本申请涉及医疗材料技术领域，尤其涉及一种可降解、多功能梯度的促骨生长复合膜、制备方法及应用。
背景技术：
引导骨再生的复合膜在介导骨再生研究中已经取得了一系列的进展。特别是可降解复合膜的出现，为骨种植材料的进一步临床应用与实现促骨生长支架材料的多功能化提供了基础。电纺膜的出现有效改善了传统gbr膜的一些缺陷：缺少三维空间结构，平铺成膜不能为骨细胞生长提供足够的生长、延伸、增殖空间；不能实现材料的多功能性。而支架材料是影响成骨细胞粘附、伸展、增殖以及分化的重要因素。骨组织工程现在面临的最大的挑战就是制备出具有完善功能的支架材料，比如：生物功能化、生物力学稳定性等。而多功能梯度电纺膜由于其特殊的化学组份和可调节的机械性能，为实现深入探究骨引导材料介导骨组织再生作用机理的研究提供了基础。三维多孔结构的电纺gbr膜能够很好的促进骨细胞增殖、分化，进一步提升骨再生量，目前已经应用于仿生支架材料的研究。
有鉴于此，有必要提供一种改进的促骨生长复合膜、制备方法及应用，以解决骨修复问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种促骨生长复合膜制备方法，以制备具有可降解医用植入材料、医用抗菌药物、成骨活性物质三者的优点，而且不同功能梯度的设计获得具有孔隙率从高到底的梯度结构，保证植入材料精准医疗的需求。
为实现上述发明目的，本发明具体提供一种促骨生长复合膜制备方法，包括如下步骤：
a.配制抗菌电纺前驱液，以医用可降解材料与有机溶剂配置的混合溶液作为溶剂，向溶剂中加入抗菌药物，搅拌使得所述抗菌药物充分溶解并形成均质溶液；
b.配置中间支撑层前驱液，在室温下，将医用可降解材料与有机溶剂以质量比为1:2～1:20进行混合；
c.配置促骨生长材料前驱液，以医用可降解材料与有机溶剂配置的混合溶液作为溶剂，向溶剂中加入促骨生长活性物质，并搅拌均匀；
d.将步骤a获得的抗菌电纺前驱液进行电纺丝；
e.采用步骤b获得的中间支撑层前驱液进行电纺丝；
f.采用步骤c获得的促骨生长材料前驱液进行纺电丝；
g.步骤f结束后，将获得的膜取出，进行干燥。
作为本发明的进一步改进，步骤a中，抗菌药物为抗生素类、或磺胺类、或咪唑类、或硝基咪唑类、或喹诺酮类药物。
作为本发明的进一步改进，步骤a中，抗菌药物的浓度范围被设定为1mm～100mm。
作为本发明的进一步改进，步骤a中，有机溶剂为三氟乙醇、或n,n二甲基甲酰胺、或二氯甲烷、或氯仿中的至少一种；步骤c中，有机溶剂为三氟乙醇、或n,n二甲基甲酰胺、或二氯甲烷、或氯仿中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，步骤a中，医用可降解材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、或聚已内酯、或聚丁二酸乙二醇酯、或聚乳酸中的至少一种；步骤c中，医用可降解材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、或聚已内酯、或聚丁二酸乙二醇酯、或聚乳酸中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，步骤a中，医用可降解材料与有机溶剂的质量比为1:1～1:20；步骤c中，医用可降解材料与有机溶剂的质量比为1:1～1:20。
作为本发明的进一步改进，所述步骤c中促骨生长活性物质为三磷酸钙、或镁替磷酸钙、或羟基磷灰石、或α-半水石膏中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，步骤c中，促骨生长活性物质与可降解材料的质量比范围为0.1％～10％。
作为本发明的进一步改进，步骤d、步骤e、步骤f中，电纺丝的条件为：使用配置2～8号注射针头的玻璃注射器盛放待纺液体，固定好装置；启动微量注射泵，调节速度为0.1ml/h～1.0ml/h，注射针头到接收器的距离10cm～30cm，高压直流电源设定为8kv～30kv，连续纺丝。
作为本发明的进一步改进，步骤g中，干燥方法包括通风橱挥发法、或溶剂室内自然挥发法、或真空干燥挥发法、或鼓风干燥挥发法。
为实现上述发明目的，本发明还提供一种由上述促骨生长复合膜制备方法制备的促骨生长复合膜。
为实现上述发明目的，本发明还提供一种促骨生长复合膜，包括
抗菌膜层，包括膜基质、承载于所述膜基质上的抗菌药物；
促骨生长膜层，包括膜基质、承载于所述膜基质上的促骨生长材料；
支撑膜层，位于所述抗菌膜层与所述促骨生长膜层之间。
作为本发明的进一步改进，抗菌膜层的孔径典型值小于5μm，支撑膜层的孔径典型值为5μm～20μm，促骨生长膜层的孔径典型值在10μm～40μm。
为实现上述发明目的，本发明还提供一种促骨生长复合膜在骨修复中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的促骨生长复合膜制备方法基于膜基质中添加生物活性材料，承载抗菌药物，提高骨再生能力以及抗感染能力；通过构筑具有功能梯度的三层结构薄膜，获得更加接近符合临床使用的gbr膜。
具体地，通过在医用可降解材料中加入了抗菌材料、促骨生长材料，因此由其制备所得的促骨生长复合膜具有可降解医用植入材料、医用抗菌药物、成骨活性物质三者的优点，而且不同功能梯度的设计获得具有孔隙率从高到底的梯度结构，保证植入材料精准医疗的需求。
具体实施例
以下将结合实施方式对本发明进行详细的描述，但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做的反应条件、反应物或原料用量上的变换均包含在本发明的保护范围内。
本申请的发明人在研究中发现，可降解的高分子材料具有较好的生物相容性和可塑性，但是单纯的可降解医用植入材料复合电纺膜在组织修复应用中同时存在着较弱的骨引导性能和较低的细胞响应等缺陷，很大程度上限制了电纺膜的临床应用；因此通过促骨细胞生物活性物质、抗菌药物等进行改性修饰，制备具有多功能性可降解梯度复合膜。
目前理想的gbr膜在组织修复应用中需具备生物可降解性、较好的力学性能等，并且在临床研究中发现，大面积的骨组织损坏一般伴随着炎症的威胁，阻碍了骨组织进一步修复。因此针对以上出现的问题，目前主要以下解决方案：(1)添加成骨活性物质：三磷酸钙、镁替磷酸钙、胶原等；(2)掺杂抗生素等药物，如洗必泰、盐酸甲硝唑等，降低炎症反应。
此外，骨损区局部炎症的存在严重影响了组织再生，基于此，抗生素作为一种有效的抗菌措施，通过掺杂、负载等手段，可以实现gbr膜具有局部抗菌性能，为组织再生提供了良好的环境基础。相对于口服给药而言，在损伤区局部缓释抗菌药物，能够有效达到抑菌效果，并且降低了口服药对人体的影响。
具体地，本发明提供一种促骨生长复合膜的制备方法，包括如下步骤：
a.配制抗菌电纺前驱液，以医用可降解材料与有机溶剂配置的混合溶液作为溶剂，向溶剂中加入抗菌药物，经过搅拌使得抗菌药物充分溶解并形成均质溶液。
其中有机溶剂为三氟乙醇、或n,n二甲基甲酰胺、或二氯甲烷、或氯仿中的至少一种。医用可降解材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、或聚已内酯、或聚丁二酸乙二醇酯、或聚乳酸中的至少一种。混合形成溶剂时，医用可降解材料与有机溶剂的质量比为1:1～1:20。
抗菌药物为抗生素类、或磺胺类、或咪唑类、或硝基咪唑类、或喹诺酮类等天然的或化学合成类的药物。抗菌药物的浓度范围被设定为1mm～100mm。
b.配置中间支撑层前驱液，在室温下，将医用可降解材料与有机溶剂进行混合，具体以质量比为1:2～1:20进行混合。
c.配置促骨生长材料前驱液，以医用可降解材料与有机溶剂配置的混合溶液作为溶剂，向溶剂中加入促骨生长活性物质。
其中，溶剂与步骤a中的溶剂相同；促骨生长活性物质为三磷酸钙、或镁替磷酸钙、或羟基磷灰石、或α-半水石膏中的至少一种；所述促骨生长活性物质与可降解材料的质量比范围为0.1％～10％。
d.采用步骤a获得抗菌电纺前驱液进行电纺丝；具体地，将步骤a获得抗菌电纺前驱液装入全玻璃注射器中，使用2～8号注射针头，固定好装置；启动微量注射泵，调节速度为0.1ml/h～1.0ml/h，玻璃注射器针头到接收器的距离10cm～30cm，调高压直流电源到8kv～30kv；连续纺丝，直至全玻璃注射器内抗菌电纺前驱液全部纺完；形成抗菌膜层，抗菌材料负载于医用可降解材料形成的支架上，使其具备抗菌功能。
e.采用步骤b获得的中间支撑层前驱液进行电纺丝，获得支撑膜层。其中电纺条件与步骤d一致，直至全玻璃注射器内中间支撑层前驱液全部纺完。
f.采用步骤c获得的促骨生长材料前驱液进行电纺丝，获得促骨生长膜层，促进骨修复，其中电纺条件与步骤d一致，直至全玻璃注射器内促骨生长材料前驱液全部纺完。
g.将最终制备好的功能梯度膜取出，进行干燥。干燥方法包括但不限于通风橱挥发法、或溶剂室内自然挥发法、或真空干燥挥发法、或鼓风干燥挥发法。
上述abcdefg仅为了方便描述，并不对步骤顺序进行限定。其中步骤a、步骤b、步骤c的顺序可以任意互换；步骤d、步骤e与步骤f中，步骤d和步骤f的顺序可以互换。例如一具体实施例中，步骤d结束后立刻换上步骤b的中间支撑层前驱液继续电纺丝；步骤e结束后立刻换上步骤c的促骨生长材料前驱液继续电纺丝。
本发明采用上述方法获得的促骨生长复合膜，基于膜基质中添加生物活性材料，承载抗菌药物，提高骨再生能力以及抗感染能力；通过构筑具有功能梯度的三层结构薄膜，获得更加接近符合临床使用的gbr膜。
具体地，上述方法中，步骤a、步骤c的溶剂与步骤b的成分相同，因此形成的三个膜层之间具有良好的兼容性，不会发生分层。并且，由于步骤a中加入了抗菌材料，步骤c中加入了促骨生长材料，因此由其制备所得的促骨生长复合膜具有可降解医用植入材料、医用抗菌药物、成骨活性物质三者的优点，而且由抗菌电纺前驱液进行电纺丝获得的抗菌膜层的孔径典型值小于5μm，由进行点纺丝获得的支撑膜层的孔径典型值为5μm～20μm，由进行电纺丝获得的促骨生长膜层的孔径典型值在10μm～40μm，不同功能梯度的设计获得具有孔隙率从高到底的梯度结构，保证植入材料精准医疗的需求。
本发明还提供一种促骨生长复合膜，包括依次排布的抗菌膜层、支撑膜层和促骨生长膜层。
其中，骨生长膜层包括膜基质、承载于所述膜基质上的促骨生长材料；该膜层与骨组织相接触，提高了促骨生长复合膜的骨修复性能。
所述抗菌膜层包括膜基质、承载于所述膜基质上的抗菌药物，该膜层与结缔组织相接触，具有抗菌性能，为组织再生提供了良好的环境基础；相对于口服给药而言，在损伤区局部缓释抗菌药物，能够有效达到抑菌效果，并且降低了口服药对人体的影响。
支撑膜层位于所述抗菌膜层与所述促骨生长膜层之间，为医用可降解材料复合膜层，弥补整体改性后膜的力学性能降低的缺陷。
本发明的促骨生长复合膜通过不同层的功能修饰，使植入材料能更加适应人体的微环境，同时增加材料整体的力学性能，提高材料的植入成功性；在骨修复中具有很好的应用。
另外，抗菌膜层的孔径典型值小于5μm，支撑膜层的孔径典型值为5μm～20μm，促骨生长膜层的孔径典型值在10μm～40μm，不同功能梯度的设计获得具有孔隙率从高到底的梯度结构，保证植入材料精准医疗的需求。
以下将以具体实施例对本发明的促骨生长复合膜的制备方法做进一步说明。
实施例一：
配制含11.5mm洗必泰(chx)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)/聚已内酯(pcl)纺丝溶液，用精密的分析电子电平称取0.7g的plga和0.3g的pcl和0.023g的chx放入20ml的样品瓶内，4ml三氟乙醇溶液。样品瓶内加入四氟磁力搅拌子，拧紧瓶盖，放在磁力加热搅拌器上12h，搅拌混匀溶液后静置30min。将配置好的4mlplga/pcl/chx纺丝溶液装入10ml全玻璃注射器中，使用6号注射针头，固定好装置。启动微量注射泵wz-50c6，调速0.6ml/h，玻璃注射器针头到接收器的距离16cm，调高压直流电源到16.5kv。连续不间断纺丝，直至全玻璃注射器内plga/pcl/chx纺丝溶液全部纺完。
这一层纺完后，加入事先配制plga/pcl纺丝溶液。其配置方法如下：用精密的分析电子电平称取0.7g的plga和0.3g的pcl放入20ml的样品瓶内，加入4ml2,2,2-三氟乙醇溶液。样品瓶内加入四氟磁力搅拌子，拧紧瓶盖，放在磁力加热搅拌器上12h，搅拌混匀溶液后静置30min。配置好的plga/pcl纺丝溶液装入10ml全玻璃注射器中，使用6号注射针头，固定好装置。启动微量注射泵wz-50c6，调速0.7ml/h，玻璃注射器针头到接收器的距离16，调高压直流电源到15.5kv。连续不间断纺丝，直至全玻璃注射器内plga/pcl纺丝溶液全部纺完。
这一层纺完后，加入事先配制含2.4％的三磷酸钙的plga/pcl纺丝溶液，其配置方法如下：用精密的分析电子电平称取0.7g的plga和0.3g的pcl和0.024g的β-tcp放入20ml的样品瓶内，加入4ml三氟乙醇溶液。样品瓶内加入四氟磁力搅拌子，拧紧瓶盖，放在磁力加热搅拌器上12h，搅拌混匀溶液后静置30min。将配置好的plga/pcl/β-tcp纺丝溶液装入10ml全玻璃注射器中，使用6号注射针头，固定好装置。启动微量注射泵wz-50c6，调速0.9ml/h，玻璃注射器针头到接收器的距离16cm，调高压直流电源到20.5kv。连续不间断纺丝，直至全玻璃注射器内plga/pcl/β-tcp纺丝溶液全部纺完。
将纺好的膜材料放入真空干燥箱中，于40℃烘干24h，备用。
实施例二：
配制含8mm甲硝唑(met)的聚乳酸(pla)纺丝溶液，用精密的分析电子电平称取0.0054g的met，1g的pla放入20ml的样品瓶内，加入4ml二氯甲烷溶液。样品瓶内加入四氟磁力搅拌子，拧紧瓶盖，放在磁力加热搅拌器上12h，搅拌混匀溶液后静置30min。将配置好的4mlpla/met纺丝溶液装入10ml全玻璃注射器中，使用5号注射针头，固定好装置。启动微量注射泵wz-50c6，调速0.5ml/h，玻璃注射器针头到接收器的距离15cm，调高压直流电源到18kv。连续不间断纺丝，直至全玻璃注射器内pla/met纺丝溶液全部纺完。
这一层纺完后，加入事先配制pla纺丝溶液。其配置方法如下：用精密的分析电子电平称取1g的pla放入20ml的样品瓶内，加入4ml的二氯甲烷溶液。样品瓶内加入四氟磁力搅拌子，拧紧瓶盖，放在磁力加热搅拌器上12h，搅拌混匀溶液后静置30min。配置好的4mlpla纺丝溶液装入10ml全玻璃注射器中，使用5号注射针头，固定好装置。启动微量注射泵wz-50c6，调速0.5ml/h，玻璃注射器针头到接收器的距离15cm，调高压直流电源到18kv。连续不间断纺丝，直至全玻璃注射器内pla纺丝溶液全部纺完。
这一层纺完后，加入事先配制含4％羟基磷灰石(ha)的pla纺丝溶液，其配置方法如下：用精密的分析电子电平称取1g的pla和0.04g的ha放入20ml的样品瓶内，加入4ml的二氯甲烷溶液。样品瓶内加入四氟磁力搅拌子，拧紧瓶盖，放在磁力加热搅拌器上12h，搅拌混匀溶液。混匀溶液后静置30min。将配置好的pla/ha纺丝溶液装入10ml全玻璃注射器中，使用6号注射针头，固定好装置。启动微量注射泵wz-50c6，调速0.5ml/h，玻璃注射器针头到接收器的距离15cm，调高压直流电源到18kv。连续不间断纺丝，直至全玻璃注射器内纺丝溶液全部纺完。
将纺好的膜材料放入真空干燥箱中，于40℃烘干24h，备用。
实例三：
配制含15mm罗红霉素(rhc)的聚丁二酸乙二醇酯(plla)纺丝溶液，用精密的分析电子电平称取0.063g的rhc和1g的plla放入20ml的样品瓶内，然后加入5ml的n,n-二甲基甲酰胺溶液。样品瓶内加入四氟磁力搅拌子，拧紧瓶盖，放在磁力加热搅拌器上12h，搅拌混匀后静置30min。将配置好的plla/rhc纺丝溶液装入10ml全玻璃注射器中，使用4号注射针头，固定好装置。启动微量注射泵wz-50c6，调速0.7ml/h，玻璃注射器针头到接收器的距离13cm，调高压直流电源到21kv。连续不间断纺丝，直至全玻璃注射器内plla/rhc纺丝溶液全部纺完。
这一层纺完后，加入事先配制plla纺丝溶液。其配置方法如下：用精密的分析电子电平称取1g的plla放入20ml的样品瓶内，加入5ml的n,n-二甲基甲酰胺溶液。样品瓶内加入四氟磁力搅拌子，拧紧瓶盖，放在磁力加热搅拌器上12h，搅拌混匀溶液，混匀溶液后静置30min。配置好的plla纺丝溶液装入10ml全玻璃注射器中，使用4号注射针头，固定好装置。启动微量注射泵wz-50c6，调速0.7ml/h，玻璃注射器针头到接收器的距离13cm，调高压直流电源到21kv。连续不间断纺丝，直至全玻璃注射器内plla纺丝溶液全部纺完。
这一层纺完后，加入事先配制含6％的三磷酸钙(cap)纺丝溶液，其配置方法如下：用精密的分析电子电平称取1g的plla溶液和0.06g的cap放入20ml的样品瓶内，加入5ml的n,n二甲基甲酰。样品瓶内加入四氟磁力搅拌子，拧紧瓶盖，放在磁力加热搅拌器上12h，搅拌混匀溶液后静置30min。将配置好的plla/cap纺丝溶液装入10ml全玻璃注射器中，使用6号注射针头，固定好装置。启动微量注射泵wz-50c6，调速0.7ml/h，玻璃注射器针头到接收器的距离13～20cm，调高压直流电源到21kv。连续不间断纺丝，直至全玻璃注射器内plla/ha纺丝溶液全部纺完。
将纺好的膜材料溶剂室内自然挥发法至质量恒重，备用。
实例四：
配制含25mm四环素(tac)的纺丝溶液，用精密的分析电子电平称取0.044g的tac和1g的pcl放入20ml的样品瓶内，然后加入4ml的n,n-二甲基甲酰胺溶液。样品瓶内加入四氟磁力搅拌子，拧紧瓶盖，放在磁力加热搅拌器上12h，搅拌混匀后静置30min。将配置好的pcl/rhc纺丝溶液装入10ml全玻璃注射器中，使用5号注射针头，固定好装置。启动微量注射泵wz-50c6，调速0.6ml/h，玻璃注射器针头到接收器的距离16cm，调高压直流电源到22kv。连续不间断纺丝，直至全玻璃注射器内pcl/tac纺丝溶液全部纺完。
这一层纺完后，加入事先配制pcl纺丝溶液。其配置方法如下：用精密的分析电子电平称取1g的pcl放入20ml的样品瓶内，加入4ml的n,n-二甲基甲酰胺溶液。样品瓶内加入四氟磁力搅拌子，拧紧瓶盖，放在磁力加热搅拌器上12h，搅拌混匀溶液，混匀溶液后静置30min。配置好的pcl纺丝溶液装入10ml全玻璃注射器中，使用5号注射针头，固定好装置。启动微量注射泵wz-50c6，调速0.6ml/h，玻璃注射器针头到接收器的距离16cm，调高压直流电源到22kv。连续不间断纺丝，直至全玻璃注射器内纺丝溶液全部纺完。
这一层纺完后，加入事先配制含2％的α-半水石膏纺丝溶液，其配置方法如下：用精密的分析电子电平称取1g的pcl溶液和0.02g的α-半水石膏放入20ml的样品瓶内，加入4ml的n,n二甲基甲酰。样品瓶内加入四氟磁力搅拌子，拧紧瓶盖，放在磁力加热搅拌器上12h，搅拌混匀溶液后静置30min。将配置好的pcl/α-半水石膏纺丝溶液装入10ml全玻璃注射器中，使用5号注射针头，固定好装置。启动微量注射泵wz-50c6，调速0.6ml/h，玻璃注射器针头到接收器的距离16cm，调高压直流电源到22kv。连续不间断纺丝，直至全玻璃注射器内pcl/α-半水石膏纺丝溶液全部纺完。
将纺好的膜材料于38℃真空干燥24h，备用。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本申请的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本申请的保护范围，凡未脱离本申请技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本申请的保护范围之内。