一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药复方制剂及其制备工艺的制作方法

本发明涉及一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药复方制剂及其制备工艺，特别是肠道病毒中柯萨奇病毒b组病毒（coxsackievirusb,cvb）引起的心肌组织损伤及心肌细胞凋亡中的应用，属于中药有效部位的医药用途技术领域。

背景技术：

病毒性心肌炎（viralmyocarditis,vmc）是指病毒感染引起的心肌局限性或弥漫性的急性或慢性炎症病变，属于感染性心肌疾病。vmc患病人群广泛，以学龄前儿童及学龄儿童多见，多数由肠道病毒及呼吸道病毒引发。柯萨奇病毒a组、柯萨奇病毒b组（coxsackievirusb,cvb）、艾可病毒、脊髓灰质炎病毒是常见致心肌炎致病病毒，其中cvb是最主要的病原体，发病率约占30%~50%，cvb包括六种血清型，其中b3型致病性最强，易造成重症和死亡病例，是我国病毒性心肌炎患儿的主要致病病毒。人类感染cvb后，约有5~7%发生心肌炎，部分病例可发展为扩张型心肌病（dilatedcardiomyopathy,dcm），遗留心功能不全等后遗症，严重者需要心脏移植。在法医猝死案例中，vmc和dcm的猝死率仅次于冠心病和高血压，位于心性猝死的第三位。近年来儿童和青少年中vmc的发病率呈明显上升趋势，占到了青少年猝死的10％~44％，已成为儿童和青少年猝死的一个重要原因，引起了医学界的广泛重视。

vmc治疗药物种类有限，专门针对小儿病毒性心肌炎的治疗药物更是缺乏，亟需开发新的治疗药物。西药治疗主要针对病毒感染和心肌炎症对症治疗，但效果均不理想，常有不同程度的不良反应，且价格昂贵。中药文献虽记载了许多复方来治疗该病，但临床应用剂量较大，特别是存在小儿中药服量大、难应用的缺点，并且其保护心肌的机理有待进一步研究和证实，所以研究有效中药成分应用于难治性疾病的治疗显得尤为迫切。把古人的经验与现代药理学研究的成果结合起来，筛选新的、高效无毒的、由有效活性成分组成的治疗小儿病毒性心肌炎的新型中药显得尤为迫切。

中医学中尚无特定的病名与病毒性心肌炎相对应，若系急病感染者，可从温病论治；若以心律失常为主者，则属“心悸”、“怔忡”范畴；若以胸闷胸痛为主者，则按胸痹论治，此外还与心水、汗证、虚劳、猝死等相关。中医对该病病因病机的传统认识是，外感风热、湿热邪毒所致。近年来，随着临床经验的进一步丰富和积累，中医学者提出了许多新的思路和见解，如瘀血内结、痰浊蕴结、脾胃虚弱等皆可致该病，丰富了病毒性心肌炎的病机学说。西医认为免疫损伤、细胞凋亡是病毒致细胞损伤的决定性因素。病毒感染除直接导致心肌功能代谢障碍、细胞结构破坏外，还可激活fas/fasl通路、caspase家族、bcl-2家族等启动心肌细胞的凋亡。

随着分子生物学的快速发展，对vmc的发病机制研究有了一定进展，但治疗方面至今仍无特效药物，专门针对小儿病毒性心肌炎的治疗药物更是缺乏。西药治疗主要针对病毒感染和心肌炎症对症治疗，临床已有的对症治疗性药物种类可以用于小儿患者的有限，目前临床多应用自由基清除剂，如静脉或口服维生素c、辅酶q10、维生素bco、atp、肌苷、环化腺苷酸、细胞色素c、糖皮质激素等，但治疗效果均不理想，常有不同程度的不良反应，且价格昂贵。中药文献虽记载了许多复方来治疗该病，但疗效欠佳，临床应用剂量较大，特别是存在小儿中药服量大、难应用的缺点，并且其保护心肌的机理有待进一步研究和证实，所以研究有效中药成分应用于难治性疾病的治疗显得尤为迫切。我们认为把古人的经验与现代药理学研究的成果结合起来，筛选新的、高效无毒的、由有效活性成分组成的治疗小儿病毒性心肌炎的新型中药是当务之急。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药复方制剂及其制备工艺，利用中药有效部位群用于小儿病毒性心肌炎的治疗，特别是cvb3引起的心肌细胞损伤及凋亡，具有显著的技术效果，解决背景技术存在的上述问题。

本发明的技术方案是：

一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药复方制剂，该中药复方制剂是由下述原料药物制成：西洋参总皂苷、黄芪总皂苷、牡丹皮总皂苷和王不留行总皂苷，上述原料药物的质量比为6：6：4：1。

一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药复方制剂的制备工艺，工艺步骤如下：

步骤一：有效组分的制备

将西洋参粉碎成粗颗粒，加入乙醇加热回流提取3次，提取后的滤液用旋转蒸发器浓缩，浓缩后的滤液用石油醚及水饱和正丁醇等体积萃取3次，取上清液，用旋转蒸发器回收上清液内正丁醇，剩余药液水浴蒸发，浓缩后，置干燥厢内干燥即得西洋参总皂苷；黄芪总皂苷、牡丹皮总皂苷和王不留行总皂苷制备方法同上；

步骤二：各组分间配置质量比

各组分配置比例：西洋参总皂苷、黄芪总皂苷、牡丹皮总皂苷和王不留行总皂苷的配置质量比为6：6：4：1。

下面通过四部分来进一步阐述本发明。第一部分：中药有效部位群的制备。第二部分：各有效部位间配置比例及用法用量。第三部分：在体内动物模型及体外细胞模型上验证该有效部位群的药效作用。第四部分：该中药有效部位群治疗小儿病毒性心肌炎的优点和有益效果。

第一部分：有效组分的制备。

将西洋参粉碎成粗颗粒，加入乙醇加热回流提取3次，提取后的滤液用旋转蒸发器浓缩，浓缩后的滤液用石油醚及水饱和正丁醇等体积萃取3次，萃取后，取上清液，上清液用旋转蒸发器回收正丁醇，回收后的剩余药液水浴蒸发，置干燥厢内干燥即得西洋参总皂苷；黄芪总皂苷、牡丹皮总皂苷、王不留行总皂苷制备方法同上。

第二部分：各组分间配置比例及用法用量。

经过反复的体内外药效筛选实验，已发现具有确切疗效的组分。各组分配置质量比：西洋参总皂苷、黄芪总皂苷、牡丹皮总皂苷、王不留行总皂苷配置比例为6：6：4：1。用药剂量：临床推荐剂量为5mg/kg（约300mg/d）。用药方法：口服。用药疗程：推荐1~2周，即7~14天，可单独使用，也可与其它药物合用。

第三部分：在体内动物模型及体外细胞模型上验证该复方制剂的药效作用。

体内动物模型；采用腹腔无菌注射0.2ml0.8倍id50的cvb3病毒液的方法制备vmc小鼠模型，设中药复方制剂高、中、低剂量组，利巴韦林组，同时设正常对照组和模型对照组，各组给予相应药物14天后，检测心功能、心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶（ck-mb）和心肌肌钙蛋白（ctni、ctnt）、病理改变（he染色）及心肌梗死面积。实验结果显示，给予该中药复方制剂后，小鼠心功能指标改善明显，ck-mb、ctni、ctnt含量降低，病理损伤及心肌梗死面积减少。以上数据说明该中药复方制剂可以改善vmc小鼠心肌的结构和功能，其作用可能通过减轻心肌细胞损伤，改善心肌缺血及其功能，提高耐缺氧能力来实现。

体外细胞模型；分离培养大鼠原代心肌细胞，确定该药最大无毒浓度（tc0）。取已长成单层细胞的培养板，接种含cvb3的病毒液，置培养箱中吸附1h后，加入tc0以下4个浓度的受试药物，同时设病毒对照组，采用细胞病变效应法（cpe）测定该药对cvb350％抑制浓度（ic50）和治疗指数（ti）；tdt介导的dutp缺口末端标记技术（tunel法）测定心肌细胞凋亡率；蛋白免疫印迹法（western-blot）检测bax及bcl-2蛋白的表达情况。实验结果显示，该药对肠道病毒cvb3株致心肌细胞病变具有明显的抑制作用，心肌细胞凋亡指数下降，该药干预染毒心肌细胞后，bcl-2蛋白表达升高，bax蛋白表达降低，bax/bcl-2比值下降。以上数据说明，该药在外实验中对抑制细胞凋亡表现出明显的药效作用，其机制可能与抑制病毒在细胞内增殖及上调bcl-2表达、下调bax表达有关。

第四部分：该中药有效成分群治疗小儿病毒性肌炎的优点和有益效果。

小儿病毒性心肌炎至今仍无特异性治疗药物，主要针对病毒感染和心肌炎症进行治疗，临床已有的对症治疗性药物种类有限，亟需开发新的治疗药物。本发明发现，该中药有效部位群可用于小儿病毒性心肌炎的治疗，特别是病毒引起的心肌组织及心肌细胞损伤，具有显著的技术效果，值得推广应用。

本发明的积极效果：原料药来源广，成本低廉；药效显著，安全无毒；用药量小，便于小儿服用；口服药，便于储藏。

附图说明

图1为本发明总皂苷制备流程图；

图2为本发明中药有效部位群对vmc小鼠心功能的影响示意图（±s，n=10）；

图3为本发明中药有效部位群对vmc小鼠血清中ck-mb活性的影响示意图（±s，n=10）；

图4为本发明中药有效部位群对vmc小鼠血清中ctni、ctnt活性的影响示意图（±s，n=10）；

图5为本发明中药有效部位群对vmc小鼠心肌病理形态的影响示意图-正常组（he染色，x200）；

图6为本发明中药有效部位群对vmc小鼠心肌病理形态的影响示意图-模型组（he染色，x200）；

图7为本发明中药有效部位群对vmc小鼠心肌病理形态的影响示意图-皂苷低剂量组（he染色，x200）；

图8为本发明中药有效部位群对vmc小鼠心肌病理形态的影响-利巴韦林组（he染色，x200）；

图9为本发明中药有效部位群对vmc小鼠心肌病理形态的影响-皂苷中剂量组（he染色，x200）；

图10为本发明中药有效部位群对vmc小鼠心肌病理形态的影响-皂苷高剂量组（he染色，x200）；

图11为本发明中药有效部位群对vmc小鼠心肌梗死面积的影响（±s，n=10）；

图12为本发明中药有效部位群对心肌细胞凋亡的抑制作用（注：1~5药物剂量：0（病毒对照组）、9.77、19.54、39.07、78.13ug/ml）；

图13为本发明中药有效部位群对凋亡因子bcl-2、bax蛋白表达的影响（注：1~4药物剂量：0（病毒对照组）、19.54、39.07、78.13ug/ml）。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明：

一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药复方制剂，该中药复方制剂是由下述原料药物制成：西洋参总皂苷、黄芪总皂苷、牡丹皮总皂苷和王不留行总皂苷，上述原料药物的质量比为6：6：4：1。

一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药复方制剂的制备工艺，工艺步骤如下：

步骤一：有效组分的制备

将西洋参粉碎成粗颗粒，加入乙醇加热回流提取3次，提取后的滤液用旋转蒸发器浓缩，浓缩后的滤液用石油醚及水饱和正丁醇等体积萃取3次，取上清液，用旋转蒸发器回收上清液内正丁醇，剩余药液水浴蒸发，浓缩后，置干燥厢内干燥即得西洋参总皂苷；黄芪总皂苷、牡丹皮总皂苷和王不留行总皂苷制备方法同上。

步骤二：各组分间配置质量比

各组分配置比例：西洋参总皂苷、黄芪总皂苷、牡丹皮总皂苷和王不留行总皂苷的配置质量比为6：6：4：1。

具体实验方案如下：

第一部分：有效部位群的制备。

将西洋参粉碎成粗颗粒，加6~8倍量80%乙醇加热回流提取3次，每次2h，提取液用旋转蒸发器浓缩，同时回收乙醇，浓缩液分别用石油醚及水饱和正丁醇等体积萃取3次，取上清液，合并提取后的3次上清液，用旋转蒸发器回收正丁醇，回收后的剩余药液用70℃水浴蒸发成膏状，之后在70℃鼓风干燥机中干燥至恒重即得西洋参总皂苷。黄芪总皂苷、牡丹皮总皂苷和王不留行总皂苷，制备方法同上，制备流程如图1所示。各味中药饮片实物与名称相符，质量符合2015年版《中华人民共和国药典》标准。

第二部分：各组分间配置比例及用法用量。

经过反复的体内外药效筛选实验，已发现具有确切疗效的组分。体外实验中，采用细胞病变效应法（cpe）法观察本复方制剂对coxb3株、coxb4、coxb5致细胞病变的抑制作用；体外试验中分别对肠道病毒coxb3株感染的babl/c小鼠进行预防性和治疗性给药，观察乳鼠感染的严重程度及死亡数、动物死亡率、死亡保护率以及生命延长率。药效试验结果显示，各有效部位配置比例西洋参总皂苷、黄芪总皂苷、牡丹皮总皂苷和王不留行总皂苷质量比为6：6：4：1时药效最佳。故本复方制剂各有效部位西洋参总皂苷、黄芪总皂苷、牡丹皮总皂苷和王不留行总皂苷的配置质量比例为6：6：4：1。用药剂量：临床推荐剂量为5mg/kg（约300mg/d）。用药方法：口服。用药疗程：推荐1~2周，即7~14天，可单独使用，也可与其它药物合用。

第三部分：在体内动物模型及体外细胞模型上验证该中药有效部位群的药效作用。

1.体内动物实验

1.1实验材料

1.1.1实验动物雄性balb\c小鼠，3周齡，spf级，雌雄各半，经心电图测试均无异常（入选标准：小鼠在清醒状态下ⅱ导联心电图，st段接近等电位线，t波无低平者即可入选）。许可证号：scxk（京）2014-0004，合格证号：11401300076233，购自北京金牧阳实验动物养殖有限公司。

1.1.2病毒株柯萨奇b3族病毒（nacy株），在hep-2细胞上连传3代，细胞病变至++~++++(75%-100%细胞发生病变)后，反复冻融3次，2000rpm离心5min，取上清，在中国中医研究院中药所病毒室-80℃冰箱中保存（cvb3病毒株及hep-2细胞均购自中国预防医学科学院病毒研究所）。

1.1.3药品及试剂受试药物（即本发明），由华北理工大学中医学院中心实验室制剂室制备；利巴韦林颗粒，四川百利药业责任有限公司，批号h51023508。ck-mb测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；ctni、ctnt购自德国bgaer公司。

1.1.4主要仪器高速药物粉碎机（型号：wk-1000a），青州市精诚机械有限公司；电子调温电热套（型号：98-1-b），天津市泰斯特仪器有限公司；旋转蒸发仪（型号：re-5205），上海亚荣生化仪器厂；电热鼓风干燥箱（型号：gzx-9070mbe），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；心电图机（型号：ecg-6511），上海医用电子仪器厂；数显恒温水浴锅(型号：hh-6)，国华电器有限公司；bio-rad3550型自动酶联免疫测定仪，美国bio-rad公司；bx63型光学显微镜，日本olympus公司。

1.2实验方法

1.2.1cvb3病毒小鼠体内td50测定病毒以10倍倍比稀释为8个滴度，分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7倍病毒原液，每个梯度选用10只雄性balb/c小鼠，病毒用dmem稀释，实验第一天腹腔接种cvb3病毒，0.2ml/只，观察14天，记录各个病毒滴度组小鼠的死亡数，应用reed-muench方法统计结果，计算cvb3病毒的ld50为10^-6.2。

1.2.2病毒感染量的确定将cvb3病毒用生理盐水稀释成0.5~4倍ld50的不同病毒液，取balb/c小鼠80只，每个稀释度10只，0.2ml/只，腹腔注射感染。每日观察动物的死亡情况，连续观察15天。选取感染后15天内动物无死亡但心肌酶谱与正常对照组相比已发生明显变化的浓度，为实验时的感染量。实验结果显示：0.8倍ld50感染时，小鼠无死亡，但心肌酶谱与对照组相比已有明显变化，故将其定为实验时的感染量。

1.2.3病毒性心肌炎动物模型建立方法造模采用腹腔注射cvb3病毒的方法。小鼠在本实验室饲养一周后，随机抽取20只为正常对照组，腹腔无菌注射0.2ml未经稀释的hep-2细胞冻融液。其余小鼠腹腔无菌注射0.2ml0.8ld50的cvb3病毒。被cvb3感染而诱发心肌炎的小鼠出现消瘦、皮毛稀疏无光泽、活动减少、食欲减退和颤抖等一系列症状，血清心肌酶活力升高及心肌病理改变作为造模成功指标。

1.2.4动物分组及给药方案选取心电图无异常的balb/c小鼠60只，雌雄各半，随机分成6组：正常对照组，模型对照组，阳性药对照组（利巴韦林50mg/kg）和皂苷高、中、低剂量组，每组10只。正常对照组和模型对照组蒸馏水灌胃，其余组灌服相应的药物，各组均在腹腔注射后2小时开始灌胃，各组均每日给药1次，连续14d，容积均为20ml/kg。

1.2.5给药剂量设计有效部位群皂苷高剂量组给药剂量为10mg/kg，每毫克含生药16g（相当于临床60kg成人用量的2倍）；有效部位群皂苷中剂组给药剂量为5mg/kg，每毫克含生药16g（相当于临床60kg成人用量的等倍）；有效部位群皂苷低剂组给药剂量为2.5g/kg，每毫克含生药16g（相当于临床60kg成人用量的等倍）。

1.2.6实验周期、取材及标本处理小鼠腹腔感染cvb32小时后，各组灌服相应药物，正常对照组和模型对照组蒸馏水灌胃，每日1次，共14天。实验动物在给药后第15天，无菌操作下摘眼球取血，分离血清（放入-20℃冰箱储藏），随后迅速将小鼠颈椎脱臼处死，剖开胸腔，剪取心脏，将心脏置于10%甲醛溶液固定保存，待做he染色。

1.2.7检测指标心功能（心脏射血分数ef、左心室断轴缩短率fs）、心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶（ck-mb）和心肌肌钙蛋白（ctni、ctnt）、病理形态学改变（he染色）、心肌梗死面积、心肌组织内病毒载量。

1.2.8统计学处理实验数据经excel表建库整理后，用spss13.0统计软件包进行分析，计量资料以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用t检验，以p<0.05表示差异有统计学意义。

1.3实验结果

1.3.1该中药有效部位群对vmc小鼠心功能的影响模型组ef、fs下降明显；本复方制剂各用药组心功能指标改善明显，与模型组比较有显著差异（p<0.05），中剂量组在改善心功能方面效果优于其它剂量组。结果见图2。

1.3.2该中药有效部位群对vmc小鼠血清中ck-mb、ctni和ctnt活性的影响模型组小鼠血清中ck-mb升高，心肌组织ctni和ctnt降低；本复方制剂各给药组与模型组比较，三项指标改善明显，其中高、中剂量组与模型组比有统计学差异（p<0.01）。结果见图3、图4。

1.3.3该中药有效部位群对vmc小鼠心肌病理形态的影响正常对照组小鼠心肌组织排列整齐，结构完整，细胞核明显，呈圆形或类圆形，心肌间小血管丰富，心肌间质无异常改变。模型对照组大部分心肌出现广泛融合性病变，细胞排列紊乱，片状坏死，间质水肿，并见较明显的心肌溶解、断裂或间隙加宽，心肌组织中小血管周围炎性反应明显，主要为淋巴细胞和单核细胞浸润，病变集中在心内膜下肌层和血管周围。该中药复方制剂低剂量组心肌组织点片灶状坏死范围和血管周围炎性反应与模型组比有所减轻，但仍见较明显的心肌细胞肿胀、溶解、断裂等病变。利巴韦林组和中药复方制剂高、中剂量组病变程度明显轻于模型组，病变范围进一步减小，大部分心肌细胞排列较整齐，心肌细胞肿胀、心肌溶解、炎性浸润均有减轻，病变趋于愈合。结果见图5~10。

1.3.4该中药有效部位群对vmc小鼠心肌梗死面积的影响通过测量心肌组织切片内心肌梗死部分占整个心肌面积的百分比来反映心肌坏死程度（心肌坏死程度=坏死灶内的总点数/落在整个心肌切片上的总点数×100%）。与正常组相比，模型对照组和各用药组有明显心肌坏死（p<0.01）；与模型组比较，中药复方制剂各剂量组心肌梗死面积明显减少，与之有统计学差异（p<0.01）。结果见图11。

1.3.5该中药有效部位群对cvb3致vmc小鼠心脏病毒载量的影响治疗性给予本药后，可明显降低病毒性心肌炎小鼠心脏组织内病毒载量，与模型对照组比较有显著性差异（p<0.05），抑制率为56.39%。结果见表1。

表1对cvb3致病毒性心肌炎小鼠心脏组织病毒载量的影响

注：与模型对照组比较,*p<0.05，**p<0.01

2.体外细胞实验

2.1实验材料

2.1.1动物wistar大鼠，3日齡，spf级，购自北京维通利华实验动物技术有限责任公司，许可证编号：scxk（京）2016-0008。

2.1.2细胞及病毒株人喉癌上皮细胞（hep-2），购自中国协和医科大学基础所细胞中心。cvb3、cvb4、cvb5株购自美国典型菌种保藏中心，由中国中医科学院中药研究所absl-2实验室常规传代，-80°c保存备用。

2.1.3药物及其制备方法本发明涉及的中药有效部位群，由华北理工大学中医学院制剂室提供。中药饮片均购于华北理工大学附属医院门诊，经鉴定，各味饮片实物与名称相符，质量符合《中华人民共和国药典》标准。药物用pbs配制成10mg/ml的母液，过滤除菌后备用，实验时按需要做倍比稀释。

2.1.4试剂及仪器pbs磷酸缓冲液、0.25%胰酶、dmem-h培养基、胎牛血清（美国gibco公司）；双抗（hyclore公司）；tunel试剂盒（德国roche公司）；兔抗大鼠bcl-2、bax多克隆抗体（美国cellsignalingtechnology公司）；β-actin、山羊抗兔辣根过氧化物标记酶（武汉博士德公司）。生物安全柜（a2型msc1.2，美国thermo公司）；co2培养箱（thermo-371，美国thermo公司）；倒置荧光显微镜（bx51，日本olympus公司）；超低温冰箱（ultfreezer，thermoelectroncorporation公司）。

2.2实验方法

2.2.1原代心肌细胞的分离与培养6只wistar大鼠，处死后，用75％酒精消毒乳鼠胸腹部，剪开胸腔，取心脏，去除心脏包膜及其它组织，剪取心室，用hank氏液冲洗3遍，将其剪为1~2mm³碎块，将心肌组织碎块移入离心管内，加入8ml0.25%胰蛋白酶，置37℃恒温震荡器中消化50min，待组织块消化完全后，加入2ml含10％血清的培养液终止消化，离心后弃上清液，加培养液将细胞混悬，200目滤网过滤，细胞液接种于培养瓶内，置于培养箱中孵育，24h后换液，常规培养。

2.2.2药物毒性试验将药物用培养液做1:2~1:256倍比稀释后（原始浓度10mg/ml），加到已长到单层心肌细胞培养板中，100μl/孔，每个稀释度做4个复孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃，5％co2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，确定细胞不出现明显病变的最低稀释倍数为最大无毒浓度（tc0），按reed-muench法计算50%细胞毒性浓度（tc50）。

2.2.3病毒致心肌细胞病变的抑制作用取已长成单层细胞的培养板，接种cvb3病毒液（100倍tcid50），100μl/孔，置培养箱中吸附1h后，加入最大无毒浓度以下4个浓度的抗柯胶囊总皂苷，100μl/孔，同时设病毒对照组。每日观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变为++++时记录试验结果。按reed-muench计算50％抑制浓度（ic50）和治疗指数（ti），ti=tc50/ic50。

细胞病变按6级标准判断－：细胞生长正常，无病变出现；±：细胞病变少于整个单层的10％；+：细胞病变约占整个单层细胞的25％以下；++：细胞病变约占整个单层细胞的50％以下；+++：细胞病变约占整个单层细胞的75％以下；++++：细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。

2.2.4心肌细胞凋亡率4%多聚甲醛固定细胞，用1%tritonx-100通透2min，再用pbs漂洗，加入含tdt、dig-dutp的标记反应液，37℃孵育1h，pbs漂洗，3%h2o2封闭，以dab显色5min，苏木精复染，脱水、封固。显微镜下观察，胞质或胞核中有棕色颗粒者为凋亡细胞。每组取3张切片，每张切片采集10个视野（40×），对凋亡的细胞计数，计算凋亡指数（ai）。

ai（%）=凋亡的细胞核数／总计数的细胞核数×100%

2.2.5心肌细胞中bcl-2、bax蛋白表达取心肌细胞，加入200ulripa缓冲液，混匀后置冰上裂解40min，10000rpm×15min离心，均浆后提取蛋白，定量变性后行sds-page，转膜，封闭，加入bax、bcl-2抗体（1:1000），4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗，37℃孵育2h，洗膜，ecl显影液孵育，拍照，分析蛋白条带灰度值。

2.2.6统计学处理实验数据经excel表建库整理后，用spss13.0统计软件包进行分析，计量资料以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用t检验，以p<0.05表示差异有统计学意义。

2.3实验结果

2.3.1该中药有效部位群对心肌细胞毒性试验该药对大鼠心肌细胞的tc0为78.13ug•ml^-1，tc50为269.52ug•ml^-1。结果见表2。

2.3.2该中药有效部位群对病毒致心肌细胞病变的抑制作用该药在体外对肠道病毒cvb3、cvb4、cvb5株致心肌细胞细胞病变有明显的抑制作用，其ic50分别为46.67、67.76、67.76ug•ml^-1，ti分别为5.78、3.98、3.98。结果见表3、表4。

2.3.3该中药有效部位群对病毒致细胞病变的抑制作用该药在体外对肠道病毒cvb3、cvb4、cvb5株致心肌细胞细胞病变有明显的抑制作用，其ic50分别为46.67、67.76、67.76ug•ml^-1，ti分别为5.98、3.98、3.98。结果见表5、表6。

2.3.4该中药有效部位群对心肌细胞凋亡的抑制作用病毒组心肌细胞凋亡指数为32%，该药干预后心肌细胞凋亡指数显著降低，其中19.54、39.07、78.13ug/ml剂量组对细胞凋亡抑制作用尤为明显，与病毒组比较有显著差异（p<0.05）。在有效药物浓度范围内，药物浓度越高，细胞凋亡指数越低。结果见图12。

2.3.5该中药有效部位群对凋亡因子bcl-2、bax蛋白表达的影响病毒对照组心肌细胞bcl-2蛋白表达降低，bax蛋白表达增加，bcl-2/bax的比值降低；加入不同剂量该中药制剂后，心肌细胞bcl-2表达增加，bax表达下降；该药三个剂量组与病毒对照组比较，bcl-2蛋白表达增加，bax蛋白表达降低（p<0.05），随着受试药物剂量的降低，bcl-2/bax的比值逐渐减小。结果见图13。

3.实验数据综合讨论

体内动物实验：采用腹腔无菌注射0.2ml0.8倍id50的cvb3病毒液的方法制备病毒性心肌炎小鼠模型，设中药有效部位群高、中、低剂量组，利巴韦林组，同时设正常对照组和模型对照组，各组给予相应药物14天后，检测心功能、心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶（ck-mb）和心肌肌钙蛋白（ctni、ctnt）、病理改变（he染色）及心肌梗死面积。实验结果显示，给予该中药有效部位群后，小鼠心功能指标改善明显，ck-mb、ctni、ctnt含量降低，病理损伤及心肌梗死面积减少。以上数据说明该药可以改善病毒性心肌炎小鼠心肌的结构和功能，其作用可能通过减轻心肌细胞损伤，改善心肌缺血和功能，提高耐缺氧能力来实现。

体外细胞实验：分离培养大鼠原代心肌细胞，确定该药最大无毒浓度（tc0）。取已长成单层细胞的培养板，接种含cvb3的病毒液，置培养箱中吸附1h后，加入tc0以下4个浓度的受试药物，同时设病毒对照组，采用细胞病变效应法（cpe）测定该药对cvb350％抑制浓度（ic50）和治疗指数（ti）；tdt介导的dutp缺口末端标记技术（tunel法）测定心肌细胞凋亡率；蛋白免疫印迹法（western-blot）检测bax及bcl-2蛋白的表达情况。实验结果显示，该药对肠道病毒cvb3株致心肌细胞病变具有明显的抑制作用，心肌细胞凋亡指数下降，该药干预染毒心肌细胞后，bcl-2蛋白表达升高，bax蛋白表达降低，bax/bcl-2比值下降。以上数据说明，该药在外实验中对抑制细胞凋亡表现出明显的药效作用，其机制可能与抑制病毒在细胞内增殖及上调bcl-2表达、下调bax表达有关。

本发明实验数据部分：在动物模型上，运用cvb3株感染balb/c乳鼠成功制备了小鼠病毒性心肌炎疾病模型，通过治疗性给药，评价了该中药有效部位群对病毒性心肌炎模型小鼠的药效作用；在细胞模型上，观察了中药有效部位群对cvb3、cvb4、cvb5三种病毒性心肌炎常见致病病毒株的抗病毒作用，为本发明临床用药提供了实验依据，同时为病毒性心肌炎药效评价提供了方法学参考。

第四部分：本中药有效部位群治疗小儿病毒性心肌炎的优点和有益效果

本发明治疗小儿病毒性心肌炎有显著的优点和有益效果。首先，该中药有效部位群组成及制备工艺简单。本发明仅有西洋参根总皂苷、黄芪根总皂苷、牡丹皮根总皂苷和王不留行总皂苷四种有效部位群组成。制备方法为醇提后有机溶剂萃取的方式制备。其次，原料药来源广，价格低廉。该药中的原料药材西洋参、黄芪、丹参、王不留行，来源广泛，可以减轻患者的社会和经济负担。第三，药效显著，安全无毒。本发明通过体内外药效试验证明，该药可以改善病毒性心肌炎小鼠心肌的结构和功能，对病毒所致的心肌细胞损伤有很好的保护作用。大鼠长毒实验提示本发明临床拟用剂量安全，无明显毒副作用。第四，便于小儿服用，便于储藏。本发明为中药有效部位群组成的新制剂，临床应用剂量少，便于小儿患者服用，该药有效组分性状为粉末，故稳定性好便于储藏。

小儿病毒性心肌炎的治疗药物种类有限，亟需开发新的治疗药物。西药治疗主要针对病毒感染和心肌炎症对症治疗，但效果均不理想，常有不同程度的不良反应，且价格昂贵。中药文献虽记载了许多复方来治疗该病，但临床应用剂量较大，特别是存在小儿中药服量大、难应用的缺点，并且其保护心肌的机理有待进一步研究和证实，所以研究有效中药成分应用于难治性疾病的治疗显得尤为迫切。把古人的经验与现代药理学研究的成果结合起来，筛选新的、高效无毒的、由有效活性成分组成的治疗病毒性心肌炎的新型中药是当务之急。本发明可用于病毒致小儿心肌损伤的治疗，并具有出人意料的技术效果。

迄今为止，有关本中药有效部位群在小儿病毒性心肌炎中的应用还没有文献报道，本发明治疗病毒致心肌细胞损伤的优点和有益效果，如下：

1.组成及制备工艺简单。本发明仅有西洋参根总皂苷、黄芪根总皂苷、牡丹皮根总皂苷和王不留行总皂苷四种有效部位组成。制备方法为醇提后有机溶剂萃取的方式制备。

2.原料药来源广，价格低廉。该中药有效部位群中的原料药材西洋参、黄芪、丹参和王不留行来源广泛，与治疗小儿病毒性心肌炎的常规西药干扰素、辅酶q10和青霉素等相比，价格更便宜。另外，该中药有效部位群制备工艺简单，无需复杂的仪器设备。整个药品造价低，可以减轻患者的社会和经济负担。

3.药效显著，安全无毒。本发明通过体内外药效试验证明，该中药有效部位群在病毒致心肌细胞损伤中，特别是cvb3引起的心肌细胞损伤，以及cvb3引发细胞凋亡中表现出明显的药效作用。该药可以改善病毒性心肌炎小鼠心肌的结构和功能，对病毒所致的心肌细胞损伤有很好的保护作用。sd大鼠灌胃该中药复方制剂26周，其无毒反应剂量为200mg/kg，相当于拟临床用量的40倍，sd大鼠未表现出明显的毒性反应，提示本发明临床拟用剂量安全，无明显毒副作用。

4.服药剂量小，便于小儿服用。中药复方多数临床应用剂量较大，对小儿患者来说存在服量大、难应用的缺点，本发明为中药有效部位群组成的新制剂，临床应用剂量大大减少，便于小儿患者服用。

5.服用方便，便于储藏。该中药有效部位群为口服药，服用方便。药品有效组分性状为粉末，故稳定性好，使用固体或糖浆制剂，如片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、糖浆等，便于储藏。