利用干细胞重建毛囊的生发方法及应用与流程

本发明涉及生发
技术领域：
与干细胞领域，特别涉及一种利用毛囊干细胞重建毛囊的生发方法及其在生发领域的应用。
背景技术：
：脱发对人的整体外观形象影响较大，会衍生形成心理问题和生理问题，有时还会严重影响脱发者的正常生活。脱发的主要因素包括：遗传因素、病理因素、生理激素紊乱、营养不足以及其他因素等，人们也开发了很多治疗脱发的方法，如：强化头发的护理与养护，使用各种生发药物，进行各种饮食配方调理。但脱发问题始终不能有效解决，其根本原因在于我们并没有遵循头发生长发育的内在规律来解决脱发问题。头发的整个发育期包括四个阶段：生长期、退化期、休止期、新生期，脱发的根本原因是头发的发育停止于退化期与休止期，无法到达新生期与生长期，使得头发的死亡速率大于新生速率，最终造成脱发症状。头发产生于头皮真皮层中的毛囊，毛囊中含有毛囊干细胞，能够不断形成新的头发细胞促进头发生长。对于毛囊存在的脱发情况，可以通过对脱发者激素分泌的调理、营养平衡的调整，加强对头发的营养与护理，增强对造成脱发物质的代谢及排出，都可以达到提高毛囊生理活性和缓解脱发的效果。对于毛囊萎缩与凋亡造成的脱发，只能通过调整脱发者头皮真皮层的生理状态并重建毛囊的方法解决，不重建头皮真皮层中毛囊干细胞生长分化的生理条件，移植再多的毛囊也不可能存活，不可能真正解决脱发问题。与毛囊生长发育相关的信号通路较多，其中比较关键的有wnt/β-catenin通路，tgf-β通路等，能否在分子机制层次对关键信号通路进行有效调控将成为解决生发问题的关键。技术实现要素：本发明为解决现有技术不足，提供了一种利用干细胞重建毛囊的生发方法，有效解决毛囊再造难题，利用毛囊再生头发从根本上解决脱发问题。本发明的构思是：先通过对脱发者的精神状态、激素分泌、营养供应等生理状况进行全面调理，使脱发者头皮下真皮层的生理状态能够达到干细胞存活与生长的生理需求：将体外培养的干细胞植入到脱发者头皮的真皮层，配合使用细胞因子调控毛囊萎缩凋亡信号通路和毛囊生长发育信号通路，基于毛囊干细胞的再生功能与多向分化潜能，使毛囊干细胞及其分化细胞通过自组织方式重塑毛囊结构，毛囊可以自主形成头发并自动长出。为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种利用干细胞重建毛囊的生发方法及，按照先后顺序包括以下步骤：s1针对脱发者具体生理指标，抑制毛囊萎缩凋亡信号通路，增强毛囊生长发育信号通路，通过对脱发者进行系统调理使其头皮下真皮层能够恢复毛囊干细胞工作所需生理条件；s2分离脱发者毛囊干细胞，优化培养条件并完成体外扩增培养；s3将体外培养的干细胞植入到脱发者头皮的真皮层，利用表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子配合启动毛囊干细胞的增殖与分化程序，使毛囊干细胞及其分化细胞通过自组织方式重塑毛囊结构，毛囊可以自主形成并长出头发。本发明充分利用干细胞的再生功能与多向分化潜能通过自组织方式重建毛囊结构，遵循头发生长的本身规律解决脱发问题。优选的是，步骤s1中，毛囊萎缩凋亡信号通路包括bmp信号通路与tgf-β信号通路和其他辅助调控信号通路。在上述任一方案中优选的是，步骤s1，中毛囊生长发育信号通路包括wnt/β-catenin信号通路和其他辅助调控信号通路。在上述任一方案中优选的是，步骤s1中，对脱发者进行系统调理并使其头皮下真皮层能够恢复毛囊干细胞工作所需生理条件包括以下指标：消除精神压力等因素造成的激素紊乱与生理代谢异常，衰减造成头皮毛囊萎缩及凋亡的细胞因子；促进真皮层的纤维骨架系统重建，促进细胞基质中层黏连蛋白、纤连蛋白、各种聚糖等组成成份的恢复，促进多种间质细胞的恢复与定位。步骤s1具体为：通过精神、激素、营养、运动等多方面调整，消除脱发者精神压力造成的激素紊乱与生理代谢异常，衰减毛囊萎缩凋亡信号通路(包括bmp信号通路、tgf-β信号通路及辅助信号通路)，刺激毛囊生长发育信号通路(wnt/β-catenin信号通路)，使脱发者的头皮真皮层能够具备毛囊干细胞的存活与生长所需生理条件。在上述任一方案中优选的是，所述步骤s2中，毛囊干细胞直接从脱发者头皮获取，但干细胞来源不局限于毛囊干细胞，还包括脂肪组织干细胞、间充质干细胞、脐带血干细胞、ips细胞。在上述任一方案中优选的是，步骤s3中，利用毛囊干细胞的再生功能与多向分化潜能，基于自组织原理重建毛囊结构，通过毛囊自主形成并长出头发。在上述任一方案中优选的是，上述法适用于生发领域。与现有技术相比，本发明提供的一种利用毛囊干细胞重建毛囊的生发方法，遵循头发生长发育的自身规律，从肠道菌群、营养、激素、细胞因子四个层面调整脱发者的代谢状况，通过下调毛囊萎缩凋亡信号通路和上调毛囊生长发育信号通路使脱发者头皮真皮层能够恢复毛囊存活与生长所需的生理条件，充分利用植入毛囊干细胞的再生功能与多向分化潜能，通过多种细胞因子调控毛囊干细胞及其分化细胞以自组织方式重建毛囊，通过毛囊自主形成与长出头发，从根本上解决脱发问题。附图说明图1：wnt/β-catenin信号通路；图2：tgf-β信号通路/bmp信号通路；图3：实施例1脱发者应用本发明前后对比图；图4：实施例1中身体调理前后头部皮肤超声成像结果对比；图5：实施例1干细胞移植后新生毛囊；图6：实施例2脱发者应用本发明前后对比图；图7：实施例2中身体调理前后头部皮肤超声成像结果对比；图8：实施例2干细胞移植后新生毛囊；图9：实施例3脱发者应用本发明前后对比图；图10：实施例3中身体调理前后头部皮肤超声成像结果对比；图11：实施例3干细胞移植后新生毛囊。具体实施方式为了更进一步了解本发明的
发明内容，下面将结合具体实施例详细阐述本发明。本发明所应用的化学试剂以及仪器如未经特别说明，均可从商业渠道购买，其中所用酵素为河北中佳本草生物技术有限公司昶佳胃肠道调节酵素。本发明所用相关方法均依照国标和发表文献方法进行。选择wnt信号通路(见图1)、tgf-β信号通路/bmp信号通路(见图2)的基因表达值作为患者头部真皮生理状态的评定依据。脱发患者头部皮肤用皮肤钻孔器对秃发区取样，取样大小为直径4mm，厚度3mm的饼型组织；用同样方法在未脱发区采集毛囊。用荧光定量pcr的方法对脱发患者头部皮肤组织与未脱发处基因表达水平进行检测，采用目的基因与内参基因之间ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，本发明中，以gapdh作为内参基因，每个rna样品的定量pcr进行三个重复以消除系统误差。用highpurernaisolationkit提取总rna，采用taqmanreversetran-scriptionrengents试剂盒将总rna反转录为cdna(25μl体系)，取反转录产物cdna模板2.5μl，按照taqmangeneexpressionmastermix说明书进行定量pcr检测。扩增程序为：95℃10min，95℃30s，55℃30s，72℃延伸30s共40个循环，定量pcr仪为roche480ⅱ。细胞培养试剂与培养条件:dmem(sh30023.01b，美国hyclone公司)、胎牛血清(sh30087.01，美国hyclone公司)、pbs磷酸钾缓冲液(sh30256.01b，美国hyclone公司)、青链霉素(sh30010，美国hyclone公司)、annexinv-apc细胞凋亡检测试剂盒(kga106，南京keygen公司)、celltiter96aq单溶液细胞增殖检测试剂(g3582，美国promega公司)。培养基由dmem与ham'sf-12培养基3∶1配制，添加5％胎牛血清、1.00％gluta-max、1.00％非必须氨基酸、0.10％青霉素-链霉素。在换液或传代时加入10ng/ml表皮生长因子，20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(美国invitrogen公司)。实施例1脱发患者1号为男性，年龄36岁，体重79kg。采集患者头发照片，用于治疗前后对比，见图3；进行患者头部皮肤真皮层超声检测，用于治疗前后对比，见图4；对脱发患者新鲜大便样品收集5g，用二代测序方法进行肠道菌群16srna高通量测序检测，肠道菌群检测方法参考(胡海兵等，2016)，结果见表1。同时采集患者外周血30ml，进行生化指标检测，检测结果见表2。对脱发者进行基因检测，定量pcr引物见表3，检测结果见表4。根据多种检测结果，利用生命大数据云进行脱发者身体激素水平、代谢情况、营养状况的全面分析；确定造成脱发的主要因素并制定具体的生发方案。第一阶段：患者身体的生理状态调整身体生理状态调整方案为：服用胃肠道调节酵素一个周期共25天，每天服用α亚麻酸1500mg调整两个月。配合头部的理疗，对脱发者的激素分泌与营养状况进行平衡调理，通过衰减毛囊萎缩凋亡信号通路和刺激毛囊生长发育信号通路调整脱发者头皮下真皮层的生理状态，解除脱发者头皮下真皮层对毛囊干细胞存活与分化的抑制作用；促进真皮层的纤维骨架系统重建，促进细胞基质中层黏连蛋白、纤连蛋白、各种聚糖等组成成份的恢复，促进多种间质细胞的恢复与定位，使脱发者头皮真皮层能够具备毛囊干细胞的存活与生长所需生理条件。对患者生理状态调整结果进行复检，用二代测序方法对脱发者肠道菌群16srna进行检测与生物信息学分析，优势菌群种类与丰度结果如整合到表1中进行比对，生化指标整合到表2中进行比对，进行身体调理前后头部皮肤进行超声成像检测并将检测结果整合到图4中进行比对。在图4中可见脱发者在进行干细胞移植前对身体系统调理前后的皮肤状况，从图中我们可以发现经过调理后的头部皮肤紧实度明显变好，紧实度分值由28.6升高到39.2，皮肤厚度由1066μm升为1231μm。复检结果表明，患者身体生理指标达到可以进行毛囊干细胞移植所需要条件，可以进行第二阶段的治疗。第二阶段：患者毛囊干细胞的获取、扩增与移植用皮肤专用钻孔器取下脱发患者头部脱发处皮肤组织。首先用复方氯化钠对头部皮肤组织润洗，去除多余脂肪，再用显微剪分离毛囊峡部和毛球上部之间的隆突区组织，其深度起始位距表皮1.00mm，延伸深度1.80mm，将分离的少量隆突区组织行免疫荧光染色hfscs表面标记物鉴定后，将大批量隆突区组织用10ng/ml中性蛋白酶37℃下消化40min后接种。将组织直接接种于matrigel包被的培养板中，在37℃、5％的co2的孵箱中培养。细胞迁出后融合度达70％～80％时，再用0.25％胰酶37℃条件下振荡消化10min，收集细胞传代培养。每3天换1次液，观察细胞形态变化与增殖情况，优化培养条件，完成毛囊干细胞的扩增。待患者头部真皮层具备毛囊存活生理条件后，将体外培养的毛囊干细胞植入到脱发者头皮的真皮层，毛囊干细胞经胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶/edta，paa)10min，并离心12min，1200rpm/min，沉淀的细胞加生理盐水5ml制成毛囊干细胞悬液，子代干细胞密度约6×103个/ml。用专门生发微针注射器，均匀的注射入头皮内部，每周注射一次，4次为一个疗程，使毛囊干细胞能够在患者头部存活与生长。第三阶段：生建毛囊结构与头发长出配合使用10ng/ml表皮生长因子、成纤维生长因子调控wnt/β-catenin信号通路和tgf-β信号通路，增强毛囊干细胞的增殖与分化，并保证毛囊干细胞及其分化细胞以自组织方式重建毛囊结构，使毛囊结构能自动形成并长出头发，彻底解决脱发问题。图5为700倍皮肤显微镜下观察到干细胞移植后20天的新生毛囊状况，脱发者治疗后结果整合到图3中进行对比。表1：脱发患者1号服用胃肠道调节酵素及亚麻酸前后肠道优势菌群变化注：表中↓表示下调，↑表示上调由表1可知，经过胃肠道调节酵素与亚麻酸的调理后，该患者的肠道优势菌群发生了明显变化，其中拟杆菌属呈明显下降，有益菌如双歧杆菌丰度增加。表2：脱发患者生化指标对照表生化指标调控前调控后生长激素0.65μg/l1.57μg/l促甲状腺激素1.73μm/l2.82μm/l促肾上腺皮质激素20.81ng/l30.45ng/l同型半胱氨酸14.5μmol/l11.69μmol/l血清甘油三酯2.75mmol/l1.59mmol/l高密度脂蛋白0.6mmol/l0.9mmol/l血糖6.53mmol/l5.17mmol/l血清胰岛素36.29pmol/l41.65pmol/l由表2可以看出该患者血清生化指标发生了明显变化，血脂和血糖都发生了下降，其中同型半胱氨酸属于能够破坏血管的因子，调控后同样发生了下降。表3：定量pcr检测相关基因引物序列表4：脱发患者脱发区与毛囊干细胞相关基因表达差异基因表达倍数变化p值bmp119.322.15×10-4nfatc10.033.26×10-5shh0.042.82×10-4nog0.124.29×10-4fgf70.031.97×10-5β-catenin0.055.33×10-5fgf526.287.36×10-4由表4可知脱发患者脱发区皮肤bmp信号活跃，nfatc1基因表达水平显著低于毛囊干细胞，这些特征符合脱发症状的分子机制。实施例2男性脱发患者一名，年龄45岁，体重81kg。采集患者头发照片，用于治疗前后对比，见图6；进行患者头部皮肤真皮层超声检测，用于治疗前后对比，见图7；对脱发患者新鲜大便样品收集5g，用二代测序方法进行肠道菌群16srna高通量测序检测，肠道菌群检测方法参考(胡海兵等，2016)，结果见表5。同时采集患者外周血30ml，进行生化指标检测，检测结果见表6。对脱发者进行基因检测，定量pcr引物见表7，检测结果见表8。根据多种检测结果，利用生命大数据云进行脱发者身体激素水平、代谢情况、营养状况的全面分析；确定造成脱发的主要因素并制定具体的生发方案。第一阶段：患者身体的生理状态调整身体生理状态调整方案为：服用胃肠道调节酵素一个周期共25天，每天服用α亚麻酸1500mg调整两个月。配合头部的理疗，对脱发者的激素分泌与营养状况进行平衡调理，通过衰减毛囊萎缩凋亡信号通路和刺激毛囊生长发育信号通路调整脱发者头皮下真皮层的生理状态，解除脱发者头皮下真皮层对毛囊干细胞存活与分化的抑制作用；促进真皮层的纤维骨架系统重建，促进细胞基质中层黏连蛋白、纤连蛋白、各种聚糖等组成成份的恢复，促进多种间质细胞的恢复与定位，使脱发者头皮真皮层能够具备毛囊干细胞的存活与生长所需生理条件。对患者生理状态调整结果进行复检，用二代测序方法对脱发者肠道菌群16srna进行检测与生物信息学分析，优势菌群种类与丰度结果如整合到表5中进行比对，生化指标整合到表6中进行比对，进行身体调理前后头部皮肤进行超声成像检测并将检测结果整合到图7中进行比对。在图7中可见脱发者在进行干细胞移植前对身体系统调理前后的皮肤状况，从图中我们可以发现经过调理后的头部皮肤紧实度明显变好，紧实度分值由27.4升高到32.7，皮肤厚度由750μm变为1132μm。复检结果表明，患者身体生理指标达到可以进行毛囊干细胞移植所需要条件，可以进行第二阶段的治疗。第二阶段：间充质干细胞的获取、培养与移植人骨髓间充质干细胞的分离：在无菌条件下，采集捐献者的骨髓液2ml，等体积pbs缓冲液混匀，以1：1的比例轻轻滴加到淋巴细胞分离液，先在2200r/mint条件下进行离心，然后吸取靠近表面的薄膜层，再次滴加pbs进行混匀并以1200r/min进行离心，洗涤，计数，并接种于100ml的培养瓶中。待培养的细胞铺满瓶底约80％时，用胰蛋白酶消化分离，按1：3传代培养。待患者头部真皮层具备毛囊存活生理条件后，将诱导培养后的间充质干细胞植入到脱发者头皮的真皮层，干细胞密度约6×103个/ml，用专门生发微针注射器均匀的注射入头皮内部，每周注射一次，4次为一个疗程，保证间充质干细胞能够在患者头部真皮内存活与生长。第三阶段：生建毛囊结构与头发长出配合使用10ng/ml表皮生长因子、成纤维生长因子调控wnt/β-catenin信号通路和tgf-β信号通路，增强毛囊干细胞的增殖与分化，并保证毛囊干细胞及其分化细胞以自组织方式重建毛囊结构，使毛囊结构能自动形成并长出头发，彻底解决脱发问题。图8为700倍皮肤显微镜下观察到干细胞移植后20天的新生毛囊状况，脱发者治疗后结果整合到图6中进行对比。表5：脱发患者服用胃肠道调节酵素及亚麻酸前后肠道优势菌群变化由表5可知，经过胃肠道调节酵素与亚麻酸的调理后，该患者的肠道优势菌群发生了明显变化，其中拟杆菌属呈明显下降，有益菌如、粪球菌属、双歧杆菌丰度增加。表6：脱发患者生化指标对照表由表6可以看出该患者血清生化指标发生了明显变化，血脂和血糖都发生了下降，其中同型半胱氨酸属于能够破坏血管的因子，调控后同样发生了下降，血清胰岛素水平提高。表7：定量pcr检测相关基因引物序列表8：脱发患者脱发区与毛囊干细胞相关基因表达变化基因表达倍数变化p值bmp122.373.74×10-4nfatc10.263.59×10-5shh0.362.57×10-4nog0.203.98×10-4fgf70.282.45×10-5β-catenin0.045.34×10-5fgf528.396.52×10-4由表8可知脱发患者脱发区皮肤bmp信号活跃，nfatc1基因表达水平显著低于毛囊干细胞，这些特征符合脱发症状的分子机制。实施例3脱发患者3号，年龄39岁，体重128kg。采集患者头发照片，用于治疗前后对比，见图9；进行患者头部皮肤真皮层超声检测，用于治疗前后对比，见图10；对脱发患者新鲜大便样品收集5g，用二代测序方法进行肠道菌群16srna高通量测序检测，肠道菌群检测方法参考(胡海兵等，2016)，结果见表9。同时采集患者外周血30ml，进行生化指标检测，检测结果见表10。对脱发者进行基因检测，定量pcr引物见表11，检测结果见表12。根据多种检测结果，利用生命大数据云进行脱发者身体激素水平、代谢情况、营养状况的全面分析；确定造成脱发的主要因素并制定具体的生发方案。第一阶段：患者身体的生理状态调整身体生理状态调整方案为：服用胃肠道调节酵素一个周期共25天，每天服用α亚麻酸1500mg调整两个月。配合头部的理疗，对脱发者的激素分泌与营养状况进行平衡调理，通过衰减毛囊萎缩凋亡信号通路和刺激毛囊生长发育信号通路调整脱发者头皮下真皮层的生理状态，解除脱发者头皮下真皮层对毛囊干细胞存活与分化的抑制作用；促进真皮层的纤维骨架系统重建，促进细胞基质中层黏连蛋白、纤连蛋白、各种聚糖等组成成份的恢复，促进多种间质细胞的恢复与定位，使脱发者头皮真皮层能够具备毛囊干细胞的存活与生长所需生理条件。对患者生理状态调整结果进行复检，用二代测序方法对脱发者肠道菌群16srna进行检测与生物信息学分析，优势菌群种类与丰度结果如整合到表9中进行比对，生化指标整合到表10中进行比对，进行身体调理前后头部皮肤进行超声成像检测并将检测结果整合到图10中进行比对。在图10中可见脱发者在进行干细胞移植前对身体系统调理前后的皮肤状况，从图中我们可以发现经过调理后的头部皮肤紧实度明显变好，紧实度分值由29.3升高到38.6，皮肤厚度由876μm变1287μm。复检结果表明，患者身体生理指标达到可以进行毛囊干细胞移植所需要条件，可以进行第二阶段的治疗。第二阶段：脂肪干细胞的获取、培养与移植抽取脱发者臀部脂肪2ml，无菌条件下，将获得脂肪用0.1mol/l磷酸盐缓冲液反复冲洗后，去除麻醉药品及血细胞，获得纯度较高的脂肪颗粒。用0.3％ⅰ型胶原酶37℃恒温摇床震荡消化1h。过滤去除未消化组织，800r/min离心10min(离心半径15cm)，以8mlα-mem培养液(含10％fbs)悬浮细胞，接种于培养瓶中，5％co2、37℃标准环境下培养。3d后首次换液，除去未贴壁细胞，随后每2～3d换液1次，当细胞接近80％融合时，及时进行传代。待患者头部真皮层具备毛囊存活生理条件后，将诱导培养后的脂肪干细胞植入到脱发者头皮的真皮层，干细胞密度约6×103个/ml，用专门生发微针注射器均匀的注射入头皮内部，每周注射一次，4次为一个疗程，保证间充质干细胞能够在患者头部真皮内存活与生长。第三阶段：生建毛囊结构与头发长出配合使用10ng/ml表皮生长因子、成纤维生长因子调控wnt/β-catenin信号通路和tgf-β信号通路，增强毛囊干细胞的增殖与分化，并保证毛囊干细胞及其分化细胞以自组织方式重建毛囊结构，使毛囊结构能自动形成并长出头发，彻底解决脱发问题。图11为700倍皮肤显微镜下观察到干细胞移植后20天的新生毛囊状况，脱发者治疗后结果整合到图9中进行对比。表9：脱发患者服用胃肠道调节酵素及亚麻酸前后肠道优势菌群变化表10：脱发患者生化指标对照表生化指标调控前调控后生长激素0.52μg/l1.86μg/l促甲状腺激素1.38μm/l3.34μm/l促肾上腺皮质激素17.45ng/l31.83ng/l同型半胱氨酸19.76μmol/l9.87μmol/l血清甘油三酯3.59mmol/l1.36mmol/l高密度脂蛋白0.68mmol/l1.52mmol/l血糖6.87mmol/l4.98mmol/l血清胰岛素32.17pmol/l44.89pmol/l由表10可以看出该患者血清生化指标发生了明显变化，血脂和血糖都发生了下降，其中同型半胱氨酸属于能够破坏血管的因子，调控后同样发生了下降，血清生长激素水平明显提高。表11：定量pcr检测相关基因引物序列表12：脱发患者脱发区与毛囊干细胞相关基因表达变化本领域技术人员不难理解，本发明的利用干细胞重建毛囊的生发方法及应用包括上述本发明说明书的
发明内容和具体实施方式部分以及附图所示出的各部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案一一描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12