9complex,arna-inducedsilencingcomplex(risc),和amicrornaprotein-rnacomplex(rnp).
在某些实施例中，生物活性药物可以选择radio-nucleotides,radiolabeledglucoseresidues,radiolabeledantibodies,radiolabeledproteins和fluorescentproteins。
可以依照本技术发明的方法，发明新型放射成像剂供核医学专家用于哺乳动物的组织成像。任何哺乳动物肿瘤可以用本发明所述的成像剂来成像。影像是由成像剂在空间上分布不同而产生的，而这个空间上的差异来自于成像剂在哺乳动物体内组织和器官中累积。成像剂在哺乳动物、器官或组织中的空间分布可以用多种仪器来测量，例如，pet或单光子计算机断层扫描(spect)成像等。
靶向递送
本发明所述靶向基团可以用来靶向或引导纳米粒子或聚合物生物活性药物共轭物到特定位点(例如，细胞类型和疾病组织)或相互作用(例如，特异性结合)。特别注意的是，聚合物纳米粒子或聚合物生物活性药物共轭物可以用于靶向大脑和中枢神经系统。在某些实施例中，相比于不包含靶向基团的纳米粒子或聚合物生物活性药物共轭物，含有靶向基团的聚合物纳米粒子或聚合物生物活性药物共轭物可以更加有效地递送到特定位点(如缺血组织)。
在某些实施例中，生物活性药物可以利用靶向基团在活体内有效地递送到特定位点。在某些实施例中，优化纳米粒子表面偶联的靶向基团可以实现靶向递送生物活性药物。
在某些实施例中，共轭偶联可以防止靶向基团从聚合物纳米粒子上解离。
在某些实施例中，针对体外测试和通过静脉内注射实现体内靶向特定组织和器官，本发明可以通过非靶向和靶向性聚合物纳米粒子实现高效、低毒性的生物活性药物递送。
在某些实施例中，聚合物纳米粒子可以包含多个靶向基团。在某些实施例中，靶向基团分布在聚合物纳米粒子表面。在某些实施例中，靶向基团与纳米粒子共价偶联。
在某些实施例中，聚合物生物活性药物共轭体中的聚合物可以包含多个靶向基团。在某些实施例中，靶向基团与聚合物共价偶联。
在某些实施例中，靶向功能基团可以是小分子，例如叶酸(folate)和arginylglycylasparticacid(rgd)。
在某些实施例中，靶向功能蛋白质为transferins。
在某些实施例中，靶向功能蛋白质可以选择anti-vegfrantibody,anti-cd20antibody和anti-erb2antibody。
在某些实施例中，靶向功能蛋白质可以选择antigenbindingfragment(fab),single-chainvariablefragment(scfv)和disulfide-stabilizedvariableantibodyfragment(ds-fv)。
聚合物生物活性药物共轭体
定义，本发明提供一种聚合物生物活性药物共轭体，其包含共价偶联多个聚合物的生物活性药物，多个共价偶联到聚合物上的功能基团。在某些实施例中，每一个聚合物包含偶联到输运功能基团的输运功能单体和偶联到生物活性药物的药物单体的共聚物。
在某些实施例中，聚合物包含多个单体，其可以选择2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine,mpc),n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(n-(3-aminopropyl)methacrylamide,apm),三甲基(2-丙-2-烯酰氧基乙基)氮杂(trimethyl(2-prop-2-enoyloxyethyl)azanium),甲基丙烯酰基乙基三甲基铵methacrylatoethyltrimethylamonium,
[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵[2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl)ammoniumhydroxide,甲基丙烯酸羧基甜菜碱carboxybetainemethacrylate,
丙烯酰胺acrylamide,聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯poly(ethyleneglycol)methyletheracrylate,乙烯基吡啶vinylpyridine和羧基甜菜碱丙烯酰胺单体。在某些实施例中，聚合物包含多个独立单体，包括2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine,mpc),n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(n-(3-aminopropyl)methacrylamide,apm),三甲基(2-丙-2-烯酰氧基乙基)氮杂(trimethyl(2-prop-2-enoyloxyethyl)azanium),甲基丙烯酰基乙基三甲基铵methacrylatoethyltrimethylamonium,[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵[2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl)ammoniumhydroxide,甲基丙烯酸羧基甜菜碱carboxybetainemethacrylate和羧基甜菜碱丙烯酰胺carboxybetaineacrylamide单体。在某些实施例中，聚合物包含多个独立的单体为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine,mpc)和多个单体为n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(n-(3-aminopropyl)methacrylamide,apm)。
在某些实施例中，生物活性药物可以为生长因子，细胞因子，抗体、酶、基因，基因蛋白复合物和成像剂。在某些实施例中，生物活性药物可以选择bonemorphogeneticprotein(bmp),epidermalgrowthfactor(egf),fibroblastgrowthfactor(fgf),glialcel-derivedneurotrophicfactor(gdnf),interleukin(il),nervegrowthfactor(ngf),brain-derivedneurotrophicfactor(bdnf),neurotrophin(nt),platelet-derivedgrowthfactor(pdgf),vascularendothelialgrowthfactor(vegf)和neuregulin。在某些实施例中，生物活性药物可以选择bonemorphogeneticprotein2(bmp-2),bonemorphogeneticprotein7(bmp-7),epidermalgrowthfactor,fibroblastgrowthfactor1(fgf-1),fibroblastgrowthfactor2(fgf-2),fibroblastgrowthfactor3(fgf-3),fibroblastgrowthfactor4(fgf-4),fibroblastgrowthfactor5(fgf-5),fibroblastgrowthfactor6(fgf-6),fibroblastgrowthfactor7(fgf-7),fibroblastgrowthfactor8(fgf-8),fibroblastgrowthfactor9(fgf-9),fibroblastgrowthfactor10(fgf-10),fibroblastgrowthfactor11(fgf-11),fibroblastgrowthfactor12(fgf-12),fibroblastgrowthfactor13(fgf-13),fibroblastgrowthfactor14(fgf-14),fibroblastgrowthfactor15(fgf-15),fibroblastgrowthfactor16(fgf-16),fibroblastgrowthfactor17(fgf-17),fibroblastgrowthfactor18(fgf-18),fibroblastgrowthfactor19(fgf-19),fibroblastgrowthfactor20(fgf-20),fibroblastgrowthfactor21(fgf-21),fibroblastgrowthfactor22(fgf-22),fibroblastgrowthfactor23(fgf-23),glialcel-derivedneurotrophicfactor,neurturin,interleukin1(il-1),interleukin2(il-2),interleukin3(il-3),interleukin4(il-4),interleukin5(il-5),interleukin6(il-6),interleukin7(il-7),nervegrowthfactor,brain-derivedneurotrophicfactor,neurotrophin-3(nt-3),neurotrophin4(nt-4),platelet-derivedgrowthfactor,vascularendothelialgrowthfactor,neuregulin1(nrg1),neuregulin2(nrg2),neuregulin3(nrg3)和neuregulin4(nrg4)。
在某些实施例中，生物活性药物可以选择afutuzumab,3f8,8h9,adecatumumab,abituzumab,ado-trastuzumabemtansine,altumomabpentetate,atezolizumabglembatumumabvedotin,margetuximab,sacituzumabgovitecan,trastuzumabemtansine,lorvotuzumabmertansine,anetumabravtansine,ascrinvacumab,avelumab,azintuxizumabvedotin,bevacizumab,bevacizumab-awb,bcd-10,belantamabmafodotin,bectumomab,belimumab,bemarituzumab,brontictuzumab,brentuximabvedotin,cantuzumabravtansine,carotuximab,cabiralizumab,cbr96-doxorubicinimunoconjugate,camidanlumabtesirine,cemiplimab,cetuximab,cetrelimab,cibisatamab,citatuzumabogatox,cixutumumab,codrituzumab,cofetuzumabpelidotin,coltuximabravtansine,conatumumab,cusatuzumab,depatuxizumabmafodotin,dacetuzumab,dalotuzumab,detumomab,daratumumab,demcizumab,derlotuximabbiotin,denintuzumabmafodotin,emapalumab,bivatuzumabmertansine,carlumab,clivatuzumabtetraxetan,dinutuximab,dostarlimab,drozitumab,ds-8201,durvalumab,dusigitumab,duvortuxizumab,ecromeximab,eculizumab,edrecolomab,elgemtumab,elotuzumab,emactuzumab,emibetuzumab,enapotamabvedotin,enavatuzumab,enfortumabvedotin,enoblituzumab,ensituximab,epratuzumab,ertumaxomab,etaracizumab,farletuzumab,fbta05,ficlatuzumab,figitumumab,flanvotumab,flotetuzumab,fresolimumab,futuximab,galiximab,gancotamab,ganitumab,gatipotuzumab,gemtuzumabozogamicin,girentuximab,glembatumumabvedotin,ibi308,ibritumomabtiuxetan,icrucumab,igovomab,iladatuzumabvedotin,imab362,imalumab,imgatuzumab,indatuximabravtansine,indusatumabvedotin,inebilizumab,intetumumab,inotuzumabozogamicin,ipilimumab,iratumumab,isatuximab,istiratumab,labetuzumab,lacnotuzumab,ladiratuzumabvedotin,lenzilumab,lexatumumab,lifastuzumabvedotin,loncastuximabtesirine,losatuxizumabvedotin,lilotomabsatetraxetan,lintuzumab,lirilumab,lorvotuzumabmertansine,lucatumumab,lumiliximab,lumretuzumab,mabp1,mapatumumab,margetuximab,matuzumab,milatuzumab,mirvetuximabsoravtansine,mitumomab,modotuximab,mogamulizumab,monalizumab,mosunetuzumab,moxetumomabpasudotox,nacolomabtafenatox,naptumomabestafenatox,narnatumab,navicixizumab,naxitamab,necitumumab,nesvacumab,nimotuzumab,nivolumab,nofetumomabmerpentan,obinutuzumab,ocaratuzumab,ofatumumab,olaratumab,oleclumab,omburtamab,onartuzumab,ontuxizumab,oportuzumabmonatox,oregovomab,otlertuzumab,pascolizumab,pasotuxizumab,pateclizumab,patritumab,pdr01,pembrolizumab,pemtumomab,pertuzumab,pidilizumab,pinatuzumabvedotin,pintumomab,polatuzumabvedotin,pritumumab,racotumomab,radretumab,ramucirumab,relatlimab,rilotumumab,rituximab,robatumumab,rosmantuzumab,rovalpituzumabtesirine,sacituzumabgovitecan,samalizumab,samrotamabvedotin,satumomabpendetide,seribantumab,sibrotuzumab,sgn-cd19a,siltuximab,sirtratumabvedotin,sofituzumabvedotin,solitomab,spartalizumab,tabalumab,tacatuzumabtetraxetan,taplitumomabpaptox,tarextumab,tavolimab,telisotuzumabvedotin,tenatumomab,tepoditamab,tetulomab,tgn1412,tigatuzumab,timigutuzumab,tiragotumab,tislelizumab,tisotumabvedotin,'tnx-650,tomuzotuximab,tositumomab,tovetumab,trastuzumab,trastuzumabemtansine,trbs07,tremelimumab,tucotuzumabcelmoleukin,ublituximab,ulocuplumab,urelumab,utomilumab,vadastuximabtalirine,vandortuzumabvedotin,vantictumab,vanucizumab,varlilumab,veltuzumab,vesencumab,volociximab,vonlerolizumab,vorsetuzumabmafodotin,votumumab,xmab-574,zalutumumab,zanolimumab,zatuximab,zenocutuzumab,zolbetuximab,aducanumab,bapineuzumab,crenezumab,elezanumab,eptinezumab,erenumab,erlizumab,fremanezumab,fulranumab,foravirumab,galcanezumab,gantenerumab,gosuranemab,ibalizumab,lampalizumab,larcaviximab,ozanezumab,pamrevlumab,panitumumab,pankomab,placulumab,ponezumab,prasinezumab,porgaviximab,pro140,ranibizumab,refanezumab,rinucumab,rafivirumab,rmab,sa237,satralizumab,solanezumab,sonepcizumab,stamulumab,suvizumab,tanezumab,tefibazumab,teprotumumab,trevogrumab,varisacumab。
在某些实施例中，生物活性药物可以选择α-l-iduronidase,iduronate-2-sulfatase,heparinn-sulfatase,glucocerebrosidase,galactocerebrosidase,arylsulfatasea,β-hexosaminidase,recombinanttripeptidylpeptidase1,α-galactosidasea,tripeptidylpeptidase1proenzyme和α-glucosidase.
在某些实施例中，生物活性药物可以选择gendicine,advexin,oblimersensodium,mir-15a,mir-16-1,mir-143,mir-145,mir-21,amemberofthelet-7family,mir-142,bic/mir-155,amemberofthemir-17-19bcluster,glutamatedecarboxylate(gad),netrin(ntn),artermin,aromaticl-aminoaciddecarboxylase(aadc),ciliaryneurotrophicfactor(cntf),insulinlikegrowthfactor1(igf-1),vascularendothelialgrowthfactora(vegf-a),vascularendothelialgrowthfactorb(vegf-b),survivalofmotorneuron1(smn1),survivalofmotorneuron2(smn2),和chemokinereceptortype5(ccr5).
在某些实施例中，生物活性药物可以选择dnawithanendosome-escapingprotein(e.g.,phospholipase),rnawithanendosome-escapingprotein(e.g.,phospholipase),crispr/cas9complex,rna-inducedsilencingcomplex(risc)和micrornaprotein-rnacomplex(rnp).
在某些实施例中，生物活性药物可以是荧光蛋白(fluorescentprotein)。
增强生物膜渗透
本发明所述聚合物纳米粒子和聚合物生物活性药物共轭体包含多个可以增强生物膜渗透能力的转运功能基团。在某些实施例中，相比于不含有转运功能基团的纳米粒子和共轭体，引入转运功能基团可以增加纳米粒子或共轭体跨越血脑屏障的通过能力。
通常情况下，转运功能基团(e.g.,formulai,v,orvi)偶联于单体，进而偶联到共聚物。或者，转运功能基团自身为一种单体或者直接偶联到共聚物上(例如，化合物formulaii,iii,iv,或vi)。在某些实施例中，转运功能基团可以独立选择为神经递质、类鸦片和中枢神经系统兴奋剂。在某些实施例中，转运功能基团可以共价偶联到聚合物上。在其他实施例中，转运功能基团可以以非共价方式(通过氢键或电荷电荷相互作用)结合到聚合物上。
在某些实施例中，转运功能基团可以分别从胆碱choline,乙酰胆碱acetylcholine,尼古丁nicotine,磷胆碱phosphorylcholine,毒蕈碱muscarine,可卡因cocaine,派啶meperidine,吗啡morphine,多巴胺dopamine和血清素serotonin基团中选择。
在某些实施例中，转运功能基团结构可以参照以下形式或者其制药学上可接受的盐形式
x1-a-y1
i
图中
x1，x2，x3或x4为阳离子基团，通常包含氮原子；
a为间隔单元；
y1或y2为氢键受体，通常包含氮原子或者氧原子；
在某些实施例中，阳离子基团具有至少一个正电荷或两个正电荷。
在某些实施例中，氢键受体具有至少一个氢键受体，至少两个氢键受体或至少三个氢键受体。
在某系实施例中，转运功能基团结构以结构式i表示或者其制药学上可接受的盐形式。
x1-a-y1
i
图中
x1为氨基amino,胍基guanidino,肼基hydrazino,重氮diazonium,磷phosphonium,硫sulfonium,杂环heterocyclyl；
a为烷基alkyl、芳基aryl、环烷基cycloalkyl或杂芳基heteroaryl；
y1为酰胺amido,脒amidino,氧oxygen,烷氧基alkyloxy,偶氮azo,羧基carboxyl,烯基alkenyl,酯ester,酮keto,磷酸盐phosphate,亚砜sulfoxide,砜sulfone,磺酰胺sulfonamido,杂芳基heteroaryl或杂环基heterocyclyl。
在某些实施例中，转运功能基团结构以结构式ii表示或者其制药学上可接受的盐形式。
图中
x2为氨基amino,胍基guanidino,肼基hydrazino,磷phosphonium,硫sulfonium,杂环heterocyclyl；
a为烷基alkyl、芳基aryl、环烷基cycloalkyl或杂芳基heteroaryl；
y1为酰胺amido,脒amidino,氧oxygen,烷氧基alkyloxy,偶氮azo,羧基carboxyl,烯基alkenyl,酯ester,酮keto,磷酸盐phosphate,亚砜sulfoxide,砜sulfone,磺酰胺sulfonamido,杂芳基heteroaryl或杂环基heterocyclyl。
在某些实施例中，y1为烯基。在某些实施例中，y1为图所示结构
在某些实施例中，转运功能基团结构以结构式iii表示或者其制药学上可接受的盐形式。
图中
x1为氨基amino,胍基guanidino,肼基hydrazino,重氮diazonium,磷phosphonium,硫sulfonium,杂环heterocyclyl；
a为烷基alkyl、芳基aryl、环烷基cycloalkyl或杂芳基heteroaryl；
y2为酰胺amido,脒amidino,氧oxygen,烷氧基alkyloxy,偶氮azo,羧基carboxyl,烯基alkenyl,酯ester,酮keto,磷酸盐phosphate,亚砜sulfoxide,砜sulfone,磺酰胺sulfonamido,杂芳基heteroaryl或杂环基heterocyclyl。
在某些实施例的优化结构式i，ii，iii中，a为烷基。在最优结构式中，a为c1-c10的烷基。
在某些实施例中，转运功能基团结构以结构式iv表示或者其制药学上可接受的盐形式。
图中
x2为氨基amino,胍基guanidino,肼基hydrazino,磷phosphonium,硫sulfonium,杂环heterocyclyl；
a为烷基alkyl、芳基aryl、环烷基cycloalkyl或杂芳基heteroaryl；
y2为酰胺amido,脒amidino,氧oxygen,烷氧基alkyloxy,偶氮azo,羧基carboxyl,烯基alkenyl,酯ester,酮keto,磷酸盐phosphate,亚砜sulfoxide,砜sulfone,磺酰胺sulfonamido,杂芳基heteroaryl或杂环基heterocyclyl。
在某些实施例中，转运功能基团结构以结构式v表示或者其制药学上可接受的盐形式。
图中
x3为氨基amino,胍基guanidino,肼基hydrazino,重氮diazonium,磷phosphonium,硫sulfonium,杂环heterocyclyl。
在某些实施例中，转运功能基团结构以结构式v表示或者其制药学上可接受的盐形式。
图中
x4为氨基amino,胍基guanidino,肼基hydrazino,磷phosphonium,硫sulfonium,杂环heterocyclyl。
在某些实施例的优化结构式i，ii，iii，iv，v和vi中，氨基以叔胺盐或季胺盐形式存在。
在某些实施例中，对比于缺乏转运功能基团的纳米粒子或共轭体，包含转运基团可以增强生物膜的通透性。
在某些实施例中，相比于缺水亲水性基团纳米粒子和共轭体，本发明所述的聚合物纳米粒子或聚合物生物活性药物共轭体引入至少一个亲水基团，可以提高纳米粒子或共轭体对生物膜的通透性和血浆稳定性。
通常情况下，引入亲水基团可以通过减少血液中有机物和生物大分子的粘附来提高其血浆稳定性和增加其生物膜的通透性。在一些实施例中，亲水基团可以为亲水小分子(单体)，齐聚物或聚合物，其存在于制备的纳米粒子或共轭体表面。在另外一些实施例中，亲水基团在制备过程中结合到纳米粒子上(例如，将亲水基团偶联到亲水单体上制备共聚物)。在某些实施例中，亲水基团包埋或嵌入到聚合物中。在某些实施例中，亲水基团以氢键等非共价形式结合到聚合物上。
在某些实施例中，亲水基团具有至少一个氢键受体(如，氮或氧)。
在某些实施例中，亲水基团可以是两亲性离子聚合物。在某些实施例中，两亲性离子聚合物可以为聚磷酸胆碱poly(phosphorylcholine)、聚磺基甜菜碱poly(sulfobetaine)和聚聚羧基甜菜碱poly(carboxybetaine)。
在其它实施例中，亲水基团可以不是两亲性离子聚合物。在某些实施例中，亲水基团可以为中性聚合物。在某些实施例中，亲水基团为聚乙二醇poly(ethyleneglycol),聚乙烯基吡啶poly(vinylpyridine),聚2甲基丙烯酸甲酯poly(2-hydroxyethylmethacrylate),聚多糖poly-sacharide.在某些实施例中，亲水基团可以为聚(低聚乙二醇)聚(甲基丙烯酸酯)poly(oligoethyleneglycol)poly(methacrylate),聚(丙烯酸酯)poly(acrylate),聚酰胺poly(amide),聚肽poly(peptoid),聚恶唑啉poly(oxazoline),聚(羟乙基丙烯酸酯)poly(hydroxylethylacrylate),聚(乙基乙基磷酸酯)poly(ethylethylenephosphate)。
在某些实施例中，亲水基团和转运功能基团的摩尔比约为1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，10:1和20:1。在某些实施例中，亲水基团与转运功能基团的比例约为1:1。在某些实施例中，亲水基团与转运功能基团的比例约为20:1。
在某些实施例中，亲水基团存在量应使得其可以暴露在一定数量生物分子和吸附在聚合物纳米粒子和聚合物生物活性药物共轭体表面的量不少于其在相同条件缺少亲水基团时，单独存在数量的50％，40％，30％，20％，10％，5％，4％，3％，2％或1％。
单体和交联剂
不同的单体和交联剂可以通过原位聚合，例如本发明所述方法以及其它在本领域中常见的方法，来实现生物活性药物递送(包括蛋白质、小分子或者基因)。
在某些实施例中，转运功能单体可以分别从2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine,mpc),n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(n-(3-aminopropyl)methacrylamide,apm),甲基丙烯酸季铵化二甲基氨基乙酯quaternizeddimethylaminoethylmethacrylate，三甲基(2-丙-2-烯酰氧基乙基)氮杂(trimethyl(2-prop-2-enoyloxyethyl)azanium),甲基丙烯酰基乙基三甲基铵methacrylatoethyltrimethylamonium,[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵[2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl)ammoniumhydroxide,甲基丙烯酸羧基甜菜碱carboxybetainemethacrylate和羧基甜菜碱丙烯酰胺carboxybetaineacrylamide单体中选择。在一个优化的实施例中，转运功能基团为甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱methacryloyloxyethylphosphorylcholine单体。在某些实施例中，转运功能基团包含乙烯基派啶vinylpyridine单体。在某些实施例中，转运功能基团包含聚乙二醇甲基醚丙烯酸酯poly(ethyleneglycol)methyletheracrylate单体。
在某些实施例中，所述药剂单体是甲基丙烯酸酯，其可以是与一种或多种生物活性药物共价偶联，例如，可以通过生物活性药物自身含有的羟基形成酯基，或通过桥连基团上的羟基与一种或多种生物活性药物共价偶联形成脂基。代表性实例包括聚乙二醇中的甲基丙烯酸酯、小分子中的甲基丙烯酸脂(例如，everolimus中的甲基丙烯酸酯)、抗体中的甲基丙烯酸酯以及含有羟基部分的肽蛋白中的甲基丙烯酸酯，如丝氨酸和苏氨酸。
在某些实施例中，所述药剂单体是甲基丙烯酰胺，其可以是与一种或多种生物活性药物共价偶联，例如，可以通过生物活性药物自身含有的氨基形成，或通过桥连基团上的氨基与一种或多种生物活性药物共价偶联形成。代表性实例包括小分子中的甲基丙烯酰胺(例如，fluoxetine中的甲基丙烯胺)，抗体中的甲基丙烯酰胺以及含有氨基的肽蛋白，如赖氨酸。在某些实施例中，所述药剂单体可以分别从乙基丙烯酸酯，甲基丙烯酰胺和n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(apm)单体中选择。
在某些实施例中，交联剂单体可以分别从n，n'-亚甲基双丙烯酰胺n,n'-methylenebisacrylamide(bis),双[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]磷酸酯bis[2-(methacryloyloxy)ethyl]phosphate(bmep),甲基丙烯酸甘油二酯glyceroldimethacrylate(gdma),聚丙交酯类嵌段共聚物polylactide-basedblockcopolymer和双丙烯酸酯化的肽bisacrylatedpeptide中选择。在某些实施例中，交联剂单体可以分别从甲基丙烯酸甘油二酯glyceroldimethacrylate(gdma),聚丙交酯类嵌段共聚物polylactide-basedblockcopolymer和双丙烯酸酯化肽bisacrylatedpeptide中选择。在某些实施例中，聚丙交酯类嵌段共聚物为poly(dl-lactide)-b-poly(ethyleneglycol)-b-poly(dl-lactide)-diacrylate。在某些实施例中，双丙烯酸酯化肽为双丙烯酸酯化vplgvrtk。在某些实施例中，双丙烯酸酯化肽为双丙烯酸酯化knrvk。在某些实施例中，双丙烯酸酯化肽为双丙烯酸酯化gipvslrsgk。在某些实施例中，双丙烯酸酯化肽为双丙烯酸酯化gvplslysgk。在某些实施例中，双丙烯酸酯化肽为肾小球蛋白酶底物。
在某些实施例中，稳定功能单体为聚乙二醇单体。
在某些实施例中，交联单体可以通过酸、碱、酶、三磷酸腺苷，氧化剂，还原剂，葡萄糖、低氧条件、可见光、紫外光、红外线或热来降解。在某些实施例中，交联单体可以通过蛋白酶、酯酶、纤溶酶、胶原酶或基质金属蛋白酶来降解。
一些标准的可降解交联剂和非可降解交联剂总结与美国专利us2015/0071999的表2中。
成像方法
在某些实施例中，本发明所述提供了一种所需的中枢神经系统的成像方法，具体包括向待测目标注射一定有效剂量的包含成像剂的聚合物纳米粒子或聚合物生物活性药物。在某些实施例中，所述方法可扩展为由含有可被检测的成像剂的成像单元组成。
处理方法
在某些实施例中，本发明可以被用来治疗疾病或功能紊乱，例如癌症、神经退行性疾病、中枢神经系统紊乱和病毒感染。
在某些实施例中，癌症范围包括母细胞瘤(blastoma)、胶质母细胞瘤(glioblastoma)、骨髓瘤(myeloma)、中枢神经系统瘤、肿瘤血管再生(tumorangiogenesis)、脊髓轴肿瘤(spinalaxistumor)，脑干细胞神经胶质瘤(brainstemglioma)、垂体腺瘤(pituitaryadenoma)以及环境诱发癌症。
在某些实施例中，神经退行性疾病或中枢神经系统功能紊乱范围包括alzheimer'sdisease,parkinson'sdisease,dementiawithlewybodies,multiplesystematrophy,priondiseases,motorneurondisease,huntington'sdisease,amyotrophiclateralsclerosis,ataxiatelangiectasia,pick'sdisease,krabe'sdisease,kenedy'sdisease,primarylateralsclerosis,cockaynesyndrome,metachromaticleukodystrophy,taysach'sdisease,sandhof'sdisease,lateinfantileneuronalceroidlipofuscinosis,pompe'sdisease,spinocerebelarataxia,hiv-asociatedneurocognitivedisorders,stroke,lougehrig'sdisease,creutzfeldt-jakobdisease,spinalcordinjury,cerebralpalsy,multiplesclerosis,progresivesupranuclearpalsy,pelizaeus-merzbacherdisease,tabesdorsalis和spinalmuscularatrophy。
在某些实施例中，神经退行性疾病或中枢神经系统功能紊乱为脑缺血症状。
在某些实施例中，病毒感染包括humanimmunodeficiencyvirus(hiv),rabiesvirus,zikavirus和herpessimplexvirus(hsv)。
细胞增殖和/或分化性紊乱疾病的非限制性实例包括癌症，例如癌carcinoma,母细胞瘤blastoma,胶质母细胞瘤glioblastoma和肉瘤sarcoma，转移型疾病或造血肿瘤疾病，例如白血病。转移型肿瘤可以来自于多种原发肿瘤类型，包含并不限于前列腺、结肠、肺、乳腺和肝脏。本文所使用的术语“癌症”“过度增殖”和“肿瘤性”是指具有自主生长能力的细胞，即通过迅速增长而表现异常状态。这些术语包括以下几种类型，癌增长或变化过程，转移肿瘤或恶性转化的细胞、组织或器官，病理学类型或浸润阶段。增生型疾病也包括造血性肿瘤疾病，包含涉及造血原发性的增生/肿瘤细胞，如黄斑、淋巴或红细胞系，以及前体细胞。
注射方法
本发明所包含的药物成分可以通过任何适当的方式进行给药，不局限于口服或非肠道途径，例如静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射以及皮下注射。在某些实施例中，本发明所述的药物成分可以通过静脉内、肠胃外输液或注射方式给药。在首选实施例中，本发明所述的药物成分可以通过静脉注射方式给药。在其它的优选实施例中，聚合物纳米粒子和聚合物生物活性药物共轭体可以利用局部给药方式，例如滴眼。
本发明所定义的给药“对象”不仅局限于人类(任意年龄组的男性或女性，例如儿童对象，包括婴儿、儿童和青少年；成年对象，包括青年、中年和老年)或灵长类动物(如食蟹猴、猕猴)或哺乳类动物，包括商业化相关动物，牛、猪、马、绵羊、山羊、猫、狗和/或鸟，其中鸟类包括商业化相关动物，鸡、鸭、鹅、野鸡和/或火鸡。首选对象是人。
在某些实施例中，所述药物成分可以通过鼻部给药方式，给药时间为每天一次，到每周一次，到每两周一次，到每月一次。在某些实施例中，纳米粒子和药物成分可以通过鼻部给药。这里所述的定义“鼻部”或“鼻部给药”主要指通过将纳米粒子递送到受试者鼻部的粘膜，就可以使一定含量的纳米粒子被鼻部组织直接吸收。
在某些实施例中，聚合物纳米粒子和聚合物生物活性药物共轭体以及包含其成分的组合可以利用全身给药方式。
药物成分
本发明所述的药物成分和给药方法可以根据单独个体需求而定制。在某些实施例中，单独个体为哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。当对动物给药时，例如人，所述药物组合或纳米粒子或共轭体应当首选包含本发明所述的纳米粒子或共轭体的药物组合，以及可药用载体。可药用的载体一般来说包括水溶液，如水或生理盐水，以及其它溶液或媒介，如乙二醇、甘油、油，包括橄榄油或可注射用有机酯。在首选实施例中，当所述药物组合用于人类给药时，特别针对于侵入性给药途径，如注射或植入等通过避开上皮屏障的输运或扩散给药方式，水溶液应为无热原性或亚热原性。可以选择辅料用于延迟药物的释放或选择性的靶向一个或多个细胞、组织和器官。本发明所述药物组合可以制成可食用的产品，例如片剂、胶囊(包括微丸胶囊(sprinklecapsule)和凝胶胶囊(gelatincapsule))、颗粒剂、冻干剂、粉剂、溶液、糖浆、栓剂、注射剂等。
此处所述的“可药用的”定义是指在合理的医学判断范围内适用于人类和动物组织接触的化合物、材料、复合物或药剂形式，并且其没有过量的毒性、刺激性、过敏反应以及其它问题。
此处所述的“可药用载体”定义是指可药用的材料、成分或媒介，例如液体、固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶液或包覆材料。每个载体在与另一种形式的药物配方兼容性必须是“可接受的”，并且对患者无害。以下材料可以作为可药用载体，包括(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)黄芪粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)辅料，如粘胶纤维和栓剂蜡；(9)油，如花生油，棉油，葵花子油，芝麻油，橄榄油，角豆油；(10)乙二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油，山梨醇(甘露醇)，甘露聚糖；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液和(21)在药物制剂中使用的其他类型的无毒相容性的物质。
可药用载体可以包含生理学上可接受的药剂来提高稳定性、增加溶解性或增加本发明所述的纳米粒子或聚合物生物活性药物共轭体的吸收能力。所述的生理学上可接受的药剂包括碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂，如抗坏血酸或谷光甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质或其他稳定剂和赋形剂。可药用载体，包括生理上可接受药剂的选择依赖于药剂的给药方式。所述制剂或药剂组合的制备可以是自乳化药物递送系统或者自微乳化药物递送系统。所述药剂组合(制剂)也可以是脂质体或其他聚合物基质，并将所述纳米粒子或共轭体掺入其中。例如，脂质体或其他脂质组成的脂体是无毒的、生物相容的、可代谢的载体，并且容易制备和使用。
药剂组合(制剂)可以通过多种给药途径中的任意一种来给药，包括口服给药(如，溶解在水或非水溶液或悬浮液，片剂，胶囊，包括微丸胶囊(sprinklecapsule)和凝胶胶囊(gelatincapsule)，丸剂、粉剂、颗粒制剂、黏贴剂)和皮下给药。在某些实施例中，纳米粒子或共轭体易于在无菌水中溶解或悬浮。详细的适宜给药途径和药剂组合请参见美国专利，u.s.pat.nos.6,10,973,5,763,493,5,731,000,5,541,231,5,427,798,5,358,970和4,172,896，以及其相关引用。
所述制剂可以方便地以单位剂量形式表示，并且可以通过制药学上已知的任何方法进行制备。以获得单次剂量条件下，与载体材料复合的活性成分所需的剂量将根据待治疗目标对象和特定的给药方式决定。以获得单次剂量条件下，与载体材料复合的活性成分所需的剂量通常为纳米粒子或共轭体产生治疗效果的剂量。一般而言，所述活性成分的剂量的范围可以为1％到99％，优选5％到70％，最优选择10％到30％。
这些制剂或药剂组合的制备方法包括将与本发明相关的纳米粒子和共轭体与载体，或可选地与一种或多种辅助原料，相结合的步骤。通常，将本发明所述纳米粒子或共轭体与液态载体或细分固体载体，或两者，均匀地紧密地复合从而制备所述制剂，然后必要时对其进行成形处理。
本发明所述适用于口服给药的制剂可以是多种形式的胶囊(微丸胶囊(sprinklecapsule)和凝胶胶囊(gelatincapsule))、扁囊、药丸、片剂、锭剂(通常采用蔗糖、阿拉伯胶或黄芪胶)、冻干剂、粉剂、颗粒剂、水性或非水性溶液及悬浮液、水包油或油包水的乳液、酏剂或糖浆、散装锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和洋愧)和/或漱口水等，每一种均包含预先定量的本发明所述的纳米粒子或共轭体作为活性成分。药剂组合、纳米粒子或共轭体也可以通过丸剂、冲剂或膏剂方式给药。
制备口服的固体剂型(胶囊(包括微丸胶囊和凝胶胶囊)，片剂，药丸，糖衣药丸，粉末，颗粒等)，可以将活性成分与一种或多种的可药用载体相混合，例如柠檬酸或三聚磷酸钠，和/或以下任何物质：(1)填充剂或补充剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或树薯淀粉、海藻酸、硅酸盐和碳酸钠；(5)缓凝剂，如石蜡油；(6)吸收增强剂，如季胺盐化合物；(7)润湿剂，如鲸蜡醇和硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物；(10)络合剂，如改性和未改性的环糊精；(11)着色剂。在使用胶囊(包括微丸胶囊和凝胶胶囊)，片剂，药丸的情况下，药物成分也可能包含缓冲剂。类似的固态成分也可以使用软硬填充的明胶胶囊，例如使用乳糖、奶糖或高分子量的糖脂。
药片可以通过压缩或者模制方式制备，可以选择一种或多种辅助成分。压制药片可能使用粘结剂(如，明胶或羟丙基甲基纤维素)，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，崩解剂(如，淀粉羟乙酸钠、交联羧甲基纤维素钠)，表面活性剂或分散剂。为适于机器模具制备模制药片，可以通过混合惰性液态稀释剂来润湿粉状纳米粒子或共轭体。
包含所述药物成分的药片和其它固态制剂形式，例如糖衣丸、胶囊(包括微丸胶囊和凝胶胶囊)、药丸、颗粒剂等，可以通过涂层或壳层来获得，例如肠溶衣或其它已知的包衣制剂。它们还可以通过不同配比来获得活性成分缓慢或可控释放，如以不同比例的混合羟丙基甲基纤维素可以获得理想的释放特性。同样地，可以与其它聚合物基质、脂质体和/或微球按照不同配比混合来获得理想的释放特性。它们可以通过多种方式灭菌，如通过可以保留细菌的过滤器过滤，或通过含有灭菌成分的无菌水，或使用前快速注射灭菌试剂。这些药剂也可以选择包含避光剂，并且可以是单独或优先在胃肠道的某些部位选择性的延迟释放活性成分。可以使用包埋药物成分的实例是聚合物基质和蜡。活性成分也可以以微胶囊形式存在，如果合适，可以是上述一种或多种辅料。
用于口服给药的液体制剂形式包括可药用的乳液、冻干剂、微乳液、溶液、悬浊液、糖浆和酏剂。除活性成分外，液体制剂可能包括常用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，环糊精及其衍生物，增溶剂和破乳剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苄基苯甲酸酯、丙二醇、1,3-丁二醇，油(特指棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇、脱水山梨醇脂肪酸酯及其混合物。
除惰性稀释剂之外，口服药剂也可以包含佐剂，如润湿剂、乳化和悬浮剂、增甜剂、调味剂、着色剂、香料和防腐剂。
除纳米粒子或共轭体外，悬浮液可以含有悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、明胶和阿拉伯胶，以及其混合物。
可通过局部或透皮给药的制剂形式包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、膏剂、乳膏、乳液、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。活性的纳米粒子或共轭体可以在无菌条件下与可药用载体共混，并可以与任何所需的防腐剂、缓冲剂或推进剂共混。
除了活性纳米粒子和共轭体，软膏剂、膏剂、乳膏和凝胶可以包含辅料，如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、阿拉伯胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石粉和氧化锌，或其混合物。
本文所述的“肠胃外给药”是指除肠内和局部给药以外的其它给药方式，通常采用注射方式，包括并不局限于，静脉内、肌肉内、肋间、鞘间、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节腔内、囊下、蛛网膜下、椎体内、胸骨内注射和输液。适用于肠胃外给药的药物成分包括一种或多种纳米粒子和共轭体与一种或多种可药用的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散液、悬浊液或乳液、无菌粉末，其组成可能与无菌的注射液或分散液。药物成分可能包含灭菌剂、缓冲液、抑菌剂、可使其与预期受试者的血液、悬浮剂、增稠剂或配制成等渗液的溶质。
本文所述的可适用于药物成分的水溶液和非水溶液载体，包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其适用的混合物、植物油，如橄榄油、注射用有机酯、如油酸乙酯。药剂的流动性可以通过多种方式保持，例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，通过保持分散情况下的适合的粒径、通过使用表面活性剂。
这些药物成分还可以包含佐剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过添加各种抗菌剂和抗真菌剂(如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保预防微生物的作用。同时，药物成分中还可能需要添加等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可以通过包覆可以延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射药物的吸收。
在某些情况下，为了延长药物作用，希望可以减缓皮下或肌肉内注射药物的吸收。因此，可以通过水溶性较差的晶态或无定形材料的悬浮液来实现。药物的吸收速率取决于溶解速率，这依赖于晶体的大小和结晶形式。或者，通过溶解或悬浮药物在油性的载体可以实现所述肠胃外给药药物成分的延迟吸收。
对于本发明所述方法，活性物质的含量为含有可药用载体的药物成分的0.1％到99.5％(最优为0.5％到90％)。
所述方法也可以通过可充电或可降解的装置实现。近年来，已报道多种缓释聚合物设备用于控制药物如蛋白质生物药的递送，并成功在体内进行了测试。大量生物相容性的聚合物(如水凝胶)包括可降解和不可降解的聚合物，都可以制成植入物用于在特定靶点持续释放纳米粒子或共轭体。
药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得对特定患者、组合物和给药方式有效达到所需治疗效果的活性成分的剂量，并且对患者没有药物毒性。
选择的剂量水平取决于多种因素，包括所用特定纳米粒子或共轭体或其混合物或脂、盐或酰胺的活性，给药方式、给药时间、所用特定纳米粒子或共轭体的排泄速率、与所用纳米粒子或共轭体联合使用的其他药物、化合物或材料的持续时间、年龄、性别、体重、状况、一般健康情况和既往病史，以及其它常用的医学因素。
具有本领域普通技术水平的医师或兽医均可以容易地确定并开出所需药物成分的有效治疗剂量。例如，医师或兽医可以从药物成分的起始剂量开始，即将纳米粒子或共轭体的剂量低于所需达到治疗效率的所需剂量，并逐渐增加剂量，直到达到所需治疗效率。通过“治疗有效剂量”来确定可以达到期望治疗效果的纳米粒子或共轭体的浓度。一般情况下，纳米粒子或共轭体的有效浓度依赖于受试者的体重、性别、年龄和既往病史等。其它因素也可能影响有效剂量，包括不仅限于，病人病情的严重性、正在治疗的疾病、纳米粒子或共轭体的抗病性、以及如果需要，可与本发明所述纳米粒子或共轭体联合使用的其他治疗药物。可以通过多次给药方式递送更大总剂量的药物成分。确定有效性和剂量可参见已报道的的方法(iselbacheretal.(1996)harison'sprinciplesofinternalmedicine13ed.,1814-1882)
通常情况下，本发明所述适用于药物成分和方法的纳米粒子或共轭体的单日用量为产生治疗效果的纳米粒子或共轭体的最低剂量。所述有效剂量依赖于上述影响因素。
如果需要，纳米粒子或共轭体的有效单日剂量可以按一天一次、两次、三次、四次、五次、六次或多次的全天间隔式，或可选的单剂量形式，给药。在某些实施例中，本发明所述纳米粒子或共轭体可以按照每日两次或三次给药。在优选实施例中，所述纳米粒子或共轭体按每日一次给药。
接受本发明药物治疗的患者可以是任何需要的动物，包括灵长类动物，尤其是人类，以及其它哺乳动物，如马、牛、猪、绵羊、猫和狗，家禽，以及宠物。
在某些实施例中，本发明所述纳米粒子或共轭体可以单独使用或者与其它类型的治疗药物共同给药。
本发明内容包括在药物成分和方法中所述的纳米粒子或共轭体的可药用的盐。在某些实施例中，本发明所述的盐类包括不仅限于烷基、二烷基、三烷基或四烷基胺盐。在某些实施例中，本发明所述的盐类包括并不仅限于l-精氨酸、苯甲胺、苄星benzathine，甜菜碱、氢氧化钙、胆碱、脱醇、二乙醇胺、二乙胺、2-(二乙氨基)乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-甲基葡糖胺、肼苯甲胺、1h-咪唑、锂盐、l-赖氨酸、镁盐、4–(2-羟乙基)吗啉、哌嗪、钾盐、1-(2-羟乙基)吡咯烷、钠盐、三乙醇胺、氨丁三醇和锌盐。在某些实施例中，本发明所述的盐类包括并不仅限于包含na、ca、k、mg、zn以及其它金属的金属盐。在某些实施例中，本发明所述的盐类包括并不仅限于1-hydroxy-2-naphthoicacid,2,2-dichloroaceticacid,2-hydroxyethanesulfonicacid,2-oxoglutaricacid,4-acetamidobenzoicacid,4-aminosalicylicacid,aceticacid,adipicacid,1-ascorbicacid,1-asparticacid,benzenesulfonicacid,benzoicacid,(+)-camphoricacid,(+)-camphor-10-sulfonicacid,capricacid(decanoicacid),caproicacid(hexanoicacid),caprylicacid(octanoicacid),carbonicacid,cinnamicacid,citricacid,cyclamicacid,dodecylsulfuricacid,ethane-1,2-disulfonicacid,ethanesulfonicacid,formicacid,fumaricacid,galactaricacid,gentisicacid,d-glucoheptonicacid,d-gluconicacid,d-glucuronicacid,glutamicacid,glutaricacid,glycerophosphoricacid,glycolicacid,hippuricacid,hydrobromicacid,hydrochloricacid,isobutyricacid,lacticacid,lactobionicacid,lauricacid,maleicacid,1-malicacid,malonicacid,mandelicacid,methanesulfonicacid,naphthalene-1,5-disulfonicacid,naphthalene-2-sulfonicacid,nicotinicacid,nitricacid,oleicacid,oxalicacid,palmiticacid,pamoicacid,phosphoricacid,proprionicacid,1-pyroglutamicacid,salicylicacid,sebacicacid,stearicacid,succinicacid,sulfuricacid,1-tartaricacid,thiocyanicacid,p-toluenesulfonicacid,trifluoroaceticacid和undecylenicacidacidsalts.
可药用的酸盐还可以存在多种溶剂化物，例如与水、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺等形成的溶液。也可以制备此类溶剂化合物的混合物。这种溶剂化合物的来源可以是结晶物溶剂，以及用来制备、结晶或不确定的固有溶剂。
药物成分中也可以含有润湿剂、乳化剂和润滑剂如月桂酸硫酸金钠和硬脂酸镁、着色剂、缓释剂、包衣剂、增甜剂、调味剂和增香剂、防腐剂和抗氧化剂。
可药用的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(bha)，丁基化羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
合成方法
从一方面讲，本文公开提供了一种制备聚合物纳米颗粒的方法，该方法包括：组合i)多种运输单体，每个运输单体偶联至少一个运输基团；ii)多种交联单体；iii)多种试剂单体，每个与至少一种生物活性剂偶联；iv)溶剂；以及用引发剂引发单体的共聚。在某些实施方案中，结合还包括与多个靶向基团结合。在某些实施方案中，结合还包括与多种稳定单体结合。
从另一方面，本文公开提供了一种制备聚合物纳米颗粒的方法，该方法包括：i)组合多个运输单体，每个运输单体偶联至至少一个运输基团；ii)多种交联单体；iii)多种生物活性剂；iv)溶剂；以及用引发剂引发单体的共聚。在某些实施方案中，生物活性剂选自蛋白质，多核苷酸和显像剂。在某些实施方案中，生物活性剂和单体的摩尔比为约5,000：1至12,000。在某些实施方案中，生物活性剂和单体的摩尔比为约5,000：1。在某些实施方案中，生物活性剂和单体的摩尔比为约12,000：1。在某些实施方案中，生物活性剂和单体的摩尔比为约500∶1。在某些实施例中，组合还包括与多个目标组合基团。在某些实施例中，组合还包括与多个稳定单体。在某些实施例中，组合还包括组合具有多个亲水基团。
在另一方面，本公开提供了一种制备聚合物纳米颗粒的方法，该方法包括：组合i)多种交联单体；和ii)多种试剂单体，每个与至少一种生物活性剂偶联；iii)溶剂；以及用引发剂引发单体的共聚。在某些实施方案中，结合还包括与多个转运基团结合。在某些实施方案中，与多个转运基团结合包括与多个转运单体结合，每个转运单体偶联至至少一个转运基团。在某些实施方案中，结合还包括与多个靶向基团结合。在某些实施方案中，结合还包括与多种稳定单体结合。
在另一方面，本公开提供了一种制备聚合物纳米颗粒的方法，该方法包括：组合i)多种单体，每一种均与至少一个运输基团偶联；和ii)多种交联单体；iii)溶剂；以及用引发剂引发单体的共聚。在某些实施方案中，结合还包括与多种生物活性剂结合。在某些实施方案中，与多种生物活性剂组合包括与多种试剂单体组合，每个单体与至少一种生物活性剂偶联。在某些实施方案中，结合还包括与多个靶向基团结合。在某些实施方案中，结合还包括与多种稳定单体结合。在某些实施方案中，引发剂选自自由基引发剂，亲核引发剂和电化学引发剂。在某些实施方案中，本文公开的合成方法还包括至少一个纯化步骤。在某些实施方案中，纯化步骤是离心。在某些实施方案中，纯化步骤是过滤。
定义
除非本文另有定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应符合本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文描述的与化学，细胞和组织培养，分子生物学，细胞和癌症生物学，神经生物学，神经化学，病毒学，免疫学，微生物学，药理学，遗传学和蛋白质以及核酸化学结合使用的术语和技术，在本领域中是众所周知的且常用的。
本公开文中的方式和技术具有普适性，除非另外指出，本公开文引用和讨论部分引用本领域众所周知的常规方法以及参考文献中具体描述的特殊方法。具体可参考，例如：“神经科学原理”,mcgraw-hillmedical,newyork,n.y.(2000)；或motulsky，“直观的生物统计学”，oxforduniversitypress,inc.(1995)；lodish等人,“分子细胞生物学，第四版”w.h.freeman&co.,newyork(2000)；griffiths等人,“遗传分析简介，第7版”,w.h.freeman&co.,n.y.(1999)；andgilbert等人,“发展生物学，第六版”sinauerassociates,inc.,sunderland,ma(2000).
除非本文另有定义，否则本文所用的化学术语根据本领域的常规用法定义，例如“麦格劳-希尔化学词典术语”,parkers.,ed.,mcgraw-hill,sanfrancisco,c.a.(1985).
术语“酰基”为本领域公认定义由通式烃基c(o)-，首选烷基c(o)-表示的基团。
术语“酰基氨基”是本领域公认定义被酰基取代的氨基，并且可以例如由式烃基c(o)nh-表示。
术语“酰氧基”是本领域公认定义由通式烃基c(o)o-，首选烷基c(o)o-表示的基团。
术语“烷氧基”是本领域公认定义其上连接有氧的烷基，首选低级烷基。代表性的烷氧基包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，叔丁氧基等。
术语“烷氧基烷基”是本领域公认定义被烷氧基取代的烷基，并且可以由通式烷基-o-烷基表示。
术语“烯基”是本领域公认定义含有至少一个双键的脂族基团，并且应当包括“未取代的烯基”和“取代的烯基”，后者指的是在烯基的一个或多个碳上具有取代氢的烯基基团。这样的取代基可以出现在一个或多个双键中的一个或多个碳上。而且如下所述，除非稳定性受限，这些取代基包括所有用于烷基的取代基。例如，可以考虑用一个或多个烷基，碳环基，芳基，杂环基或杂芳基取代烯基。
“烷基”或“烷烃”是本领域公认定义完全饱和的直链或支链非芳族烃。通常，直链或支链烷基具有大约1至20个碳原子，首选1至约10个碳原子。直链和支链烷基的实例包括甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，己基，戊基和辛基。c1-c6的直链或支链烷基也称为“低级烷基”。
此外，在整个说明，范例以及声明中使用的术语“烷基”(或“低级烷基”)旨在包括“未被取代的烷基”和“取代后的烷基”，后者是指在烃主链的一个或多个碳上的氢由取代基取代的烷基基团。如果没有另外指定，则此类取代基可包括例如卤素，羟基，羰基(例如羧基，烷氧基羰基，甲酰基或酰基)，硫代羰基(例如硫代酸酯，硫代乙酸酯)，或硫代甲酸酯)，烷氧基，磷酰基，磷酸盐，膦酸酯，次膦酸酯，氨基，酰胺基，脒基，亚胺，氰基，硝基，叠氮基，巯基，烷硫基，硫酸盐，磺酸盐，氨磺酰基，磺酰胺基，磺酰基，杂环基，芳烷基或芳族或杂芳族基团。根据本领域技术发展水平及技术人员理解，设计适合反应条件，烃链上的基团本身可以被取代。例如，取代的烷基的取代基可包括氨基，叠氮基，亚氨基，酰胺基，磷酰基(包括膦酸酯和次膦酸酯)，磺酰基(包括硫酸酯，磺酰胺基，氨磺酰基和磺酸酯)和甲硅烷基的取代和未取代形式作为醚，烷硫基，羰基(包括酮，醛，羧酸盐和酯)，-cf3，-cn等。示例性的取代的烷基描述如下。环烷基可以进一步被烷基，烯基，烷氧基，烷硫基，氨基烷基，羰基取代的烷基，-cf3，-cn等取代。
当与化学基团，例如酰基，酰氧基，烷基，烯基，炔基或烷氧基结合使用时，术语“cx-y”是指包括在链中包含x至y个碳的基团。例如，术语“cx-y烷基”是指取代或未取代的饱和烃基，包括在链中包含x至y碳的直链烷基和支链烷基，包括卤代烷基，例如三氟甲基和2,2,2-三氟乙基等。共烷基表示氢在该基团位于末端位置的位置，如果是内部则表示键。术语“c2-y烯基”和“c2-y炔基”是指取代的或未取代的不饱和脂族基团，其长度和可能与上述烷基相似，但是分别含有至少一个双键或三键。
本文所用的术语“烷基氨基”是指被至少一个烷基取代的氨基。
术语“烷硫基”,如本文所述，是指被烷基取代的硫醇基，并且可以由通式烷基s-表示。如本文所用，术语“炔基”是指含有至少一个三键的脂族基团，并且旨在包括“未取代的炔基”和“取代的炔基”，后者是指具有取代基取代氢的炔基部分。在炔基的一个或多个碳上。这样的取代基可以出现在一个或多个三键中包含或不包含的一个或多个碳上。此外，如上所述，这些取代基包括所有考虑用于烷基的取代基，除非在稳定性上是不允许的。例如，可以考虑用一个或多个烷基，碳环基，芳基，杂环基或杂芳基取代炔基。
如本文所用，术语“酰胺”是指基团
其中每个r10独立地代表氢或烃基，或两个r10与它们所连接的n原子一起构成在环结构中具有4至8个原子的杂环。
术语“胺”和“氨基”是本领域公认定义未取代的和取代的胺及其盐，例如可以由下式表示的部分
其中每个r10独立地代表氢或烃基，或两个r10与它们所连接的n原子一起构成在环结构中具有4至8个原子的杂环。
术语“脒基”是本领域公认定义由通式表示的基团
如本文所用，术语“氨基烷基”是本领域公认定义被氨基取代的烷基。
本文所用的术语“芳烷基”是本领域公认定义被芳基取代的烷基。
本文所用的术语“芳基”是本领域公认定义取代或未取代的单环芳族基团，其中环的每个原子为碳。首选，该环是5至7元环，更优选地是6元环。术语“芳基”还包括具有两个或多个环的多环系统，其中两个或多个碳原子与两个相邻的环共有，其中至少一个环是芳族的，例如，其他环可以是环烷基，环烯基，环炔基，芳基，杂芳基和/或杂环基。芳基包括苯，萘，菲，苯酚，苯胺等。
术语“氨基甲酸酯”是本领域公认定义
其中r9和r10独立地代表氢或烃基，例如烷基，或r9和r10与中间原子一起构成在环结构中具有4至8个原子的杂环。
如本文所用，术语“碳环”和“碳环的”是指每个原子是碳的饱和或不饱和的环。术语碳环包括芳族碳环和非芳族碳环。非芳族碳环包括其中所有碳原子均饱和的环烷烃环和包含至少一个双键的环烯烃环。“碳环”包括5-7元单环和8-12元双环。双环碳环的每个环可选自饱和，不饱和和芳族环。碳环包括其中两个环之间共享一个，两个或三个或更多个原子的双环分子。术语“稠合碳环”是指双环碳环，其中每个环与另一个环共享两个相邻的原子。稠合碳环的每个环可选自饱和，不饱和和芳族环。在一个示例性的实施方案中，芳环例如苯基可以稠合到饱和或不饱和环，例如环己烷，环戊烷或环己烯上。在价环允许的范围内，饱和，不饱和和芳族双环的任何组合均包括在碳环的定义中。示例性的“碳环”包括环戊烷，环己烷，双环[2.2.1]庚烷，1，5-环辛二烯，1,2,3,4-四氢萘，双环[4.2.0]辛-3-烯，萘和金刚烷。示例性的稠合碳环包括萘烷，萘，1,2,3,4四氢萘，双环[4.2.0]辛烷，4,5,6,7-四氢-1h-茚和双环[4.1.0]庚-3-烯。“碳环”可以被取代在能够带有氢原子的任何一个或多个位置上。
“环烷基”基团是完全饱和的环状烃，包括单环和双环。除非另有定义，单环环烷基通常具有3至约10个碳原子，更通常3至8个碳原子。双环环烷基的第二环可以选自饱和，不饱和和芳族环。环烷基包括其中两个环之间共享一个，两个或三个或更多个原子的双环分子。术语“稠合的环烷基”是指双环环烷基，其中每个环与另一个环共享两个相邻的原子。稠合双环环烷基的第二环可以选自饱和，不饱和和芳族环。“环烯基”基团是含有一个或多个双键的环烃。
本文所用的术语“碳环基烷基”是本领域公认定义被碳环基团取代的烷基。
术语“碳酸酯”是本领域公认定义-oco2-r10基团，其中r10表示烃基。
如本文所用，术语“羧基”是本领域公认定义-co2h表示的基团。
如本文所用，术语“酯”是本领域公认定义基团-c(o)or10，其中r10表示烃基。
如本文所用，术语“醚”是本领域公认定义通过氧与另一烃基连接的烃基。因此，烃基的醚取代基可以是烃基-o-。醚可以是对称的也可以是不对称的。醚的实例包括但不仅限于杂环-o-杂环和芳基-杂环。醚包括“烷氧基烷基”，其可以由通式烷基-o-烷基表示。
术语“胍基”是本领域公认定义通式
本文所用的术语“卤代”和“卤素”是指卤素，包括氯，氟，溴和碘。
本文所用的术语“杂烷基”和“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基。
如本文所用，术语“杂烷基”是指碳原子和至少一个杂原子的饱和或不饱和链，其中没有两个杂原子相邻。
术语“杂芳基”和“杂芳基”包括取代或未取代的芳族单环结构，首选5至7元环，更优选5至6元环，其环结构包括至少一个杂原子，首选1至4个杂原子，更优选一个或两个杂原子。术语“杂芳基”和“杂芳基”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳对于两个相邻的环是共有的，并且其中至少一个环是杂芳族，例如，其他环可以是：环烷基，环烯基，环炔基，芳基，杂芳基和/或杂环基。杂芳基基团包括例如吡咯，呋喃，噻吩，咪唑，恶唑，噻唑，吡唑，吡啶，吡嗪，哒嗪和嘧啶等。
本文所用的术语“杂原子”是指除碳或氢以外的任何元素的原子。首选的杂原子是氮，氧和硫。
术语“杂环基”，“杂环”和“杂环的”是指取代或未取代的非芳族环结构，首选3至10元环，更优选3至7元环，其环结构至少包括一个杂原子，首选1-4个杂原子，更优选一个或两个杂原子。术语“杂环基”和“杂环的”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳对于两个相邻的环是共用的，其中至少一个环是杂环的，例如，其他环可以是环烷基，
环烯基，环炔基，芳基，杂芳基和/或杂环基。杂环基包括例如哌啶，哌嗪，吡咯烷，吗啉，内酯，内酰胺等。
本文所用的术语“杂环基烷基”是指被杂环基取代的烷基。
如本文所用，术语“烃基”是指通过不具有＝0或＝s取代基的碳原子键合的基团，并且通常具有至少一个碳氢键和主要的碳骨架，可以有选择地包括杂原子。因此，就本申请而言，诸如甲基，乙氧基乙基，2-吡啶基和三氟甲基的基团被认为是烃基，但是诸如乙酰基(在连接碳上具有一个＝0取代基)和乙氧基(通过氧连接，而不是碳)则不是烃基。烃基包括但不限于芳基，杂芳基，碳环，杂环基，烷基，烯基，炔基及其组合。
本文所用的术语“羟烷基”是指被羟基取代的烷基。
术语“肼基”是本领域公认定义由通式
术语“低级”与化学部分，例如酰基，酰氧基，烷基，烯基，炔基或烷氧基结合使用时，是指包括在取代基中有十个或更少的非氢原子的基团，首选六个或更少。例如，“低级烷基”是指含有十个或更少，首选六个或更少的碳原子的烷基。在某些实施方案中，本文所定义的酰基，酰氧基，烷基，烯基，炔基或烷氧基取代基分别是低级酰基，低级酰氧基，低级烷基，低级烯基，低级炔基或低级烷氧基，无论它们是单独出现还是与其他取代基组合出现，例如在叙述中，羟烷基和芳烷基((在这种情况下，例如，当计算烷基取代基中的碳原子时，不计算芳基中的原子)。
术语“磷酸盐”是本领域公认定义通式
术语“多环基”，“多环”和“多环”是指两个或多个环(例如，环烷基，环烯基，环炔基，芳基，杂芳基和/或杂环基)。
术语“多环基”，“多环”和“多环”是指两个或更多个环(例如，环烷基，环烯基，环炔基，芳基，杂芳基和/或杂环基)，其中两个或更多个原子是两个相邻环共用的，例如，“稠环”。多环的每个环可以被取代或不被取代。在某些实施方案中，多环的每个环在环中包含3至10个原子，首选5至7个原子。
术语“甲硅烷基”是指具有三个与其连接的烃基部分的硅部分。
术语“甲硅烷氧基”是指带有甲硅烷基的氧部分。
术语“取代的”是指由取代基取代了骨架上一个或多个碳原子上氢原子的部分。可理解为“取代”或“被...取代”包括隐含的条件，即该取代是根据取代原子和取代基的允许化合价的，并且该取代会产生稳定的化合物，例如，其不会自发进行通过重排，环化，消除等的转化步骤。如本文所用，术语“取代的”拟包括所有允许的有机化合物的取代基。在广义上，允许的取代基包括有机化合物的无环和环状，支链和非支链，碳环和杂环，芳族和非芳族取代基。对于合适的有机化合物，允许的取代基可以是一个或多个并且相同或不同。为了本发明的目的，杂原子例如氮可以具有氢取代基和/或本文描述的满足杂原子化合价的有机化合物的任何允许的取代基。取代基可包括本文所述的任何取代基，例如卤素，羟基，羰基(例如羧基，烷氧基羰基，甲酰基或酰基)，硫代羰基(例如硫代酸酯，硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)，烷氧基，磷酰基，磷酸盐，膦酸酯，次膦酸酯，氨基，酰胺基，脒基，亚胺，亚胺基，氰基，硝基，叠氮基，巯基，烷硫基，硫酸根，磺酸根，氨基磺酰基，磺酰胺基，磺酰基，杂环基，芳烷基或芳族或杂芳族部分。根据本领域技术发展水平及技术人员理解，设计适合反应条件，取代基本身可以被取代。除非特别声明为“未取代的”，否则本文中提及的化学部分应理解为包括取代的变体。例如，提及“芳基”基团或部分隐含包括取代和未取代的变体。
术语“硫酸盐”是本领域公认定义基团-oso3h或其药学上可接受的盐。
术语“磺酰胺”是本领域公认定义由通式
术语“亚砜”是本领域公认定义基团-s(o)-r10，其中r10表示烃基。
术语“磺酸盐”是本领域公认定义基团so3h或其药学上可接受的盐。
术语“砜”是本领域公认定义基团-s(o)2-r10，其中r10代表烃基。
本文所用的术语“硫代烷基”是本领域公认定义被硫醇基取代的烷基。
如本文所用，术语“硫酯”是本领域公认定义基团-c(o)sr10或-sc(o)r10，其中r10表示烃基。
如本文所用，术语“硫醚”等同于醚，其中氧被硫取代。
术语“尿素”是本领域公认定义由通式
“保护基”是指当连接至分子中的反应性官能团时掩蔽，降低或防止该官能团的反应性的原子团。通常，可以在合成过程中根据需要选择性地除去保护基。保护基的实例可以在纽约州johnwiley父子以及harrison等人所著greene和wuts的《有机化学中的保护基》，第三版，1999年，以及纽约州johnwiley父子所著《合成有机方法简编》，vols.1-8，1971至1996年，中找到。代表性的氮保护基包括但不限于甲酰基，乙酰基，三氟乙酰基，苄基，苄氧羰基(“cbz”)，叔丁氧羰基(“boc”)，三甲基甲硅烷基(“tms”)，2-三甲基甲硅烷基-乙磺酰基(“tes”)，三苯甲基和取代的三苯甲基，烯丙基氧羰基，9-芴基甲氧羰基(“fmoc”)，硝基过碳酰氧羰基(“nvoc”)等。代表性的羟基保护基包括但不限于羟基被酰化(酯化)或烷基化的那些，例如苄基和三苯甲基醚，以及烷基醚，四氢吡喃基醚，三烷基甲硅烷基醚(例如tms或tips基团)，乙二醇醚，例如乙二醇和丙二醇衍生物以及烯丙基醚。
如本文所用，术语“可降解的”和“不可降解的”是指本文所述的聚合物降解成较小片段的能力。在本发明的某些实施方案中，可降解的聚合物可以在生理ph值下分解。在某些实施方案中，可降解的聚合物可在约ph7.4下分解。在某些实施方案中，可降解和不可降解聚合物的混合物可产生可降解聚合物混合物。在某些实施方案中，可降解和不可降解聚合物的混合物可在生理ph下分解。在某些实施方案中，可降解和不可降解聚合物的混合物可在约ph7.4下分解。
带正电的单体，交联剂和中性单体的例子在美国专利申请公开号表1，表2，表3中提供。美国专利号us2015/0071999，其全部内容通过引用合并于此。
如本文所用，术语“靶向部分”是指部分(例如，抗体，激素，激素衍生物，叶酸，基因，叶酸衍生物，生物素，分子，寡肽，sigma-2-配体，细胞膜糖类，用于将缀合物靶向或引导至特定位置(例如细胞类型或患病组织)或相互作用(例如特异性结合事件)。
在本申请中引用的所有上述其他出版物，专利和公开的专利申请皆特别通过引用结合在此。一旦发生冲突，皆以本说明书，包括其具体定义为准。
本文使用的术语“试剂”表示化合物(例如有机或无机化合物，化合物的混合物)，生物大分子(例如核酸，抗体，包括其部分以及人源化的化合物)嵌合体，人抗体和单克隆抗体，蛋白质或其部分(例如肽，脂质，碳水化合物)或由生物材料(例如细菌，植物，真菌或动物(尤其是哺乳动物)细胞)制成的提取物，或组织。药剂包括，例如，结构已知的药剂和结构未知的药剂。此类试剂抑制ar或促进ar降解的能力可使其在本公开的方法和组合物中适合作为“治疗剂”。
如本文所用，术语“生物活性剂”是指可以与治疗性或诊断性应用结合使用的物质，例如，用于诊断患者中疾病存在或不存在的方法和/或用于治疗患者疾病的方法。“生物活性剂”是指能够在体外和/或体内发挥生物学作用的物质。生物活性剂可以是中性，带正电或带负电的。合适的生物活性剂包括例如前药，显像剂，诊断剂，治疗剂，药物，药物，氧气输送剂，血液替代品，合成有机分子，蛋白质，肽，维生素，类固醇，类固醇类似物和遗传物质，包括核苷，核苷酸和多核苷酸。
“患者”，“受试者”或“个体”可互换使用，是指人类或非人类动物。这些术语包括哺乳动物，例如人，灵长类，家畜(包括牛，猪等)，伴侣动物(例如犬，猫等)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。
“治疗”病症或患者是指采取步骤以获得有益或期望的结果，包括临床结果。如本文所用以及本领域众所周知的，“治疗”是获得有益或期望结果，包括临床结果的方法。有益或理想的临床结果可包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或状况，疾病程度的减轻，疾病状态的稳定(即不恶化)，预防疾病的传播，延迟或减慢疾病进展，疾病状态的改善或缓解以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可能意味着延长与未接受治疗的预期生存相比的生存率。
术语“预防”是本领域公认的，并且当与诸如局部复发(例如，疼痛)病症，诸如癌症类疾病，诸如心力衰竭的综合症或任何其他医学病症，相对于不接受该组合物的受试者，该组合物的给药可减少受试者中医学病症得发病频率或延迟其发作。因此，癌症的预防包括，例如，相对于未治疗的对照人群，接受预防性治疗的患者人群中可检测到癌症病例数目减少，和/或相对于未经治疗的人群，治疗人群中可检测到的癌症发病时间在如统计上和/或临床上有明显推迟增长。
如本文所用，短语“联合施用”是指两种或更多种不同治疗剂的任何形式的施用，使得在先前施用的治疗剂在体内仍然有效的同时施用第二种药物(例如，两种药物同时使用)。对患者有效(可能包括两种药物的协同作用)。例如，不同的治疗化合物可以相同制剂或分开制剂的形式给药，譬如伴随地或顺序地给药。因此，接受这种治疗的个体可以受益于不同治疗剂的联合作用。
本文使用的“制药学上可接受的盐”或“盐”是指适于或与患者的治疗相容的酸性加成盐或碱性加成盐。
本文所用的术语“制药学上可接受的酸加成盐”是指任何基础化合物的任何无毒的有机或无机盐。形成合适的盐的示例性无机酸包括盐酸，氢溴酸，硫酸和磷酸，以及金属盐，例如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾。形成合适的盐的说明性有机酸包括一元，二元和三元羧酸，例如乙醇酸，乳酸，丙酮酸，丙二酸，琥珀酸，戊二酸，富马酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，抗坏血酸，马来酸，苯甲酸，苯乙酸，肉桂酸和水杨酸。酸以及磺酸，例如对甲苯磺酸和甲磺酸。可以形成单酸盐或二酸盐，并且这些盐可以以水合，溶剂化或基本上无水的形式存在。通常，化合物的酸加成盐更易溶于水和各种亲水性有机溶剂，并且与它们的游离碱形式相比，通常显示出更高的熔点。合适的盐的选择对本领域技术人员是已知的。可以使用其他非药学上可接受的盐，例如草酸盐，例如，在分离化合物以供实验室使用时，或随后转化为药学上可接受的酸加成盐。
本文所用的术语“制药学上可接受的碱性加成盐”是指任何酸化合物的任何无毒的有机或无机碱加成盐。形成合适的盐的示例性无机碱包括锂，钠，钾，钙，镁或氢氧化钡。形成合适的盐的说明性有机碱包括脂族，脂环族或芳族有机胺，例如甲胺，三乙胺和甲基吡啶或氨。合适的盐的选择是本领域技术人员已知的。
本文所用的短语“制药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料，组合物或媒介物，例如液体或固体过滤器，稀释剂，赋形剂，溶剂或包囊材料，可用于配制药物或治疗用途的药物。
实施例
现在正在被普遍描述的发明，通过参考下面的例子将更容易理解，这些例子仅仅是为了说明本发明的某些方面和实施例，而无意于限制本发明。
实施例1:血-脑屏障(bbb)穿透性蛋白纳米颗粒向中枢神经系统的复合物传递
首先将辣根过氧化物与n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)偶联，以将丙烯酰基附着在其表面上。通过用荧光胺测定法测量蛋白质分子上的残留(未反应)赖氨酸来确定缀合至蛋白质分子上的丙烯酰基的平均数，约为4.5。
丙烯酰氧基化后，使用原位聚合方法将蛋白质包封。首先将mpc和交联剂双-甲基丙烯酰胺(bis)分别制备为在去离子水中的40％(m/v)和在无水dmso中的10％(m/v)的储备溶液。然后将mpc和bis分别以5000：1(mpc与hrp蛋白)和500：1(bis与hrp蛋白)的摩尔比封装到hrp蛋白(1mg/ml)溶液中。通过添加aps(300：1)和temed(1200：1)引发聚合反应，并在4℃下保持2小时。聚合后，将溶液用磷酸盐缓冲溶液(pbs)渗析以除去未反应的单体和副产物。用疏水相互作用柱(苯基-sepharosecl-4b)进一步纯化辣根过氧化物纳米颗粒(nhrp)，以除去任何未包封的辣根过氧化物。使用透射电子显微镜(tem)检查nhrp，显示出均匀的球形，平均直径为-30nm。通过静脉内注射将hrp纳米颗粒以2.5、5.0和10.0mg/kg的剂量施用于非人灵长类动物(猕猴)。静脉注射后，每天收集血浆2周，并在第1、4、7、10和14天收集脑脊髓液(csf)。nhrp在血浆中的循环时间延长，可以检测到注射后2周。使用tem检查静脉注射10mg/kgn-hrp后第一天收集的脑脊髓液(csf)，显示存在与nhrp形态和大小相似的颗粒。由于csf几乎不含蛋白质，并且粒径比血蛋白大得多，因此csf样品的tem图像中显示的纳米粒子是穿过bbb到csf的nhrp。该研究清楚地表明将nhpr成功递送至csf。
血浆和脑脊液中n-hrp的浓度通过tmb底物试剂盒(thermofisherscientific，美国)进行定量。在第一天，注射2.5mg/kg，5.0mg/kg和10.0mg/kgn-hrp的猕猴的csf中nhrp的浓度为5.57ng/ml，24.17ng/ml和68.21ng/ml，分别相当于血浆中nhrp浓度的1.12％，2.63％和1.99％。这表明nhrp以剂量依赖性方式被递送至csf。注射后第4天，csf中nhrp的浓度达到血浆浓度的-5.3％。
实施例2：将治疗性蛋白质递送至猴子的中枢神经系统(cns)
尼妥珠单抗蛋白可通过原位聚合直接包裹，而无需进行丙烯酰化反应。以mpc为单体。聚(dl-丙交酯)-b-聚(乙二醇)-b-聚(dl-丙交酯)-二丙烯酸三嵌段共聚物(pla-peg-pladiac)和甘油二甲基丙烯酸酯(gdma)被用作可降解的交联剂。将mpc，pla-peg-pla共聚物和gdma以12000：1(mpc与蛋白质)，500：1(pla-peg-pla共聚物与蛋白质)的摩尔比添加到尼妥珠单抗蛋白质溶液(2.2mg/ml)中)和500：1(从gdma到蛋白质)。通过在4℃下添加aps(2000：1)和temed(8000：1)3小时来引发聚合反应。聚合后，将溶液用离心过滤器单元浓缩以除去未反应的单体和副产物。用疏水相互作用柱(苯基-琼脂糖凝胶cl-4b)进一步纯化蛋白质纳米颗粒，以去除未包封的蛋白质。
为了评估cns的递送效率，通过静脉内注射以5.0mg/kg的剂量将尼妥珠单抗纳米颗粒给予非人灵长类动物(恒河猴)。静脉内给药后，在注射后1、2、3、5、7、10、14和17天收集血浆，并在第3、10和17天收集csf。尼妥珠单抗和尼妥珠单抗纳米颗粒(n-rituximab)均表现出恒河猴猕猴血浆中的循环时间同样长。服用天然尼妥珠单抗的猴子的脑脊液浓度明显低于使用尼妥珠单抗纳米颗粒的猴子(高5-15倍)。在单次静脉内注射后第17天，用尼妥珠单抗纳米颗粒给药的猴子在csf中观察到高浓度的尼妥珠单抗。与之形成鲜明对比的是，用天然尼妥珠单抗给药的猴子在第2周之前无法检测到csf中的尼妥珠单抗。
实施例3：治疗小鼠的脑肿瘤
使用mpc和具有vplgvrtk氨基酸序列的肽交联剂合成尼妥珠单抗(n(nimotuzumab))的纳米颗粒，该肽可以被肿瘤蛋白酶降解。
在冰浴下使用磷酸盐缓冲液(20mm，ph＝7.4)将尼妥珠单抗溶液(5mg/ml)稀释至1mg/ml。将在100mg/ml水溶液中制备的n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(apm)加入到蛋白质溶液中，在4℃下搅拌10分钟。通过静电和疏水相互作用，apm在尼莫妥单抗周围富集。在快速搅拌下，将2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和双丙烯酰化的vplgvrtk肽依次加入到蛋白质溶液中。将mpc：apm：交联剂的摩尔比调节为50：5：1。通过将溶解在去离子水中的过硫酸铵(总单体的摩尔比为1:10)和等体积的10％(w/v)n，n，n'，n'-四甲基乙二胺添加到自由基溶液中引发自由基聚合。在4℃下在氮气氛中使聚合进行90-120分钟。最后，通过在pbs(20mm，ph＝6.5)中进行透析除去未反应的单体，交联剂和引发剂。透析后，将尼妥珠单抗纳米颗粒通过重力通过sephadexg-200色谱柱以除去未包封的尼妥珠单抗抗体。
为了建立颅内肿瘤模型，将u87-egfrwt细胞用萤光素酶慢病毒感染(genepharma，中国上海)。感染2天后，收集5x105细胞，并用立体定向仪将其注入5周龄雌性nu/nu-nude小鼠的颅内纹状体中。每隔一天用天然尼妥珠单抗或尼妥珠单抗纳米颗粒(5mg/kg体重，静脉内注射)治疗小鼠，直到给予9剂。肿瘤细胞注射后3天开始治疗。在对照组中，每只动物静脉内注射。100ia的无菌pbs。每组有9只小鼠。为了通过生物发光成像获得不同治疗组的活体动物的肿瘤生长状态，麻醉小鼠，腹膜内注射50mg/mld-荧光素(中国，promega)，并使用ivis成像系统(caliperlifesciences)成像10-120秒。
与对照组和天然尼妥珠单抗治疗组相比，用尼妥珠单抗纳米颗粒治疗的小鼠的肿瘤显示出显着抑制的进展。在最后一次注射后(第20天)，收集每组荷瘤脑组织以最终证实尼妥珠单抗纳米颗粒的治疗效果。he染色结果表明，与天然尼莫妥单抗治疗相比，尼妥珠单抗纳米颗粒治疗表现出显着的肿瘤生长减少。
实施例4：蛋白质缀合物的递送
通过将聚合物聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)(pmpc)与荧光标记的牛血清白蛋白(bsa)偶联来合成蛋白质偶联物。通过静脉内以5.0mg/kg的剂量将bsa缀合物注射到balb/c小鼠中。静脉注射后的第一天，比较了小鼠大脑的荧光强度。施用缀合物的小鼠显示出比注射pbs的小鼠高6倍的荧光强度，并且是注射天然bsa的小鼠高4倍的荧光强度。
实施例5：治疗小鼠的脑肿瘤
将尼莫妥珠单抗(nimotuzumab)递送至脑肿瘤的有效性归因于含有胆碱和乙酰胆碱类似物的mpc。为了验证，通过用乙烯基吡啶代替0％，50％和100％的mpc单体合成了一系列尼莫妥珠单抗纳米胶囊，乙烯基吡啶是一种用于合成具有长循环半衰期但没有bbb渗透能力的纳米胶囊的单体。该系列纳米胶囊包含不同含量的mpc，同时具有相似的大小和表面电荷。图7a和7b描绘了原位u87-egfrwt神经胶质瘤异种移植小鼠的体内生物发光图像和静脉内施用这种纳米胶囊4小时后收集的脑组织的离体荧光图像。用100％mpc制成的纳米胶囊治疗具有相似肿瘤大小的小鼠脑，与使用50％mpc制成的纳米胶囊相比，荧光强度增加了2.7倍。对于用0％mpc制成的纳米胶囊的小鼠，未观察到脑摄取。该观察结果表明，mpc制成的纳米胶囊
n(nimotuzumab)能够将(nimotuzumab)有效地递送至脑肿瘤。
纳米胶囊的bbb渗透可以归因于胆碱和乙酰胆碱受体介导的它们的胞吞作用。在注射cy5.5标记的n(nimotuzumab)之前20分钟，腹膜内注射含胶质瘤的小鼠1.25、2.5或5μg/kg胆碱转运蛋白抑制剂hemicholinium-3(hc-3)。图8a和8b描述了注射后4小时的原位u87-egfrwt神经胶质瘤异种移植小鼠的体内生物发光图像和大脑的体外荧光图像。hc-3剂量的增加显着降低了神经胶质瘤大脑的荧光强度，肿瘤大小和体重均无显着差异，表明胆碱转运蛋白介导n(nimotuzumab)进入大脑的转运。该方法为脑肿瘤治疗提供了有效的抗体递送策略。
实施例6：治疗大鼠脑缺血
平均分子量为2000da(mpeg)的丙烯酰胺(aam)，n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(apm)和聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯溶于脱氧去离子去脱氧核糖核酸酶水，并制备为10％(w/v)的原溶液。二甲基丙烯酸甘油酯(gdma)的无水dmso储备溶液以10％(w/v)来制备。然后将特定量的上述单体和交联剂添加到mirna溶液中，并调节aam/apm/mpeg/gdma的摩尔比以筛选合成参数。通过添加过硫酸铵(总单体的摩尔比为1/10)和n，n，n'，n'-四甲基乙二胺(aps的重量比为2倍)来引发聚合反应，并在4℃下保持2小时。通过脱氧去离子去脱氧核糖核酸酶水稀释，将最终的mirna浓度调节至5μm。聚合后，使用10kda膜将溶液在10mmpbs中透析，以除去未反应的单体和副产物。非pegn(mir-21)则通过相似的方法合成，无需使用mpeg。
短暂性局灶性脑缺血大鼠模型通过大脑中动脉闭塞再灌注(mcao/r)诱导。参见liu等人发表于(2013)biontaterials34,817-830的文章。将sd大鼠用10％的氯水(350mg/kg，腹膜内(i.p.))麻醉。监测体温并维持在37℃。在颈部腹侧切开中线切口，将肌肉轻轻拉到一边。然后，仔细解剖右颈总动脉和颈内外动脉交界处。结扎颈外动脉并烧灼。手术尼龙单丝(直径为0.234mm)，其尖端通过在火焰附近加热而变圆，通过颈外动脉残端的切口插入颈内动脉，以阻断大脑中动脉的起源。缺血1小时后，将细丝拉出以进行再灌注。
mirna纳米胶囊在脑缺血治疗中的体内应用已在由大脑中动脉阻塞再灌注(mcao/r)诱导的短暂局灶性脑缺血的大鼠模型中得到证实。用cy5.5(cy5.5-mir-21)标记的mir-211用于合成lipo/mir-21和n(mir-21)。然后，将这两个样品在缺血性损伤后第1天静脉注射，剂量分别为0.5毫克/千克mir-21。给药后24小时，使用荧光成像和qrt-pcr分析两个缺血性脑中样品的积累。
服用n(mir-21)的缺血大鼠在头部和孤立的脑组织中的荧光强度要高于使用lipo/mir-21的大鼠(图9a)。在缺血和非缺血大鼠中定量比较了由n(mir-21)或lipo/mir-21传递的mir-21的辐射效率。如图9b所示，在缺血大鼠中，n(mir-21)的辐射效率分别比lipo/mir-21和pbs对照高2倍和3.5倍，这表明n(mir-21)的辐射效率更高mir-21)。通过qrt-pcr进一步比较了缺血后脑组织中mir-21的表达(图9b)。与lipo/mir-21处理的大鼠相比，n(mir-21)处理的缺血大鼠脑中mir-21的含量高2.7倍，表明n(mir-21)增强了对缺血的调节与lipo/mir-21相比的脑组织。
fitc标记的mir-21用于进一步了解缺血性脑组织中n(mir-21)的分布。注射后24小时，将脑组织的缺血性半球分离，固定并染色。来自n(mir-21)的荧光信号比来自lipo/mir-21的荧光信号强得多，进一步证实了纳米胶囊在体内提高了mirna的递送效率(图10a)。此外，来自n(mir-21)的荧光信号的分布与细胞核染色和神经元标记染色的模式匹配。在图10b中定量地和具体地分析了神经元细胞中的递送效率。与lipo/mir-21相比，n(mir-21)显着改善了神经元传递。通过qrt-pcr进一步比较了分娩后脑组织中mir-21的表达。与用lipo/mir-21治疗的大鼠相比，用n(mir-21)治疗的大鼠大脑中的mir-21水平高2.7倍。
神经学评分在mcao/r后24小时评估得出，以确认实验成功建立了短暂局灶性脑缺血模型。参见liu等人于(2013)生物材料34,817-830发表的文章。试验员进行了行为评估双盲实验。根据以下描述对神经功能缺损进行评分：0，无缺损；1，难以充分伸展对侧前肢；2，无法延长对侧前肢；3，轻度向对侧盘旋；4，严重盘旋和5，跌落到对侧。选择神经功能缺损评分为1-3的大鼠作为模型。在评估神经学评分后，将大鼠进行致死麻醉，并收集脑片进行he染色，以证实成功建立了短暂局灶性脑缺血模型。
如图11所示，用pbs或n(mir-nc)处理的大鼠的平均神经功能缺损评分随时间仅略有改善；而用n(mir-21)处理的化合物则表现出显着改善的性能。在第7天收集脑组织以通过2,3,5-三苯四唑盐酸盐(ttc)染色评估梗塞体积。如图12和13所示，与用pbs或n(mir-nc)处理的大鼠相比，n(mir21)处理的大鼠的ttc染色的大脑显示出明显减少的梗塞体积(-45％)。
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