雷藤舒在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及药物治疗学领域，具体涉及雷藤舒或其药物组合物在治疗非酒精性脂肪性肝病中的用途。
背景技术：
：雷藤舒((5r)-5-hydroxytriptolide，lldt-8)是中药雷公藤(tripterygiumwilfordiihook.f.twhf)有效提取成分雷公藤甲素(triptolide)的衍生物，它同样具有免疫抑制活性，但毒性更小。目前研究认为，雷藤舒抗炎作用主要是通过抑制th1型细胞因子(ifn-c,il-2)和炎性细胞因子(tnf-α,il-6)的产生；减少一氧化氮(no)的产生和诱导型一氧化氮合酶(inos)的表达等调控机制来实现。另外，雷藤舒被报道还具有抗肿瘤的生物学活性。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，nafld)属于非传染性流行病的一种。它的疾病谱包括最初的单纯的肝脏脂肪变性，到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，nash)以及更为严重的肝纤维化、肝硬化甚至是肝细胞癌(hcc)。由于nafld的发生与糖尿病、肥胖、高血压等代谢综合征密切相关，其发病机制仍未完全阐明，因此对于该种疾病的治疗尚无有效的上市药物。因此，本领域急需开发针对非酒精性脂肪性肝病的有效药物。技术实现要素：本发明的主要目的是提供雷藤舒的新的医药用途，即其在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的用途。其中，所述的非酒精性脂肪性肝病包括肝脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎。在所述用途中，雷藤舒作为scd-1转录抑制剂和/或脂肪酸β氧化相关基因(包括pparα，acadl，acadm，acox1，cpt1a)转录激活剂。本发明的一个目的是提供雷藤舒在制备作为scd-1抑制剂的药物中的用途。本发明的另一个目的是提供雷藤舒在制备作为脂肪酸β氧化激动剂的药物中的用途。本发明的再一目的是提供包含雷藤舒的药物组合物在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的用途，所述药物组合物包含药学上可接受的辅料。本发明的第一方面，提供了一种式i所示的化合物、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐或前药的用途，用于制备药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂用于：(a)抑制scd-1转录；(b)激活脂肪酸β氧化相关基因转录；和/或(c)治疗肝内脂质蓄积导致的肝脏疾病；在另一优选例中，所述肝内脂质蓄积导致的肝脏疾病选自下组：非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、药物性肝病、或其组合。在另一优选例中，所述的非酒精性脂肪性肝病选自下组：肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化。在另一优选例中，所述脂肪酸β氧化相关基因选自下组：pparα、acadl、acadm、acox1、cpt1a。在另一优选例中，所述药物组合物或制剂用作硬脂酰辅酶a去饱和酶-1(scd-1)转录抑制剂和/或脂肪酸β氧化相关基因转录激活剂。在另一优选例中，所述组合物或制剂用作硬脂酰辅酶a去饱和酶-1(scd-1)抑制剂。在另一优选例中，所述组合物或制剂用作脂肪酸β氧化激动剂。在另一优选例中，所述药物组合物中含有0.001-99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％的式i所示的化合物、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐或前药，按组合物的总重量计。本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：(a)式i所示的化合物、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐或前药；以及(b)药学上可接受的载体；所述药物组合物用于：(a)抑制scd-1转录；(b)激活脂肪酸β氧化相关基因转录；和/或(c)治疗肝内脂质蓄积导致的肝脏疾病。在另一优选例中，所述药物组合物为用于治疗肝内脂质蓄积导致的肝脏疾病的药物组合物。在另一优选例中，所述药物组合物为用于治疗非酒精性脂肪性肝病的药物组合物。在另一优选例中，所述药物组合物中含有治疗有效量的式i所示的化合物、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐或前药。在另一优选例中，所述药物组合物还包括：抗氧化剂、核受体fxr激动剂、pparα/δ双重激动剂、半胱天冬酶抑制剂、半乳糖凝集素抑制剂、ccr2/ccr5受体拮抗剂、或其组合。在另一优选例中，所述药物组合物中式i所示的化合物、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐或前药的含量为0.001-99wt％，较佳地为0.1-90wt％，更佳地为1-80wt％。在另一优选例中，所述肝内脂质蓄积导致的肝脏疾病选自下组：非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、药物性肝病、或其组合。在另一优选例中，所述的非酒精性脂肪性肝病选自下组：肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化。在另一优选例中，所述药物组合物用作硬脂酰辅酶a去饱和酶-1(scd-1)转录抑制剂和/或脂肪酸β氧化相关基因(包括pparα，acadl，acadm，acox1，cpt1a)转录激活剂。在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂、悬浮剂或乳剂。在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为口服剂型、经皮剂型、静脉或肌肉注射剂型。本发明的第三方面，提供了一种药盒，所述的药盒包括：(1)一容器，以及位于所述容器内的式i所示的化合物、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐或前药，以及药学上可接受的载体；以及(2)使用说明书，所述说明书记载了将所述式i所示的化合物、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐或前药用于选自下组的一种或多种应用：(a)抑制scd-1转录；(b)激活脂肪酸β氧化相关基因转录；和(c)治疗肝内脂质蓄积导致的肝脏疾病。在另一优选例中，所述肝内脂质蓄积导致的肝脏疾病选自下组：非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、药物性肝病等可导致脂肪肝的疾病。在另一优选例中，所述药盒还包括额外的治疗非酒精性脂肪性肝病的药物。本发明的第四方面，提供了一种治疗非酒精性脂肪性肝病的方法，所述方法包括：对需要治疗的对象施用治疗有效量的式i所示的化合物、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐或前药，或其药物组合物或制剂。本发明的第五方面，提供了一种体外非治疗性的抑制scd-1转录和/或激活脂肪酸β氧化相关基因转录的方法，所述方法包括步骤：在式i所示的化合物、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐或前药存在下，培养所述细胞，从而在所述细胞中抑制scd-1转录和/或激活脂肪酸β氧化相关基因转录。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1示出了雷藤舒对nafld模型小鼠肝组织的脂质蓄积及损伤的影响。a、肝组织切片的he染色结果；b、he染色结果的组织学评分；c、各组间肝组织内甘油三酯检测结果；d、各组间肝组织内胆固醇检测结果；e、各组间血清谷草转氨酶(ast)和谷丙转氨酶(alt)检测结果。*.p<0.05,**.p<0.01，***.p<0.001，与veh组相比。t检验分析(ttest)。图2示出了雷藤舒对肝组织scd-1mrna的影响。***.p<0.001，与veh组相比。t检验分析(ttest)。图3示出了雷藤舒对肝组织脂肪酸β氧化相关mrna(a-e)和氧化产物β-羟丁酸(f)的影响。脂肪酸β氧化相关mrna包括pparα(a)，cpt1a(b)，acadl(c)，acadm(d)，acox1(e)。*.p<0.05,**.p<0.01，***.p<0.001，与veh组相比。t检验分析(ttest)。具体实施方式本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现了雷藤舒(结构如式i所示)对脂质新生具有拮抗作用，对脂肪酸β氧化具有激动作用。进一步实验实验表明，所述式i化合物可以调控脂质新生和脂肪酸β氧化，从而调控肝内脂肪酸比例的变化和抑制甘油三酯蓄积，具有治疗非酒精性脂肪性肝病(nafld)的潜力。在此基础上，完成了本发明。具体地，本发明涉及雷藤舒或其药物组合物作为硬脂酰辅酶a去饱和酶-1(scd-1)转录抑制剂和/或脂肪酸β氧化相关基因转录激活剂而用于制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的用途。术语肝内脂质蓄积导致的肝脏疾病肝内脂质蓄积导致的肝脏疾病是指由于遗传及环境因素(酒精、药物、不健康饮食和生活习惯等)导致肝内脂质的蓄积，进而引起肝脏发生脂肪变性的相关疾病。雷藤舒及其衍生物雷藤舒是具有免疫抑制和抗肿瘤活性的雷公藤甲素低毒衍生物。其衍生物是对该化合物进行结构改造的一类化合物。非酒精性脂肪性肝病(nafld)非酒精性脂肪性肝病是由非酒精和其他明确的损伤肝组织的因素所造成的肝细胞内脂肪蓄积的，它的疾病谱包括最初的单纯的肝脏脂肪变性，到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，nash)以及更为严重的肝纤维化、肝硬化甚至是肝细胞癌(hcc)。脂质新生脂质新生(denovolipogenesis,dnl)，也叫脂肪从头合成，是指从乙酰辅酶a合成脂肪酸和甘油三酯的生物学过程。该过程的增加是导致nafld肝内脂质蓄积的重要原因之一。脂肪酸β氧化脂肪酸β氧化的降低也被报道是造成肝内脂质蓄积的重要原因之一。在nafld中，线粒体和过氧化物酶内的脂肪酸氧化受损，导致机体更倾向于利用葡萄糖作为燃料为机体提供能量，从而加剧肝内的脂质蓄积。脂肪酸β氧化受到一系列基因的调控，其中有些关键基因在nafld中表达都是降低的，因此针对这些基因增加脂肪酸β氧化是缓解肝内脂质蓄积，改善nafld的有效策略之一。硬脂酰辅酶a去饱和酶-1(scd-1)硬脂酰辅酶a去饱和酶-1(stearoyl-coadesaturase1，scd-1)是肝脂质新生末期的关键调控因子，因此该蛋白已成为nafld脂质蓄积的潜在靶点，虽然该蛋白在nafld中没有明显的增加，但已有研究证明调控其活性或抑制其mrna水平具有改善肝内脂质蓄积的作用。过氧化物酶体增殖物激活受体α(pparα)过氧化物酶体增殖物激活受体α(pparα)是调控脂肪酸β氧化的相关基因转录的关键核受体。其在nafld中表达下降。长链酰基辅酶a脱氢酶(acadl)长链酰基辅酶a脱氢酶(acadl)是负责催化长链脂肪酸β氧化的第一步反应。其在nafld中表达下降。中链酰基辅酶a脱氢酶(acadm)中链酰基辅酶a脱氢酶(acadm)是负责催化中链脂肪酸β氧化的第一步反应。其在nafld中表达下降。过氧化物酶酰基辅酶a氧化酶1(acox1)过氧化物酶酰基辅酶a氧化酶1(acox1)是负责过氧化物酶体内的脂肪酸β氧化反应。其在nafld中表达下降。肉毒碱棕榈酰基转移酶1a(cpt1a)肉毒碱棕榈酰基转移酶1a(cpt1a)是负责将脂肪酸从细胞质内转运到线粒体。其在nafld中表达下降。活性成分如本文所用，术语“本发明化合物”和“本发明活性成分”可互换使用，指式(i)所示的化合物。该术语还包括及式(i)化合物或其各种药学上可接受的盐。应理解，该术语还包括上述组分的混合物。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、2,2-二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、谷氨酸盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、萘二磺酸盐等。这些盐可通过已知的成盐方法由式i的化合物制备。如本文所用，术语“药学上可接受的前药”指在体外无活性，但能够在生物体内转化为式i所示活性物质，从而发挥其药理作用的化合物。本发明的式i化合物可采用现有技术中本领域技术人员熟知的方法进行制备，对各个步骤的反应参数没有特别限制。此外，本发明的典型化合物也可通过市售获得。雷藤舒抗炎作用主要是通过抑制th1型细胞因子(ifn-c,il-2)和炎性细胞因子(tnf-α,il-6)的产生；减少一氧化氮(no)的产生和诱导型一氧化氮合酶(inos)的表达等调控机制来实现。然而目前尚未有文献报道雷藤舒在治疗非酒精性脂肪性肝病(nafld)中的相关作用。用途由于本发明化合物具有显著改善小鼠肝内脂质蓄积的作用，因此，本发明化合物及其药学上可接受的无机或有机盐，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由肝内脂质蓄积导致的肝脏疾病。在本发明中，由肝内脂质蓄积导致的肝脏疾病的例子包括(但并不限于)非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、药物性肝病、或其组合。药物组合物和施用方法本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药学上可接受的盐及一种或多种药学上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-100mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)。用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。抑制scd-1转录本发明提供了一种体外非治疗性的抑制scd-1转录的方法，所述方法包括步骤：在式i所示的化合物、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐或前药存在下，培养所述细胞，从而在所述细胞中抑制scd-1转录。在另一优选例中，所述细胞为肝脏细胞。激活脂肪酸β氧化相关基因转录本发明提供了一种体外非治疗性的激活脂肪酸β氧化相关基因转录的方法，所述方法包括步骤：在式i所示的化合物、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐或前药存在下，培养所述细胞，从而在所述细胞中激活脂肪酸β氧化相关基因转录。在另一优选例中，所述细胞为肝脏细胞。本发明的主要优点在于：(1)雷藤舒(lldt-8)是基于传统中药雷公藤活性成分雷公藤内酯醇的经结构修饰改造后的全新结构衍生物。雷藤舒既保留了雷公藤内酯醇类的免疫抑制活性,同时也降低了雷公藤内酯醇类的毒性。(2)目前该化合物已完成160余例类风湿性关节炎患者参与的i期临床试验。发明人在前期的研究中发现雷藤舒可以抑制高糖高脂诱导的非酒精性脂肪肝小鼠的肝内脂质蓄积，提示该化合物有可能应用于肝内脂质蓄积的相关疾病的治疗，为其开拓了新的适应症。(3)本发明研究发现，雷藤舒可以通过抑制脂质新生和激活脂肪酸氧化来达到缓解肝内脂质蓄积的作用，因此多效应是其发挥作用的特点和优势之一。下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(sambrook和russell等人，分子克隆：实验室手册(molecularcloning-alaboratorymanual)(第三版)(2001)cshl出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。材料雷藤舒来自实验室自己合成。本文实施例中所用试剂及其它材料均可从市售渠道获得。实施例1：雷藤舒缓解nafld模型小鼠肝内的脂质蓄积和损伤本发明在高脂高糖饮食诱导的nafld的模型小鼠上，测试了雷藤舒对该模型小鼠肝内脂质蓄积和损伤的影响。实验表明，雷藤舒可以缓解nafld模型小鼠肝内的脂质蓄积，降低指示肝功能的两个重要指标ast和alt以及气球样变的肝损伤。1、实验原理：高脂高糖饮食诱导c57bl/6j是nafld的经典小鼠模型，可以相对模拟nafld的主要临床特征、生化指标的变化和形态学变化[biomedresint.2015:574832,2015]。本发明以该种诱导方案作为评价化合物抗2型糖尿病的动物模型。2、实验材料与方法1)动物来源：c57bl/6j小鼠购置于北京维通利华实验动物技术有限公司。2)动物培养条件：spf级动物房饲养；温度：22-24℃；湿度：45-80％；光照：150-300lx，12小时昼夜交替。其饲养，给药和处死均严格按照动物实验和福利的指导(参照上海市实验动物管理条例)3)动物分组与给药：c57bl/6j小鼠饲养于spf级动物房中，适应性驯养一周后，即8周龄时给予饮食诱导，诱导29周开始给药。nafld模型小鼠根据体重和血清ldlc的均值将小鼠分为空白对照组、受试物低剂量组和高剂量组，每组5只。各组小鼠每日早上7：00-9：00分别经口灌胃给予溶剂(0.1％dmso，veh组)，0.5mg/kg雷藤舒(lldt-8-l组)和1mg/kg雷藤舒(lldt-8-h组)。给药53天后解剖，取肝组织左侧叶的一半用10％的中性福尔马林液固定，制作石蜡切片，剩下的肝组织迅速冻到液氮，最终保存于-80℃冰箱里。4)观察指标：a、对小鼠肝内脂质蓄积的作用：观察肝脏切片经苏木精-伊红(he)染色后的细胞内脂质蓄积的程度和其他病变的变化情况、检测肝内甘油三酯和胆固醇的含量。a)苏木精-伊红(hematoxylin-eosinstaining，he)染色法：使用自动脱水机(thermo公司的excelsioras)，组织依次经过8道梯度酒精，3道二甲苯和3道石蜡按照设定预设程序进行脱水，脱水完毕将组织取出用自动包埋机(thermo公司的histostar)将组织制成蜡块，半自动切片机(thermo公司的shandonfinessee+)对蜡块进行薄切，制成切片。全自动染色片机(thermo公司varistaingeminies)进行染色，自动封片机(thermo公司shandonclearvue)进行封片。b)肝内甘油三酯和胆固醇的检测方法：将-80℃的肝组织取出，称重。加入钢珠和提取液(氯仿:甲醇＝2:1)，在匀浆机上进行匀浆(60hz，60s)，随后在摇床上混匀30min，4℃，2000g离心15min取上清，在65℃下挥发干有机溶剂，然后加入复溶剂(异丙醇:tritonx-100＝3:2)，涡旋溶解获得的样品可用于甘油三酯和胆固醇的检测。甘油三酯的检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，试剂盒名称为甘油三酯(tg)测定试剂盒(单试剂gpo-pap法)，参照试剂盒的方法检测；胆固醇的检测试剂盒购自美国英杰(invitrogen)生命技术有限公司，试剂盒名称为redcholesterolassaykit，参照试剂盒的方法检测。b、对小鼠肝损伤的作用：采用生化分析仪(罗氏cobasc501)检测血清里谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)，其中alt和ast的试剂盒也是采购于罗氏。c、数据处理和统计分析：数据以均值±标准差(mean±sem)表示，采用t检验对数据进行统计学分析。3、实验结果：c57bl/6j小鼠经高脂高糖饮食诱导36周后，肝内出现显著的脂质蓄积，从he染色结果看，表现为大泡性脂肪变性；同时有些肝细胞出现了气球样变，这指征着肝细胞出现损伤导致水分增多而引起肝细胞肿胀。而雷藤舒高剂量给药组可以显著的改善肝内的大泡性脂肪变性(图1a，b)、降低肝内的甘油三酯和胆固醇的含量(图1c，d)，最终降低指示肝功能的两个重要指标ast和alt以及气球样变(图1e)。实施例2：雷藤舒对nafld模型小鼠肝内脂肪酸种类和含量的影响本发明采用气相色谱-质谱联用技术检测实验动物肝内的脂肪酸种类和含量，比较雷藤舒给药组和溶剂对照组之间脂肪酸的差异，从雷藤舒对肝脏脂肪酸代谢的影响推断其抑制脂质蓄积的可能机制。研究结果表明，雷藤舒可显著性降低c16:1/c16:0脂肪酸的比例，c16:0/c18:2n6脂肪酸的比例，表征scd-1的活性和脂质新生被抑制。1、实验原理：有些脂质生成相关的酶的活性是可以通过脂肪酸的不同产物到前体的比例来预测，例如：scd-1的活性可以用c16:1n-7/c16:0脂肪酸的比例来表征；延长酶(elongase)可以用c18:0/c16:0脂肪酸的比例或c18:1n-7/c16:1n-7脂肪酸的比例来表征；δ5去饱和酶(delta-5-desaturase，d5d)可以用c20:4n-6/20:3n-6脂肪酸的比例来表征；δ6去饱和酶(delta-6-desaturase，d6d)可以用c18:3n-6/18:2n-6脂肪酸的比例来表征。除此之外，c16:0/c18:2n-6脂肪酸的比例还可以表征脂质新生的程度[metabolism.65:655-666.2016]。因此本发明采用检测小鼠肝内脂肪酸的种类和含量的不同来提示雷藤舒对脂质生成的酶的活性的影响。2、实验材料与方法(1)样品前处理：称量肝脏组织样品约10mg，加入500μl色谱纯甲醇溶液用组织破碎仪(qiagen，德国)进行匀浆(20hz，90s)三次，转移100μl匀浆液到5ml玻璃离心管中，然后加入20μl含有十七碳脂肪酸甲酯(1mg/ml)、二十三碳脂肪酸甲酯(0.5mg/ml)和bht(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)的内标液与1ml甲醇-正己烷混合液(v/v＝4:1)。将玻璃离心管放置于液氮中降温15分钟，加入100μl乙酰氯，继续在液氮中10分钟后在室温(25℃)暗室中反应24小时。向反应后的样品中加入2.5ml的6％k2co3中止反应。最后加入200μl正己烷萃取反应后的脂肪酸甲酯，800g离心10分钟后转移上清到玻璃管中。剩下的混合物重复用正己烷再萃取2次后，合并3次上清液并置于离心浓缩仪中除去正己烷，100μl正己烷复溶。(2)色谱条件：色谱柱为agilentdb225柱；进样口和fid检测器的温度均为230℃；升温条件是在55℃时保持1分钟，以30℃/分的速度升温到205℃保持3分钟，再以5℃/分的速度升温到230℃；进样量是1μl；分流比为1:30。(3)质谱条件：质谱离子源为ei，质谱采集模式为全扫描，扫描m/z范围为45-450，接口温度230℃，电子能量为70ev。(4)分析方法：agilentmasshunter定性软件分析脂肪酸种类，与标准品比对保留时间和质谱片段；内标法定量，用μmol/g为单位表示结果。(5)数据处理和统计分析：数据以均值表示，采用t检验对数据进行统计学分析。3、实验结果如下表所示，高剂量的雷藤舒可显著性降低c16:1/c16:0脂肪酸的比例，c16:0/c18:2n6脂肪酸的比例，这表征雷藤舒可以抑制scd-1的活性和脂质新生。表1各组间肝组织内脂肪酸含量检测结果实施例3：组织水平测试化合物雷藤舒对肝脏中scd-1的影响本发明采用实时定量荧光pcr技术检测化合物雷藤舒对肝组织中scd-1mrna的影响，研究结果表明：高剂量的雷藤舒可以显著抑制肝组织内scd-1的mrna。1、实验材料与方法：(1)肝脏组织中提取rna：精密称取10mg肝脏组织；在含10mg组织中的离心管中加入两颗钢珠，并加入1mltrizol，匀浆机匀浆；4℃，12000rpm离心5min，取上清移入新的1.5ml离心管中；加入200μl氯仿，颠倒混匀2min，静置5min，4℃，12000rpm离心10min；取400μl上层水相至干净的离心管中，加入200μl无水乙醇，混匀后，静置10min；将rna吸附柱放入收集管中，将上层水相和无水乙醇混合液移入rna吸附柱中，静置5min，4℃，10000rpm离心5min，倒去收集管中的废液；配制rpe混合液(rpe:无水乙醇＝1:4)，向吸附柱中加入500μlrpe混合液，静置2min，4℃，10000rpm离心30s，倒去废液；将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中，向吸附柱中加入50μldepc水溶解rna，静置5min，4℃，12000rpm离心2min，提取到的rna溶液置于-80℃保存。(2)实时定量荧光pcr：a、利用酶标仪检测抽提的rna浓度；b、将rna反转录为cdna，反转录体系(20μl)，见下表。反转录过程：①37℃，15min；②85℃，5s；③保持10℃。表2反转录体系rna样品1000ngprimescripttmrtmastermix(rr0361)4μldepc水upto20μlc、定量pcr：反应体系(每孔)见下表。表3定量pcr反应体系定量pcr过程：①50℃，2min；②95℃，20s；③95℃，5s；④60℃，30s；③-④循环40次。表4引物序列表基因引物序列(5’-3’)mscd-1正向引物ttcttgcgatacactctggtgc(seqidno.1)mscd-1反向引物cgggattgaatgttcttgtcgt(seqidno.2)mgapdh正向引物aggtcggtgtgaacggatttg(seqidno.3)mgapdh反向引物ggggtcgttgatggcaaca(seqidno.4)d、数据处理：采用2^-△△ct法。①△ct＝ct(目的基因)-ct(内参基因)；②-△△ct＝-(△ct(给药组)-△ct(溶剂组))；③对-△△ct进行2的幂运算，即2^-△△ct就得出给药组与溶剂组之间的倍数关系。数据以均值±标准差(mean±sem)表示，采用t检验对数据进行统计学分析。2、实验结果通过检测肝组织内scd-1mrna的水平，结果见(图2)表明：高剂量的雷藤舒可以显著抑制肝组织内scd-1的mrna。实施例4：组织水平测试化合物雷藤舒对肝脏中脂肪酸氧化的影响本发明采用实时定量荧光pcr技术和血清学生化检测化合物雷藤舒对肝组织中脂肪酸氧化关键基因mrna和氧化产物β-羟丁酸的影响，研究结果表明：高剂量的雷藤舒可以显著增加肝组织内脂肪酸氧化关键基因的mrna和血清中β-羟丁酸的含量。1、实验材料与方法(1)实时定量荧光pcr技术：见试验实施例3。表5引物序列表(2)对小鼠血清中β-羟丁酸的作用：采用生化分析仪(日立7020型生化分析仪)检测血清里β-羟丁酸的含量(北京万泰德瑞诊断技术有限公司)。(3)数据处理和统计分析：数据以均值±标准差(mean±sem)表示，采用t检验对数据进行统计学分析。2、实验结果通过检测肝组织内脂肪酸氧化关键基因mrna的水平，结果(图3a-e)发现：高剂量的雷藤舒可以显著增加肝组织内pparα、cpt1a、acox1、acadl、acadm的mrna；进一步检测血清内脂肪酸氧化产物β-羟丁酸的含量，结果(图3f)表明：高剂量的雷藤舒可以显著增加血清中β-羟丁酸的含量。总体而言，本发明发现雷藤舒作为scd-1转录抑制剂和脂肪酸β氧化相关基因转录激活剂，抑制脂肪酸的去饱和与脂质新生；增加脂肪酸的β氧化及血清内β-羟丁酸的含量，最终通过抑制脂质生成和促进脂质氧化分解来抑制肝脏内的脂质蓄积。因此，雷藤舒可用于制备治疗nafld的药物。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中国科学院上海药物研究所<120>雷藤舒在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用<130>p2019-0161<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ttcttgcgatacactctggtgc22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cgggattgaatgttcttgtcgt22<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aggtcggtgtgaacggatttg21<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggggtcgttgatggcaaca19<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agagccccatctgtcctctc20<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6actggtagtctgcaaaaccaaa22<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ctccgcctgagccatgaag19<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8caccagtgatgatgccattct21<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9taacttcctctcactcgaagcca23<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10agttccatgacccatctctgtc22<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tcttttcctcggagcatgaca21<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gacctctctactcacttctccag23<210>13<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13agggtttagttttgagttgacgg23<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14ccccgcttttgtcatattccg21<210>15<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15aggtcggtgtgaacggatttg21<210>16<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16ggggtcgttgatggcaaca19当前第1页12