一种双层疏水-亲水改性中空纳米硅球、其制备方法及应用与流程

本发明属于超声成像造影材料领域，具体涉及一种内层疏水外层亲水的双层中空纳米硅球，另外本发明还涉及该双层中空纳米硅球的制备方法和应用。

背景技术：

早期的造影剂，包括含有自由气泡的液体；含有悬浮颗粒的胶状体；乳化液体等。缺点是尺寸大、不稳定、效果差。自由气泡是超声造影剂最简单的形式，中国临床采用过h2o2作为超声造影剂，它进入血液后生成游离氧，多用于心动学中的造影。由于自由气泡尺寸太大很不稳定，不能通过肺循环，不适于心脏造影。含悬浮颗粒的胶状体可用于增强软组织背向散射，且有较好的造影效果，它的存活时间长。但考虑到毒性的影响，只能小剂量使用，限制了其应用范围。脂类化合物作为超声造影剂是从脂肪肝的回波能力增强中得到的启示，它的增强效率较低。由许多化合物组成的水溶液进入人体后，使循环系统的声速和密度随造影剂的浓度发生变化，在脉管和非脉管组织间引起声阻抗差异，从而增强脉管系统的背向散射，但其增强效率太低。

90年代初以来，超声造影剂的研究工作取得了很大的进展。与早期的超声造影剂相比，直径为几个μm的可通过肺循环的包膜超声造影剂的应用效果最佳、应用范围更广、稳定性更好。而同时，世界上一些公司和研究机构研制了不同的超声造影剂，用于动物实验和临床研究的超声造影剂已投放市场。各种造影剂都能不同程度地增强组织的回波能力，并可用于谐波测量与成像。

造影剂的分代是主要是依据微泡内包裹气体的种类来划分的。第一代造影剂微泡内含空气，包膜一般为白蛋白或半乳糖等聚合体。第一代超声造影剂的物理特性，包括包膜较厚，弹性差，而且包裹的空气易溶于水等，决定了它持续时间短，容易破裂，从而限制了临床应用中观察和诊断的时间。第二代超声造影剂为包裹高密度惰性气体(不易溶于水或血液)为主的外膜薄而柔软的气泡，直径一般在2-5μm左右，稳定时间长，振动及回波特性好。

近年来，硅球由于生物相容性好、易于改性等原因备受关注，其中中空纳米硅球由于其尺寸较小内部可负载空气等原因在超声造影剂方面崭露头角，但是由于中空硅球表面均存在孔穴结构，使得其内包覆的空气极易溶于血液，从而导致超声信号减弱，持续时间短暂，一定程度上限制了临床观察诊断时间，因此需要开发一种基于中空硅球的较为稳定的超声造影剂。

技术实现要素：

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种双层疏水-亲水改性的中空纳米硅球，该中空纳米硅球粒径分布均匀，单分散性良好，中空结构优越，生物相容性良好，为工业化生产提供可行性，为超声造影剂的研究提供了新的途径，具有良好的社会和经济效益。

本发明的另一目的是提供一种上述提及的双层疏水-亲水改性的中空纳米硅球的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述提及的双层疏水-亲水改性的中空纳米硅球作为超声造影材料的应用，特别是作为超声造影剂的应用。

本发明的技术方案如下：

一种双层疏水-亲水改性的中空纳米硅球，它包括由含有疏水基团的有机硅烷和四乙氧基硅烷进行杂化水解聚合形成的带有疏水基团的内壳和在该内壳上与3-氨丙基三乙氧基硅烷进行水解聚合形成的亲水性外壳。

在一种优选方案中，本发明提供的中空纳米硅球，粒径分布均匀，分散性好，具有适宜的空腔尺寸，粒径为300～450nm，优选为350～400nm；壳层厚度为20～40nm，优选为25～35nm。

本发明提及的含有疏水基团的有机硅烷为现有技术中含有疏水基团的有机硅烷，例如：辛基三乙氧基硅烷、十八烷基三乙氧基硅烷或十七氟癸基三乙氧基硅烷中的一种或几种。

本发明提及的十七氟癸基三乙氧基硅烷，中文名称为1h,1h,2h,2h-全氟癸基三乙氧基硅烷，可以缩写成pfdts。

本发明提供的双层疏水-亲水改性的中空纳米硅球，粒径分布均匀，分散性好，具有适宜的空腔尺寸，极大程度提高超声信号强度、延长造影持续时间，且制备相对简单、生物相容性好。

一种双层疏水-亲水改性的中空纳米硅球的制备方法，它包括以下步骤：在聚苯乙烯微球(ps)上通过含有疏水基团的有机硅烷和四乙氧基硅烷(teos)的杂化水解聚合形成带有疏水基团的核壳结构后，进行萃取，去除核心聚苯乙烯得到中空硅球结构后，3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)在该中空硅球结构上进行水解聚合形成内层疏水外层亲水的中空纳米硅球。

在一种优选方案中，本发明提供一种双层疏水-亲水改性的中空纳米硅球的制备方法，它包括以下步骤：

(1)聚苯乙烯微球的制备：pvp-40000、aiba和苯乙烯在60～80℃进行反应，得到聚苯乙烯微球；

(2)内层疏水基团的形成：ctab与步骤(1)制备的聚苯乙烯微球、氨水、四乙氧基硅烷和含有疏水基团的有机硅烷在50～70℃进行反应；

(3)中空硅球结构的形成：将步骤(2)得到的产物进行萃取；

(4)亲水层的形成：将步骤(3)得到的产物与3-氨丙基三乙氧基硅烷在90～110℃进行反应，即得。

在一种更优选方案中，本发明提供一种双层疏水-亲水改性的中空纳米硅球的制备方法，它包括以下步骤：

(1)聚苯乙烯微球的制备：pvp-40000、aiba和苯乙烯在60～80℃进行反应同时搅拌，洗涤后，得到聚苯乙烯微球；

(2)内层疏水基团的形成：ctab溶解于异丙醇和去离子水中，加入步骤(1)制备的聚苯乙烯微球、氨水、四乙氧基硅烷和含有疏水基团的有机硅烷的混合溶液，搅拌的同时在50～70℃进行反应，离心后，洗涤；

(3)中空硅球结构的形成：将步骤(2)得到的产物分散于甲苯或四氢呋喃中，在100～120℃进行萃取，搅拌，再洗涤；

(4)亲水层的形成：将步骤(3)得到的产物与3-氨丙基三乙氧基硅烷在90～110℃进行反应，搅拌，离心后洗涤，即得。

本发明在制备双层疏水-亲水改性的中空纳米硅球时，提及的含有疏水基团的有机硅烷为现有技术中含有疏水基团的有机硅烷，例如：辛基三乙氧基硅烷、十八烷基三乙氧基硅烷或十七氟癸基三乙氧基硅烷中的一种或几种。

由于核心聚苯乙烯球的粒径、加入硅烷和氨水的体积以及温度和反应时间都会影响中空硅球的粒径。同时不同的低极性萃取剂对核心ps的萃取程度也不尽相同。本发明通过控制反应温度和加入硅烷、氨水的体积，选择制备纳米级别的聚苯乙烯球体，在甲苯或四氢呋喃的条件下进行萃取，合成纳米级别的双层中空硅球，极大程度的增大了球体内空腔体积，增加了空气吸附量，拥有卓越的超声信号增强效果。

本发明提及的一种内层疏水外层亲水的双层中空纳米硅球的制备方法，在一种优选方案中，是以异丙醇和去离子水为溶剂，氨水为催化剂，ctab为致孔剂，采用有机-无机硅烷杂化水解聚合的方法制得含有疏水基团的内层结构，然后通过在甲苯或者thf的条件下萃取去除核心聚苯乙烯(ps)，最后修饰aptes是以甲苯为溶剂，氮气保护下进行的。

在一种优选方案中，在步骤(1)中，pvp-40000、aiba和苯乙烯在70℃进行反应，洗涤后，得到聚苯乙烯微球。

在一种更优选方案中，步骤(1)中，聚苯乙烯微球的粒径为250～400nm。

在一种优选方案中，在步骤(2)中，在内层疏水基团的形成的过程中，ctab溶解于异丙醇和去离子水中，加入步骤(1)制备的聚苯乙烯微球、氨水、四乙氧基硅烷和含有疏水基团的有机硅烷的混合溶液，搅拌的同时在60℃进行反应。

进一步的，在步骤(2)中，反应时间为4～12小时，例如，6小时。

本发明可以将聚苯乙烯微球用乙醇洗涤，制成聚苯乙烯微球乙醇溶液，例如，浓度可以为0.1g/ml，也就是说，1ml乙醇溶液有核心聚苯乙烯球体的质量为0.1g。

进一步的，聚苯乙烯微球和四乙氧基硅烷的质量体积比为0.8:1～2.0:1g/ml；优选为0.8:1～1.4:1g/ml；特别优选为1.1:1g/ml。

进一步的，加入氨水调节ph为8～10；优选为9。例如，氨水的质量浓度为25％-28％。

进一步的，四乙氧基硅烷和含有疏水基团的有机硅烷的体积比为2:1～6:1；优选为4:1。

在一种优选方案中，将步骤(3)得到的产物与3-氨丙基三乙氧基硅烷在110℃进行反应。

进一步的，步骤(4)中，3-氨丙基三乙氧基硅烷在反应液中的浓度为0.5～1.5％(v/v)；优选为1％。

在一种优选方案中，步骤(4)中，将步骤(3)得到的产物与3-氨丙基三乙氧基硅烷在100℃进行反应。

进一步的，在步骤(4)中，反应时间为8～20小时，例如，12小时。

进一步的，步骤(1)和(3)中搅拌速度为250～350rpm，优选为300rpm；步骤(2)中搅拌速度为450～550rpm，优选为500rpm。

在一种优选方案中，在步骤(1)至步骤(4)中进行洗涤的同时超声处理辅助巴氏吸管吹打，使得离心得到的沉淀充分分散均匀。

在一种特别优选的方案中，本发明提供一种双层疏水-亲水改性的中空纳米硅球的制备方法，它包括以下步骤：

(1)聚苯乙烯(ps)球的制备：pvp-40000溶于异丙醇和去离子水中，超声混匀后，再加入aiba和苯乙烯，n2脱气1h后，于70℃油浴、300rpm、加热回流24h，放入冰箱-20℃冷冻过夜，取出于室温下化冻后，8000rpm离心20min后，用乙醇洗涤，从而得到ps微球的乙醇溶液。

(2)采用有机-无机硅烷杂化水解聚合的方法制得含有疏水基团的内层结构：ctab溶于异丙醇和去离子水中，超声加速溶解，加入已经制备好的ps微球的乙醇溶液，氨水，teos和含疏水基团的有机硅烷(vteos/v含疏水基团的有机硅烷＝4/1)，300rpm搅拌，在60℃反应6h，反应结束后离心，沉淀用无水乙醇、甲苯洗涤。

(3)中空硅球结构的形成：将步骤(2)得到的产物重新分散于甲苯或四氢呋喃中，500rpm搅拌110℃油浴加热回流24h，用甲苯洗涤后分散于甲苯。

(4)外层亲水层的构建：将步骤(3)得到的产物分散于甲苯中，加入aptes，氮气保护、300rpm搅拌，100℃油浴加热回流12h，依次用甲苯、thf、乙醇、去离子水离心洗涤，冻干12h，即得到双层疏水-亲水改性中空纳米硅球粉末。

本发明制备的双层改性中空硅球与teos直接聚合在ps球上再通过低极性有机溶剂萃取得到的中空硅球相比，有更大的空腔结构，更好的形貌特征，同时由于内层疏水基团更易保持空腔结构，可极大增强超声散射信号强度，有望成为新型的超声造影剂。本发明的双层疏水-亲水改性的中空纳米硅球反应条件较为简单，且硅球粒径分布均匀，为工业化生产提供可行性，为超声造影剂的开发提供了新的途径。

目前国内外对二氧化硅微球的研究主要在药物或者dna的运输以及药物的释放等方面，而在超声成像领域的应用研究鲜见报道，专利cn102068706a公开了一种二氧化硅超声成像造影材料的制备方法，利用硬模板，在水醇体系中，水解非功能化硅源和带有氨基的功能化硅源，从而得到表面带氨基的硅球，萃取除去硬模板，得到粒径非常均一中空的表面带氨基的sio2球；再通过其表面的氨基与聚乙二醇(peg)羧基相偶合进行表面修饰，便可以在其表面修饰上生物相容性很好的聚乙二醇，得到用于超声成像的sio2超声成像造影材料。但是，上述专利制备的sio2纳米微球平均粒径为960nm，壳层厚度适为30～50nm，难以应用于心肌细胞坏死的检测，不能通过肺循环进入人体血液循环，不适于心脏造影。由于检测心肌细胞坏死时，需要纳米超声造影剂材料深入组织，对纳米超声造影剂材料的要求较高，例如，粒径不能大于700纳米。然而，本发明制备内层疏水外层亲水的中空纳米硅球，具有相反的极性，粒径为300～450nm，粒径分布均匀，分散性好，具有适宜的空腔尺寸，能够增强超声信号和延长信号持续时间，可通过肺循环进入人体血液循环，应用于心肌细胞坏死的检测。

相对于，专利cn102068706a公开的用于超声成像的sio2超声成像造影材料，本发明自行制备的聚苯乙烯微球，粒径为250～400nm。在该聚苯乙烯微球上通过含有疏水基团的有机硅烷和四乙氧基硅烷的杂化水解聚合形成带有疏水基团的核壳结构后，进行萃取，去除核心聚苯乙烯得到中空硅球结构后，3-氨丙基三乙氧基硅烷在该中空硅球结构上进行水解聚合形成内层疏水外层亲水的中空纳米硅球，用于超声造影材料，粒径为300～450nm，生物相容性好，具有更广阔的应用前景，极大程度提高了超声信号强度、延长了造影持续时间，具有良好的社会和经济效益。

本发明提供的双层疏水-亲水改性的中空纳米硅球可以用于超声造影材料，特别是作为超声造影剂的应用。

采用本发明的技术方案，优势如下:

本发明提供一种内层疏水外层亲水的双层中空纳米硅球的制备方法，不需要高压等反应条件，且中空硅球粒径分布均匀，单分散性良好，具有适宜的空腔尺寸，极大程度提高超声信号强度、延长造影持续时间，且制备相对简单、生物相容性好，为工业化生产提供可行性，为超声造影剂的研究提供了新的途径，具有良好的社会和经济效益。

附图说明

图1是透射电镜图；

其中，图(a)为实施例1制备的双层中空纳米硅球；图(b)为对比例1制备的不含疏水基团的单层中空纳米硅球；图(c)为实施例2制备的双层中空纳米硅球；

图2为在pbs溶液里不同浓度的sio2实心球体和实施例1制备的双层中空纳米硅球的体外溶液超声图片；

其中，图(a)为不同浓度的sio2实心球体；图(b)为不同浓度的对比例1制备的不含疏水基团的单层中空纳米硅球；图(c)为不同浓度的实施例1制备的双层中空纳米硅球；

图3是浓度为0.6mg/ml在pbs溶液里的对比例1制备的不含疏水基团的单层中空硅球和实施例1制备的双层中空硅球平均灰度值(造影成像强度)随超声处理时间的变化折线图；

图4是ft-ir图像；

其中，图(a)为实施例1制备的双层中空纳米硅球ft-ir图；图(b)为实施例2制备的双层中空纳米硅球ft-ir图。

具体实施方式

通过以下实施例并结合附图对本发明的制备方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

实施例1

一种内层含有疏水基团十七氟癸基外层亲水的双层中空纳米硅球的制备方法，包括以下步骤：

(1)(聚苯乙烯)ps球的制备：量取100ml去离子水于250ml三颈烧瓶中，加入pvp-400001.0g，超声混匀后，继而加入aiba0.41g和11ml苯乙烯，n2脱气1h后，于70℃油浴、300rpm、加热回流24h，放入冰箱-20℃冷冻过夜，取出于室温下化冻后，8000rpm离心20min后，用乙醇洗涤，从而得到ps微球的乙醇溶液(0.1g/ml，即1ml乙醇溶液有核心聚苯乙烯球体的质量为0.1g)，ps微球的乙醇溶液中聚苯乙烯微球的粒径为250～400nm。

(2)内层疏水基团十七氟癸基的形成：量取21ml异丙醇和10ml去离子水于100ml三颈烧瓶内，精密称取0.25gctab于反应体系中，超声加速溶解，加入制备的ps微球的乙醇溶液4ml后，于60℃油浴下，300rpm搅拌30min后，加入750μl氨水(质量浓度为25％-28％)，和450μlteos和pfdts的混合液(vteos/vpfdts＝4/1)后，继续反应6h，反应结束后，离心，沉淀用无水乙醇、甲苯洗涤。

(3)中空硅球结构的形成：将步骤(2)产物分散在45ml甲苯里，随后于110℃油浴加热回流，500rpm搅拌24h后，用甲苯洗涤，即得到中空硅球结构。

(4)亲水层的形成：将步骤(3)产物分散在40ml甲苯里，加入400μlaptes，于100℃油浴加热回流，n2保护，300rpm搅拌12h后，依次用甲苯、thf、乙醇、去离子水离心洗涤，冻干12h，即得内层含有疏水基团十七氟癸基外层亲水的双层中空纳米硅球粉末，如图1(a)所示，所制备的中空纳米硅球粒径大小均匀，380nm左右，壳体厚度为30nm，中空孔穴结构良好且单分散。

ft-ir图如图4(a)所示，其中3300cm^-1为n-h伸缩振动引起的；1240、1206、1149cm^-1是由c-f、-cf2、-cf3伸缩振动引起的；1070cm^-1是由si-o-si不对称伸缩振动引起的。由此可知pfdts成功掺杂二氧化硅壳体中以及氨基成功修饰。

在一种优选方案中，实施例1记载的内层含有疏水基团十七氟癸基外层亲水的双层中空纳米硅球的制备方法中，每一个步骤在进行洗涤操作时，洗涤的同时要超声处理辅助巴氏吸管吹打使得离心得到的沉淀充分分散均匀。

内层含有疏水基团十七氟癸基外层亲水的双层中空纳米硅球(实施例1制备)体外溶液超声成像实验：

为了和内层含有疏水基团十七氟癸基外层亲水的双层中空纳米硅球产生对照效果，采用不含疏水基团的单层中空纳米硅球(对比例1制备)作为对照，同时也合成了实心的粒径约150nm左右的硅球作为对照，具体合成步骤如下：

量取无水乙醇37ml、去离子水5ml于100ml三颈烧瓶内，再加入1.6ml氨水，待搅拌均匀后，加入3mlteos，500rpm室温搅拌1h后，用无水乙醇离心洗涤三遍得到粒径约为150nm的硅球。

分别配置浓度为0.1、0.3、0.6和1.0mg/ml的sio2实心球体、对比例1不含疏水基团的单层中空硅球和含十七氟癸基疏水基团中空硅球(实施例1制备)的pbs溶液各1.5ml于2mlep管内，随后加入0.4％(m/v)的琼脂糖水溶液0.4ml来封口，研究超声造影强度与浓度的关系。

结果如图2所示：实施例1制备的中空纳米硅球相比于对照组中sio2实心球体以及对比例1单层中空硅球和在浓度为0.1、0.3、0.6和1.0mg/ml时超声强度明显增加，增强的强度为对比例1中的四倍。因此充分证明本发明实施例1所制备的双层疏水-亲水中空纳米硅球具有卓越的超声显影性能，能够作为超声造影剂。

实施例1所制备的双层疏水-亲水中空纳米硅球体外溶液超声成像稳定性实验：

在pbs溶液里配置浓度为0.6mg/ml的双层疏水-亲水中空纳米硅球1.5ml于2mlep管内，随后加入0.4％(m/v)的琼脂糖水溶液0.4ml来封口，经过1、15、30和60min超声处理时间，测量其超声造影平均灰度值的变化，以对比例1制备的不含疏水基团单层中空硅球作为对照，研究超声造影强度与超声处理时间的关系。

结果如图3所示：实施例1所制备的双层疏水-亲水中空纳米硅球在经过长达60min的超声处理时间下，相比较对比例1仍然有较高的造影对比强度信号(是对比例1的四倍)，而且信号强度没有衰减，说明实施例1所制备的双层疏水-亲水中空纳米硅球具有良好的超声显影稳定性，能够作为超声造影剂。

实施例2

一种内层含有疏水基团十八烷基外层亲水的双层中空纳米硅球的制备方法，包括以下步骤：

(1)(聚苯乙烯)ps球的制备：量取100ml去离子水于250ml三颈烧瓶中，加入pvp-400001.0g，超声混匀后，继而加入aiba0.41g和11ml苯乙烯，n2脱气1h后，于70℃油浴、300rpm、加热回流24h，放入冰箱-20℃冷冻过夜，取出于室温下化冻后，8000rpm离心20min后，用乙醇洗涤，从而得到ps微球的乙醇溶液(0.1g/ml，即1ml乙醇溶液有核心聚苯乙烯球体的质量为0.1g)，ps微球的乙醇溶液中聚苯乙烯微球的粒径为250～400nm。

(2)内层疏水基团十八烷基的形成：量取27ml异丙醇和4ml去离子水于100ml三颈烧瓶内，精密称取0.4gctab于反应体系中，超声加速溶解，加入制备的ps微球的乙醇溶液4ml后，于50℃油浴下，300rpm搅拌30min后，加入500μl氨水(质量浓度为25％-28％)，和450μlteos和十八烷基三乙氧基硅烷的混合液(vteos/vc18＝4/1)后，继续反应6h，反应结束后，离心，沉淀用无水乙醇、甲苯洗涤。

(3)中空硅球结构的形成：将步骤(2)产物分散在45ml甲苯里，随后于110℃油浴加热回流，500rpm搅拌24h后，用甲苯洗涤，即得到中空硅球结构。

(4)亲水层的形成：将步骤(3)产物分散在40ml甲苯里，加入600μlaptes，于100℃油浴加热回流，n2保护，300rpm搅拌12h后，依次用甲苯、thf、乙醇、去离子水离心洗涤，冻干12h，即得内层含有疏水基团十八烷基外层亲水的双层中空纳米硅球粉末，如图1(c)所示，所制备的中空纳米硅球粒径大小均匀，300nm左右，壳体厚度为25nm，中空孔穴结构良好且单分散。

ft-ir图如图4(b)所示，其中3300cm^-1为n-h伸缩振动引起的；2975cm^-1是由-ch3伸缩振动引起的；2920、2849cm^-1是由-ch2伸缩振动引起的；1070cm^-1是由si-o-si不对称伸缩振动引起的。由此可知c18基团成功掺杂二氧化硅壳体中以及氨基成功修饰。

在一种优选方案中，实施例2记载的内层含有疏水基团十八烷基外层亲水的双层中空纳米硅球的制备方法中，每一个步骤在进行洗涤操作时，洗涤的同时要超声处理辅助巴氏吸管吹打使得离心得到的沉淀充分分散均匀。

对比例1

一种teos聚合在ps上经萃取ps后形成的单层中空纳米硅球的制备方法，其具体步骤如下：

(1)聚苯乙烯(ps)球的制备：同实施例1。

(2)核壳结构的制备：量取21ml去离子水和10ml无水乙醇于100ml三颈烧瓶内，精密称取0.25gctab于反应体系中，超声加速溶解，加入制备的ps乙醇溶液4ml后，于60℃油浴下，300rpm搅拌30min后，加入750μl氨水(质量浓度为25％-28％)后，滴加450μlteos后，继续反应6h，反应结束后，离心，沉淀用无水乙醇、甲苯洗涤。

(3)中空硅球的制备：将(2)中的产物分散在45ml甲苯里，于110℃油浴加热回流，500rpm搅拌24h后，即得单层sio2壳结构的中空硅球。

tem结果如图1(b)所示，图中显示其内空腔结构较实施例1中的要小，粒径约为360nm，壳层厚度约为70nm，而且有些核心萃取不完全。

综上所述，本发明构建的双层疏水-亲水中空纳米硅球制备过程较为简单，形貌结构良好，可以用于新型超声造影剂的开发。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。