本发明属于生物医用材料领域，特别涉及一种复合型医用敷料及其制备方法。
背景技术：
：皮肤创伤愈合是指由于遭受外力作用，皮肤组织出现离断或缺损后的愈复过程，包括各种组织的再生和肉芽组织增生、瘢痕组织形成的复杂组合，表现出各种过程的协同作用。在世界范围内，大约2％的人正在忍受慢性皮肤伤口的病痛，每年有30万人因皮肤损伤而致死。尽管有许多新技术(包括生长因子和皮肤替代物)被广泛用于促进伤口愈合，但在大多数情况下，现有治疗方法能实现伤口愈合的百分比仅为50％～60％。大量的临床前和临床试验表明，间充质干细胞治疗可以加速伤口愈合，为各种难以愈合的慢性伤口的治疗带来了希望。在组织工程与再生医学领域，除了生物材料之外，种子细胞也是极为关键的一个要素。间充质干细胞具有较强的增殖、分化能力，且取材方便，同时不存在社会伦理争议已成为组织工程中的首选种子细胞。因此，将间充质干细胞负载于生物材料中，开发新型生物敷料，对于促进缺损组织的快速修复与增强组织修复效果都具有重要意义。技术实现要素：基于此，本发明的目的在于提供一种复合型医用敷料，以实现促进缺损组织的快速修复与增强组织修复效果。为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种复合型医用敷料的制备方法，包括以下步骤：(1)取去除了绒毛膜的羊膜，采用胰酶孵育过夜；(2)置于混合溶液中浸泡，所述混合溶液包括以下组分：羧甲基壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸钠；(3)滴加碳二亚胺交联，得生物支架；(4)将间充质干细胞与纤维蛋白原、明胶混合，得间充质干细胞凝胶剂；(5)将步骤(4)所述间充质干细胞凝胶剂涂抹于步骤(3)所述生物支架表面，即得。在其中一些实施例中，步骤(2)所述的混合溶液，每100ml混合溶液中，包括以下组分：在其中一些实施例中，步骤(2)所述的混合溶液，每100ml混合溶液中，包括以下组分：在其中一些实施例中，步骤(2)所述的置于混合溶液中浸泡，其特征在于，浸泡时间为2～6h。在其中一些实施例中，步骤(3)所述的滴加碳二亚胺交联为：滴加碳二亚胺3-5ml，交联20-60min。在其中一些实施例中，步骤(4)所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。在其中一些实施例中，步骤(4)所述的脐带间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：从脐带组织中剥离华通氏胶，剪碎、离心；弃上清，将沉淀物铺于培养皿中，待贴壁后加入培养基，培养，得脐带间充质干细胞。在其中一些实施例中，步骤(4)所述的间充质干细胞凝胶剂的制备方法包括以下步骤：制备得到含有质量百分比为8％～12％纤维蛋白原的间充质干细胞悬液，所述间充质干细胞悬液中细胞密度为4×106/ml～6×106/ml，和/或将所述间充质干细胞悬液，与明胶、生理盐水混合，即得间充质干细胞凝胶剂。在其中一些实施例中，步骤(4)所述的间充质干细胞凝胶剂的制备方法包括以下步骤：制备得到含有质量百分比为10％纤维蛋白原的间充质干细胞悬液，所述间充质干细胞悬液中细胞密度为5×106/ml，和/或将所述间充质干细胞悬液，与明胶、生理盐水按体积比为1：(4～6)：(1～3)混合，即得间充质干细胞凝胶剂。本发明的还提供了一种复合型医用敷料，具体技术方案如下：一种复合型医用敷料，由如上所述的复合型医用敷料的制备方法制备得到。基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：本发明通过含有羧甲基壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸钠的混合溶液浸泡处理生物羊膜，与碳二亚胺交联后制得生物支架，并将与纤维蛋白原混合制备得到的间充质干细胞凝胶剂涂抹于生物支架上，制备得到复合型的医用敷料。其中，生物支架上的羧甲基壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸钠之间合理配合，浸泡生物羊膜一方面大大提高了复合型医用敷料的力学性能和抗菌性能，另一方面与间充质干细胞凝胶剂中的活性间充质干细胞分泌的干细胞因子密切配合、共同作用，实现良好的组织修复以及促进皮肤伤口的快速愈合的效果。本发明所述的复合型医用敷料降解速度可控，细胞相容性好，可塑性强的特点以及医用敷料具有良好的组织修复效果，可促进皮肤伤口的快速愈合的效果。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本发明提供一种复合型医用敷料的制备方法，包括以下步骤：(1)取生物羊膜，胰酶孵育过夜；(2)置于混合溶液中浸泡，所述混合溶液包括以下组分：羧甲基壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸钠；(3)滴加碳二亚胺交联，得生物支架；(4)将间充质干细胞与纤维蛋白原混合，得间充质干细胞凝胶剂；(5)将步骤(4)所述间充质干细胞凝胶剂涂抹于步骤(3)所述生物支架表面，即得。优选地，步骤(2)所述的混合溶液，每100ml混合溶液中，包括以下组分：羧甲基壳聚糖5～15g；藻酸盐2～10g；丝素蛋白1～5g；透明质酸钠2～10g。进一步优选地，混合盐溶液每100ml含有羧甲基壳聚糖8～10g；藻酸盐6～8g；丝素蛋白3～4g；透明质酸钠4～6g。更优选地，混合盐溶液每100ml含有羧甲基壳聚糖10g、藻酸盐7g、丝素蛋白3.5g、透明质酸钠5g。其中，将生物羊膜置于混合溶液中浸泡的时长为2～6小时。一些实施例中，所述的滴加碳二亚胺交联为：滴加碳二亚胺3-5ml，交联20-60min。具体地，所述复合型医用敷料的制备方法如下：1)取剖腹产孕妇的胎盘，并经血清检测排除感染原；2)在无菌条件下，从胎盘的内层剥下羊膜，放置到无菌生理盐水中，反复冲洗去除羊膜表面的血迹，并去除羊膜的绒毛膜，用无菌生理盐水反复漂洗；3)将漂洗后的羊膜在抗生素溶液中浸泡3-7min，再在无菌生理盐水浸泡8-12min，此过程重复多次；4)置于-80℃和37℃环境中反复冻融2-4次后，在4℃条件下，置于在质量百分比为0.1％-0.5％的trypsin-edta水溶液中孵育过夜；5)再用含有血清的dmem培养基对其进行终止消化，用ph为7.2-7.4的pbs溶液冲洗多次；6)置于100ml含有5-15g羧甲基壳聚糖、2-10g藻酸盐、1-5g丝素蛋白、3-10g透明质酸钠等混合溶液中，浸泡2-6h；7)滴加碳二亚胺3-5ml、交联20-60min；8)室温风干，即得。可选地，所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。优选地，所述的脐带间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：从脐带组织中剥离华通氏胶，剪碎、离心；弃上清，将沉淀物铺于培养皿中，待贴壁后加入培养基，培养，得脐带间充质干细胞。优选地，所述的间充质干细胞凝胶剂的制备方法包括以下步骤：制备得到含有质量百分比为8％～12％纤维蛋白原的间充质干细胞悬液，所述间充质干细胞悬液中细胞密度为4×106/ml～6×106/ml；更优选为质量百分比为10％纤维蛋白原、细胞密度5×106/ml，将所述间充质干细胞悬液，与明胶、生理盐水混合，即得间充质干细胞凝胶剂。优选地，其中间充质干细胞悬液与明胶、生理盐水混合的体积比为1：(4～6)：(1～3)，更优选地，体积比为1:5:2。下面结合具体实施例对本发明进行更全面的说明：实施例1本实施例提供了一种复合型医用敷料的制备方法，具体步骤如下：(一)间充质干细胞的制备1)从脐带组织中剥离华通氏胶；2)将所有的华通氏胶体移至离心管中，加入生理盐水，用剪刀将其剪碎，离心；弃去上清，将组织沉淀平均分于培养皿中，待其贴壁加入脐带间充质干细胞培养基，放于37℃，5％二氧化碳培养箱培养；3)先对其进行半换液处理，待组织块周边会有间充质干细胞克隆出现，进行全换液处理；4)间充质干细胞融合度达到90％，弃去脐带组织块和原有培养液，生理盐水洗涤，弃去，加入胰酶，消化；5)所制得的细胞悬液经滤网过滤以去除残余的组织碎片，离心，弃去上清，加新鲜培养基重悬细胞沉淀，并以一定的比例进行传代。(二)含间充质干细胞凝胶的制备1)将步骤(一)所述的方法制备的脐带间充质干细胞胰酶消化，离心，去除上清液，用无菌含有10％纤维蛋白原的生理盐水重悬，调节细胞密度为5×106/ml得到含纤维蛋白原的脐带干细胞悬液；2)含纤维蛋白原的脐带干细胞悬液、明胶和生理盐水混合，得到含有脐带间充质干细胞的凝胶制剂。(三)生物支架的制备1)取剖腹产孕妇的胎盘，并经血清检测排除感染原；2)在无菌条件下，从胎盘的内层剥下羊膜，放置到无菌生理盐水中，反复冲洗去除羊膜表面的血迹，并去除羊膜的绒毛膜，用无菌生理盐水反复漂洗；3)将漂洗后的羊膜在抗生素溶液中浸泡3min，再在无菌生理盐水浸泡8min，此过程重复多次；4)置于-80℃和37℃环境中反复冻融2次后，在4℃条件下，置于在质量百分比为0.25％的trypsin-edta水溶液中孵育过夜；5)再用含有血清的dmem培养基对其进行终止消化，用ph为7.2-7.4的pbs溶液冲洗多次；6)置于100ml含有10g羧甲基壳聚糖、7g藻酸盐、3.5g丝素蛋白、5g透明质酸钠的混合溶液中，浸泡3h；7)滴加碳二亚胺4ml，交联30min；8)室温风干。(四)负载间充质干细胞的复合型医用敷料的制备1)将步骤(三)制备得到的生物支架剪成所需的大小和形状，放入细胞培养板或细胞培养皿表面，用乙醇浸泡材料以灭菌，然后用pbs漂洗材料，确保材料中的乙醇被除尽；2)将制备的含间充质干细胞凝胶涂抹于生物支架即得到负载间充质干细胞的复合型医用敷料。实施例2本实施例提供了一种复合型医用敷料的制备方法，与实施例1相比，其中，(三)生物支架的制备的步骤6)为：置于100ml含有5g羧甲基壳聚糖、2g藻酸盐、1g丝素蛋白、3g透明质酸钠的混合溶液中，浸泡2h；步骤7)为：滴加碳二亚胺3ml，交联20min。其余步骤与实施例1相同。实施例3本实施例提供了一种复合型医用敷料的制备方法，与实施例1相比，其中，(三)生物支架的制备的步骤6)为：置于100ml含有15g羧甲基壳聚糖、10g藻酸盐、5g丝素蛋白、10g透明质酸钠的混合溶液中，浸泡6h；步骤7)为：滴加碳二亚胺5ml，交联60min。其余步骤与实施例1相同。对比例1本对比例提供了一种复合型医用敷料的制备方法，与实施例1相比，其中，(三)生物支架的制备中，无步骤6)，即不将羊膜置于含有羧甲基壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸钠的混合溶液中浸泡，直接滴加碳二亚胺交联。其余步骤与实施例1相同。对比例2本对比例提供了一种复合型医用敷料的制备方法，与实施例1相比，无负载间充质干细胞。具体步骤如下：1)取剖腹产孕妇的胎盘，并经血清检测排除感染原；2)在无菌条件下，从胎盘的内层剥下羊膜，放置到无菌生理盐水中，反复冲洗去除羊膜表面的血迹，并去除羊膜的绒毛膜，用无菌生理盐水反复漂洗；3)将漂洗后的羊膜在抗生素溶液中浸泡3min，再在无菌生理盐水浸泡8min，此过程重复多次；4)置于-80℃和37℃环境中反复冻融2次后，在4℃条件下，置于在质量百分比为0.25％的trypsin-edta水溶液中孵育过夜；5)再用含有血清的dmem培养基对其进行终止消化，用ph为7.2-7.4的pbs溶液冲洗多次；6)置于100ml含有10g羧甲基壳聚糖、7g藻酸盐、3.5g丝素蛋白、5g透明质酸钠的混合溶液中，浸泡3h；7)滴加碳二亚胺4ml，交联30min；8)室温风干，即得复合型医用敷料。对比例3本对比例提供了一种复合型医用敷料的制备方法，与实施例1相比，(三)生物支架的制备的步骤6)为：置于100ml含有17g藻酸盐、3.5g丝素蛋白、5g透明质酸钠的混合溶液中，浸泡3h。其余步骤与实施例1相同。对比例4本对比例提供了一种复合型医用敷料的制备方法，与实施例1相比，(三)生物支架的制备的步骤6)为：置于100ml含有20.5g羧甲基壳聚糖、5g透明质酸钠的混合溶液中，浸泡3h。其余步骤与实施例1相同。实验例1复合型医用敷料中生物支架的性能检测实施例1～3及对比例1、对比例3所制得的生物支架，对其断裂强度(gb/t24218.3-2010)、断裂伸长率(gb/t24218.3-2010)、抗菌性能检测(gb15979-2002附录c)、体外细胞毒性(gb/t16886.5-2017)、迟发型超敏反应(gb/t16886.10-2017)、皮内反应(gb/t16886.10-2017)进行检测。结果如表1所示。表1复合型医用敷料中生物支架的性能检测结果检试项目实施例1实施例2实施例3对比例1对比例3对比例4断裂强度/cn/dtex2.882.372.111.522.561.68断裂伸长率/％868380758565抗菌性能检测/％989290706080体内细胞毒性无无无无无无迟发型超敏反应无无无无无无皮内反应无无无无无无由表1可见，本发明实施例1～3及对比例1、对比例3制备的生物支架的检测结果显示，各组均无皮肤刺激性、致敏反应及细胞毒性，对人体无害，实施例1～3的断裂强度、伸长率、抗菌性能等指标的效果优于对比例1，而对比例1制备生物支架时，羊膜未经过羧甲基壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸钠的处理，直接进行了碳二亚胺交联，说明羧甲基壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸钠混合溶液的浸泡不仅能够增强羊膜的机械性能，使得羊膜的断裂强度和断裂伸长率均提高，而且使得羊膜生物支架兼具有抗菌性能。而对比例3的抗菌效果相对于实施例1～3比实施例差，而对比例4中的机械性能和抗菌效果均较差，甚至对比例3的抗菌效果甚至较对比例1完全没有采用混合溶液对羊膜进行处理的更差，对比例3中缺少羧甲基壳聚糖，对比例4缺少了藻酸盐和丝素蛋白，其中打破了羧甲基壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸钠四种组分间形成的合理配合关系，导致其性能远不如实施例1～3。说明只有羧甲基壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸钠四种组分间形成的合理配合关系用于处理羊膜后，结合与碳二亚胺的交联，才能够实现制备得到的复合型医用敷料兼具优良的机械性能和抗菌效果。实验例2复合型医用敷料促进伤口愈合实验本实验检测复合型医用敷料对于新西兰兔伤口愈合情况的影响，具体步骤如下：1)选取21只健康新西兰兔，耳缘静脉消毒缓慢注射3％戊巴比妥钠溶液，待其完全麻醉后进行实验；2)用碘伏对新西兰兔的大腿部进行剃毛消毒，然后用手术刀作长度为1cm的创口，创口深至真皮层；3)出血后，先用普通灭菌纱布吸收血液，将实施例1～3及对比例1～3制得的复合型医用敷料，放于创口内，后缝合创面；每组各3只新西兰兔，各只新西兰兔单笼饲养；4)每天观察伤口的变化，观察各伤口的愈合情况，以伤口无炎症反应，伤口愈合完整为判断标准，统计新西兰兔伤口愈合的天数，结果如表2所示。表2复合型医用敷料促进伤口愈合情况可见，实施例1～3中，羊膜经过羧甲基壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸钠的处理，并交联碳二亚胺后，与间充质干细胞凝胶复合制备得到的复合型医用敷料，具有细胞相容性好，可塑性强的特点，具有良好的组织修复效果，可促进皮肤伤口的快速愈合；其中间充质干细胞具有活性可分泌各种细胞因子，进一步有利于促进伤口愈合。对比例1～3与实施例1～3相比，促进伤口愈合所需的时间稍长，主要是因为对比例1中直接在羊膜上交联碳二亚胺后涂膜了间充质干细胞，仅仅发挥了间充质干细胞分泌各种细胞因子促进伤口愈合的作用，未能实现间充质干细胞分泌的细胞因子与羧甲基壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸钠的配合，促进伤口愈合的效果没有实施例1～3好。对比例2中是直接在采用经过羧甲基壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸钠的处理的羊膜交联碳二亚胺作为复合型医用敷料，缺少间充质干细胞分泌细胞因子的配合效果，促进伤口愈合的效果较弱。对比例3与实施例1～3相比缺少了羧甲壳聚糖，其抗菌效果较差、促进伤口愈合的效果也较弱。对比例4中缺少了藻酸盐和丝素蛋白，其抗菌效果虽然较对比例3稍好，但使用对比例4作为敷料伤口愈合的时间更长，以上结果充分说明本发明实施例1～3中实现复合型医用敷料降解速度可控，细胞相容性好，可塑性强的特点以及复合型医用敷料具有良好的组织修复效果，可促进皮肤伤口的快速愈合的效果，需要间充质干细胞分泌细胞因子，并与羊膜生物支架上的羧甲基壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、透明质酸钠之间，各组分密切配合、共同作用，才得以实现的。实验例3实施例1～3及对比例1、3、4制得的复合型医用敷料的降解速度检测，具体操作步骤：(1)选取18只健康新西兰兔，耳缘静脉消毒缓慢注射3％戊巴比妥钠溶液，待其完全麻醉后进行实验；(2)用碘伏对兔子大腿部进行剃毛消毒，然后用手术刀作长1cm的创口，创口深至真皮层；(3)出血后，先用普通灭菌纱布吸收血液，将各样品裁剪成1×2cm长条，放于创口内，后缝合创口；(4)每天观察伤口的变化，待20d后拆线，观察各样品的降解情况。(5)每种敷料做三个平行实验，在置于创口内前分别记录敷料的重量，20d拆线后记录剩余敷料的重量，计算敷料剩余百分比及其平均数。实施例1中的三只新西兰兔伤口均已愈合，敷料无剩余。实施例2中一只新西兰兔伤口完全愈合，敷料无剩余，三只新西兰兔的敷料平均剩余1.32％。实施例3中敷料平均剩余2.55％。对比例1中敷料平均剩余5.43％。对比例3中敷料平均剩余7.15％。对比例4中敷料平均剩余7.23％。由结果可知，实施例1～3所述的复合型医用敷料降解速度可控，其降解速度均大于对比例差异显著(p<0.05)，且实施例1的降解速度最快。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12