一种可调节降解速率的POSS-PEG杂化水凝胶及其制备方法和其应用与流程

本发明涉及水凝胶高分子材料领域，尤其涉及一种可调节降解速率的poss-peg杂化水凝胶及其制备方法和其应用。

背景技术：

3d支架在组织工程和3d细胞培养应用中起着至关重要的作用。随着组织工程的快速发展，3d支架在各种生物医学有了极大的应用潜力，因此对它的要求也越来越高。为了诱导细胞粘附，增殖和活化以指导特定细胞的生长和分化，用于制备支架的材料必须具有生物相容性，适合的降解速率，孔隙率，适当的机械稳定性和适当的化学诱导以对细胞进行分子生物识别。

用作3d细胞培养的支架材料需要一段时间的生物相容性和机械强度，并且最终应以所需的降解速率在体内降解，同时避免任何免疫应答。聚(乙二醇)(peg)水凝胶是组织工程中用于细胞包封和移植的最广泛的支架材料之一，具有优异的生物相容性，亲水性，非免疫原性和抗蛋白质吸附。此外，它们的生物降解性是另一个重要特征。peg水凝胶的生物降解性可以通过酶促，水解或环境途径如掺入可降解组分来实现。此外，通过改变peg的分子量和浓度，可以改善peg水凝胶的机械性能。

多面体低聚倍半硅氧烷(poss)具有立方笼形纳米结构，分子尺寸在1-3nm之间，由核心的si-o-si键组成的无机骨架和外部有机取代基组成的有机-无机纳米杂化结构，具有良好的生物相容性，特殊的表面性能和高机械性能。将单官能团的典型poss分子引入peg水凝胶上，少量的poss即可引起水凝胶性质的显著变化。其制备出的poss-peg杂化水凝胶，不仅能增强水凝胶的力学性能，更能延缓一定时间的降解速率，但上述降解速率固定且不可调，无法适应多种使用情景的需要。

技术实现要素：

针对水凝胶存在的上述问题，现提供一种可调节降解速率的poss-peg杂化水凝胶及其制备方法和其应用，旨在提供一种生物相容性好、成胶快、力学性能好无毒且具有可调控降解速率的水凝胶材料。

具体技术方案如下：

本发明的第一个方面是提供一种可调节降解速率的poss-peg杂化水凝胶的制备方法，具有这样的特质，包括如下步骤：将4-arm-peg-mal与poss-sh在有机溶剂中通过michael加成反应制得poss-peg预聚物；将poss-peg预聚物与交联剂溶解于缓冲液中得到预成胶溶液，将预成胶溶液在反应温度下通过michael加成反应制得一种可调节降解速率的poss-peg杂化水凝胶；其中，步骤二中交联剂由peg-dithiol及peg-diester-dithiol混合形成。

上述的制备方法，还具有这样的特征，有机溶剂选自四氢呋喃、二氯甲烷、甲醇或丙酮中的一种。

上述的制备方法，还具有这样的特征，4-arm-peg-mal中功能基-mal与功能基-sh(交联剂中的总-sh数)的摩尔比为1:1-1.5。

上述的制备方法，还具有这样的特征，缓冲液为tea。

上述的制备方法，还具有这样的特征，tea的ph＝7.4，且其浓度为4mm。

上述的制备方法，还具有这样的特征，反应温度为25-40℃，交联时间为0-30min。

上述的制备方法，还具有这样的特征，杂化水凝胶中交联剂的质量百分比为25-100％。

本发明中4-arm-peg-mal(四枝状马来酰亚胺基功能化聚乙二醇)为市售产品(北京健凯科技有限公司提供)，优选的，本发明中选择平均分子量为5-20kda的4-arm-peg-mal。

本发明中poss-sh(单角巯基多面体低聚倍半硅氧烷)为市售产品(sigma公司提供)，其cas号为480438-85-5。

本发明中peg-dithiol(聚乙二醇二硫醇)为市售产品(北京健凯科技有限公司提供)，优选的，本发明中选择平均分子量为2-4kda的peg-dithiol。

本发明中peg-diester-dithiol(聚乙二醇二酯二硫醇)为实验室自主合成产品(参考文献：zustiaks.p.,leachj.b.hydrolyticallydegradablepoly(ethyleneglycol)hydrogelcaffoldswithtunabledegradationandmechanicalproperties[j].biomacromolecules,2010,11:1348-135)，经各类测试手段表征，本发明中peg-diester-dithiol的平均分子量为2-4kda。

本发明的第二个方面是提供一种利用上述制备方法制备获得的可调节降解速率的poss-peg杂化水凝胶。

本发明的第三个方面是提供一种上述可调节降解速率的poss-peg杂化水凝胶的应用，具有这样的特征，作为组织工程3d支架材料。

上述方案的有益效果是：

1)、本发明提供的poss-peg杂化水凝胶具有孔洞结构均一、生物相容性好、成胶快、力学性能好、无毒的优点；

2)、本发明提供的poss-peg杂化水凝胶可以通过调节杂化水凝胶的降解速率而延长降解周期。

附图说明

图1为本发明的实施例中提供的poss-peg杂化水凝胶的扫描电镜测试图；

图2为本发明的实施例中提供的poss-peg杂化水凝胶的降解速率折线图(2a)及柱形图(2b)；

图3为本发明的实施例中提供的poss-peg杂化水凝胶降解后的扫描电镜测试图；

图4为本发明的实施例中提供的poss-peg杂化水凝胶的体外细胞培养活死细胞染色图；

图5为本发明的实施例中提供的poss-peg杂化水凝胶3d培养的huvec细胞形貌图；

图6为利用本发明的实施例中提供的poss-peg杂化水凝胶进行3d培养的bmscs活死细胞染色荧光显微镜测试图；

图7为本发明的实施例中提供的poss-peg杂化水凝胶3d培养的bmscs成骨分化茜素红染色测试图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

一种可调节降解速率的poss-peg杂化水凝胶，其制备方法包括如下步骤：将市购的4-arm-peg-mal和poss-sh溶解于四氢呋喃中，室温搅拌反应一段时间后旋蒸除去四氢呋喃，得到poss-peg预聚物；然后将poss-peg预聚物与交联剂(由peg-dithiol及peg-diester-dithiol混合形成，其中功能基-mal与功能基-sh的摩尔比为1:1-1.5)溶解于ph＝7.4的4mm三乙醇胺缓冲液中，使它们充分的混合均匀，得到预成胶溶液；最后将预成胶溶液转移至500μl模具中，37℃生化培养箱中反应15min中，得一种可调节降解速率的poss-peg杂化水凝胶(杂化水凝胶中交联剂的质量百分比为25-100％)。

本发明的实施例1-3及对比例中各参数如下表所示：

扫描电镜如图1所示，本发明提供的poss-peg杂化水凝胶均呈多孔海绵状结构，且其孔径均匀统一，平均孔径尺寸在20～40nm之间，具有较大的孔隙率。

降解速率测试

将poss-peg杂化水凝胶冷冻干燥，准确称量其重量，然后将干燥的水凝胶加入0.01m的磷酸盐缓冲液(pbs，ph＝7.4，10ml)，置于37℃恒温生化培养箱中，4周后蒸馏水漂洗，冷冻干燥，称重，计算每组水凝胶在溶液中的累积降解百分率(％)＝(降解前水凝胶重量-降解后水凝胶质量)/降解前水凝胶重量×100％，为了确保实验准确性，每组水凝胶取3个测试样，三个测试样取平均值。

由图2所示，本发明提供的poss-peg杂化水凝胶随着交联剂中peg-diester-dithiol含量的逐渐增加，水凝胶的质量损失也逐渐变大，降解到第4周时，实施例3中提供的水凝胶已经不能保持凝胶形态，无法进行质量损失称量计算。

由图3所示，随着交联剂中peg-diester-dithiol含量的逐渐增加及降解时间的延长，本发明提供的poss-peg杂化水凝胶中原本清晰均匀的孔洞结构逐渐塌陷，到第四周后，实施例3中提供的水凝胶三维结构基本完全破坏。体外细胞培养实验

将poss-peg杂化水凝胶预成胶液各1.2ml，与人体脐静脉内皮细胞(huvec)均匀混合，细胞密度为1×10⁶/ml，分别取100μl置于九十六孔细胞培养板中，5％co2恒温培养箱37℃孵育30min，加入200μl含10％胎牛血清的低糖dmem培养基，继续孵育，分别在第1、4、7天内取出样品，进行活死细胞染色测试细胞活性，应用荧光显微镜分析图像，观察细胞活性及形态。

由图4所示，细胞能在本发明提供的杂化水凝胶内部封装，且随着培养时间的增加，细胞活力逐渐增加，表明细胞能够在该水凝胶材料内存活，说明该类水凝胶具有良好的生物相容性及无毒；且随着交联剂中peg-diester-dithiol含量的增加，细胞数目有更高的细胞增值速度。

由图5所示，细胞能在本发明提供的杂化水凝胶中生长良好，且封装的细胞在生长过程中细胞形态存在差异；同时，随着交联剂中peg-diester-dithiol含量的增加，细胞形态从细长纺锤逐渐变为圆形，当peg-diester-dithiol含量达到100％时，包封的细胞的形态是饱满和圆形的(这与水凝胶降解过程中细胞生长空间的大小有关，peg-diester-dithiol含量越高，细胞生长空间越大，细胞呈圆形；相反，细胞是细长的纺锤体形)。活死细胞染色测试

将poss-peg杂化水凝胶制得预成胶液各1.2ml，与骨髓间充质干细胞(bmscs)均匀混合，细胞密度为1×10⁶/ml，分别取100μl置于九十六孔细胞培养板中，5％co2恒温培养箱37℃孵育30min，加入200μl含10％胎牛血清的低糖dmem培养基，继续孵育，当细胞生长至约80％时，将成骨分化培养基用于培养，在第14天取出样品，进行活死细胞染色测试细胞活性，同时，为进一步证实细胞在成骨分化培养基中成骨分化，将包封在peg-diester-dithiol含量为100％的杂化水凝胶中的bmscs同时在生长培养基中培养以用于比较，并在成骨分化培养基中生长14天后，吸出培养基并用pbs洗涤两次，然后将冷冻切片用4％多聚甲醛固定20分钟，用pbs洗涤三次，然后通过用茜素红染料染色测定钙沉积。

由图6所示，随着交联剂中peg-diester-dithiol含量的增加，细胞数逐渐增加，当交联剂中peg-diester-dithiol含量达到100％时，细胞达到最大值，这进一步证实了bmscs在这些混合水凝胶中也可以很好地生长。

由图7所示，随着交联剂中peg-diester-dithiol含量的增加，成骨分化逐渐增加，钙结节增加，而生长培养基中的细胞钙结节较少，这说明bmscs能在本发明提供的水凝胶材料中进行繁殖分化，这也进一步证实说明该类水凝胶材料能够用作组织工程3d支架。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。