用于制备pH敏感双网络水凝胶的溶胶体系、水凝胶及应用的制作方法

本发明属于环境刺激响应型药物领域，具体涉及一种用于制备ph敏感双网络水凝胶的溶胶体系、水凝胶及应用。

背景技术：

眼睛是人类感官中最重要的器官，大脑中大约有80％的知识都是通过眼睛获取的。眼眶结构复杂，骨性眼眶容积约30ml，容纳眼球、肌肉、神经和血管等组织，毗邻眼睑、鼻窦、颅脑和面深部组织等结构。眶骨作为眼眶的重要组成部分，不仅具有保护眶内容物免受损伤的生理功能，同时对于维持颜面部的美容起到重要的作用。眼眶骨缺损可因面部创伤、肿瘤侵袭、先天性畸形或炎症性疾病引起，常导致视功能损害和面部畸形等严重后果。且缺损常发生在厚度仅为0.3-0.9mm的眶下壁和眶内壁，不能自行愈合，因此，适当和精准的眼眶骨修复和重建已成为亟待解决的临床难题。

眼眶重建旨在修复眶骨缺损，超临界骨缺损修复需要人为干预和支架材料的植入。目前常用的修复方法是将修复材料植入到骨缺损部位，钛网、多孔聚乙烯、聚吡咯烷酮、羟基磷灰石等多数材料因无法自体化而长久作为异物存留在骨缺损部位，存在感染、排异、囊肿、血肿、眼球内陷、眶下神经感觉减退等并发症的隐患。

组织工程技术的出现，为眶骨损伤的治疗提供了一种全新的思路和方法。美国国家科学基金会于1987年首次提出了“组织工程”(tissueengineering)的概念，而骨组织工程基本原理是将少量骨种子细胞经体外培养与可降解的生物材料相结合，从而构建出新的组织或器官，进而替代病变组织、达到修复缺损部位和重建生理功能的效果。

然而，组织工程生物材料的临床应用仍然面临着巨大的挑战，其中细菌感染是导致植入失败的常见原因。细菌可紧密附着在植入材料的表面，快速形成生物膜，既源源不断产生细菌毒素、蛋白等导致感染扩散，又阻挡了抗菌药物的治疗效果。例如，临床常见的诸如导管、接触透镜和人造关节等直接植入或接触的医疗装置上的细菌感染对患者的愈后质量产生不利影响，并导致高额的医疗费用。同时，许多研究表明，细菌感染微环境具有微酸、低氧、特异性细菌毒素等特征，因此启发人们构建环境刺激响应型药物搭载体系，基底材料在经历外部环境的温度、ph值、光照等刺激时发生结构改变，可适时、精准在病灶部位原位释放药物。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种ph敏感双网络水凝胶。

本发明所采取的技术方案如下：一种用于制备ph敏感双网络水凝胶的溶胶体系，包括丙烯酰胺化明胶、氧化海藻酸钠、光引发剂、庆大霉素、负载phenamil药物小分子的介孔二氧化硅纳米粒子。

丙烯酰胺化明胶与氧化海藻酸钠的质量比为1：1。

向混合溶液中加入介孔二氧化硅纳米粒子的浓度为1mg/ml。

丙烯酰胺化明胶通过以下过程制备得到：称取明胶溶于dpbs溶液中，配制10wt％的明胶溶液，恒温水浴锅37℃搅拌1h，使明胶充分溶解，以1ml/min的速度加入10ml甲基丙烯酸酐，50℃避光搅拌3h，加入在50℃水浴中预热好的dpbs溶液，终止反应，将上述溶液转移至截留分子量为3000da的透析袋，每隔6h换水，50℃、避光透析7d，透析好的溶液37℃、12000rpm高速离心10min，取上清液装入50ml离心管，-80℃冰箱过夜预冻，低温冷冻干燥48h，得到白色泡沫状丙烯酰胺化明胶。

氧化海藻酸钠通过以下过程制备得到：将海藻酸钠加入乙醇中，得到海藻酸钠-乙醇悬浮液，将高碘酸钠避光溶于水中得到高碘酸钠水溶液，将高碘酸钠水溶液加入海藻酸钠-乙醇悬浮液中，室温避光搅拌反应6h，加入与高碘酸钠等摩尔量的乙二醇，在剧烈搅拌状态下终止反应，反应结束后透析5d，直至无高碘酸钠，将产物放入在-80℃冰箱过夜预冻，低温冷冻干燥48h，得到白色棉花状氧化海藻酸钠。

介孔二氧化硅纳米粒子通过以下过程制备得到：将十六烷基三甲基溴化铵溶于水中，逐滴加入氢氧化钠溶液，搅拌至溶液完全澄清透明，逐滴加入1,3,5-三甲苯，80℃搅拌至溶液再次变得澄清透明，加入正硅酸乙酯，80℃搅拌2h，烘干得到白色粉末介孔二氧化硅纳米粒子。

上述的用于制备ph敏感双网络水凝胶的溶胶体系作为骨组织修复的应用。

一种ph敏感双网络水凝胶，由上述的用于制备ph敏感双网络水凝胶的溶胶体系在紫外光下进行光交联形成水凝胶得到。

上述的ph敏感双网络水凝胶作为组织工程支架材料在骨组织修复领域的应用。

本发明的有益效果如下：本发明提供了一种用于制备ph敏感双网络水凝胶的溶胶体系，该溶胶体系在紫外光照射下迅速由溶胶到凝胶，可以得到ph敏感双网络水凝胶，该水凝胶理化性能优、生物形容性好，能有效缓控释抗菌药物gs和促成骨分化药物phenamil，防止移植物早期感染，诱导c2c12细胞成骨分化，促进内源性骨再生。基于溶胶体系在紫外光照射下迅速由溶胶到凝胶相转变的特点，在实际应用中可以通过微创注射的方式原位成胶，可满足复杂眶骨缺损修复的要求，在眼眶修复重建中具有重要的价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1为(a)gel和gelma的ftir表征图，(b)alg和osa的ftir表征图；

图2为(a)msn的扫描电镜图，(b)msn的tem图；

图3为(a)gelma与osa不同配比水凝胶的成胶情况，(b)gelma与osa不同配比水凝胶对细胞存活率的影响(***p<0.001)；

图4为gelma-osa溶胶加入不同浓度msn的成胶情况(从左至右msn浓度依次为0、1、3、5、10mg/ml)，(a)正面观，(b)侧面观；

图5为gelma、osa和gelma-osa的ftir结果图；

图6为不同水凝胶的sem结果：(a、d)gelma，(b、e)gelma-osa和(c、f)gelma-osa/msn；

图7为(a)水凝胶成胶过程示意图，(b)gelma、gelma-osa和gelma-osa/msn水凝胶流变学测试结果；

图8为gelma、gelma-osa和gelma-osa/msn水凝胶在(a)ph＝7.4、(b)ph＝4.5的溶胀行为；

图9为gelma、gelma-osa和gelma-osa/msn水凝胶在(a)ph＝7.4、(b)ph＝4.5的降解率；

图10为gelma、gelma-osa水凝胶在(a)ph＝7.4、(b)ph＝4.5的gs体外释放行为；

图11为gelma-osa、gelma-osa/msn水凝胶在(a)ph＝7.4、(b)ph＝4.5的phenamil体外释放行为；

图12为(a-d)不同水凝胶与金黄色葡萄球菌共培养液涂板菌落计数结果,(e)不同水凝胶对金黄色葡萄球菌存活率的影响(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)；

图13为材料对大肠杆菌的抑菌环(a)gelma-osa水凝胶，(b)gelma-osa+gs(gs＝100μg/ml)水凝胶，(c)gelma-osa+gs(gs＝1000μg/ml)水凝胶；

图14(a-d)为细菌涂板结果，图14(e)为对应的定量分析结果；

图15为负载不同浓度phenamil水凝胶对c2c12细胞alp表达的影响(a)定性分析，(b)定量分析(***p<0.001)；

图16为负载不同浓度phenamil水凝胶对c2c12细胞成骨相关基因(a为coli,b为bsp)表达的影响(*p<0.05，***p<0.001)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

一、丙烯酰胺化明胶(gelma)的合成与表征

合成方法：称取10g明胶(gelatin，typea)溶于100mldpbs溶液中，配制10wt％的明胶溶液。恒温水浴锅37℃搅拌1h，使明胶充分溶解。以1ml/min的速度加入10ml甲基丙烯酸酐，50℃避光搅拌3h。加入100ml在50℃水浴中预热好的dpbs溶液，终止反应。将上述溶液转移至截留分子量为3000da的透析袋，每隔6h换水，50℃、避光透析7d。透析好的溶液37℃、12000rpm高速离心10min。取上清液装入50ml离心管，-80℃冰箱过夜预冻。低温冷冻干燥48h，得到白色泡沫状gelma样品。

gelma的傅里叶变换红外光谱(ftir)表征：ftir是基于物质分子中化学基团的振动(或转动)能级跃迁而产生的振-转光谱，因不同化学键或官能团的吸收频率不同，从而可通过不同基团的特征性吸收峰及其相对强度对待测物质的分子结构进行定性和定量分析。

本实验采用溴化钾压片法制样对gelma进行扫描测定。取适量的样品置于研钵里磨碎，再将干燥的溴化钾晶体按100∶1的比例与样品充分混合，研磨成细粉末。取适量粉末装入模具内，平整铺开，压片机压制成透明、厚度均匀的片状，迅速置于红外光谱仪中检测。分辨率为32cm^-1，测定范围为400-4000cm^-1.。

如图1(a)中所示，1640cm^-1的峰由n-h变形振动形成，归属于酰胺ⅱ特征峰，3350cm^-1的峰由n-h伸缩振动形成，归属于氨基峰。上述结果表明，明胶甲基丙烯酰胺化，形成酰胺键，并保留了部分氨基。

gelma的取代度测试：配制lmg/ml的gelma溶液，分别取100、200、300、400、500μl置于离心管中补水至1ml。加入1mlph＝8.5的nahco3缓冲液。再加入0.1％的tnbs溶液1ml，混合均匀后于40℃反应2h。加入0.5ml1mol/l的hcl溶液，用紫外分析仪检测346nm波长处的吸光度。以纯明胶溶液作为对照组，绘制吸光度值与浓度曲线，线性拟合明胶取代后和取代前曲线，得到直线斜率。

取代度＝[1—(取代后明胶的斜率/修饰前明胶的斜率)]×100％。

计算得，gelma的氨基取代度约为90.91％。

二、氧化海藻酸钠(osa)的合成与表征

合成方法:将5g海藻酸钠溶于25ml乙醇中(溶液i)，搅拌0.5h使其成悬浮状态。4.32g高碘酸钠(naio4)避光溶于25ml去离子水中(溶液ii)。将溶液ii加入到溶液i中，室温避光搅拌反应6h。加入与naio4等摩尔量的乙二醇，在剧烈搅拌(30min)状态下终止反应。反应结束后透析5d，直至无naio4。将产物放入50ml离心管中，-80℃冰箱过夜预冻。低温冷冻干燥48h，得到白色棉花状样品。

osa的ftir表征：取适量的样品置于研钵里磨碎，再将干燥的溴化钾晶体按100∶1的比例与样品充分混合，研磨成细粉末。取适量粉末装入模具内，平整铺开，压片机压制成透明、厚度均匀的片状，迅速置于红外光谱仪中检测。分辨率为32cm^-1，测定范围为400-4000cm^-1.。

如图1(b)所示1738cm^-1左右出现了由于c＝o伸缩振动形成的醛基峰，2820cm^-1对应c-h伸缩振动，证明海藻酸钠分子链上的羟基被部分氧化成醛基。

osa的氧化度测定：本实验通过测未被反应的naio4确定海藻酸钠的氧化度。具体步骤如下：取5ml反应溶液，加10ml10％的nahco3溶液。加入20％的ki溶液2ml，将碘置换出来15min。将释放出来的碘用硫代硫酸钠法滴定测定。测三次，取平均值，确定氧化度。计算的osa的氧化度约为70.92％。

三、介孔二氧化硅纳米粒子(msn)的合成与表征

msn的合成方法：称取1g十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶于480ml去离子水中，充分搅拌，使其完全溶解。逐滴加入3.5ml2m的氢氧化钠溶液，搅拌1h至溶液完全澄清透明。以1ml/min的速度逐滴加入7ml1,3,5-三甲苯，80℃搅拌3h至溶液再次变得澄清透明。加入5ml正硅酸乙酯(teos)，80℃搅拌2h。将上述溶液真空干燥箱80℃烘干，得到白色粉末状样品。

msn的扫描电子显微镜(sem)表征：sem主要利用二次电子信号发射成像来观察测试样品的表面形态与结构特征，是目前表征材料和细胞生物领域较常用的研究工具。取少量msns干燥固体粉末，粘于预先贴好导电胶的载物台上，倒扣、用洗耳球吹除多余的样品粉末，喷金，放入仪器进行扫描。如图2所示，观察到msn纳米粒子呈圆球形，尺寸均匀分布，单分散的msn平均直径为100±21nm。

msn的透射电子显微镜(tem)表征：tem是目前对材料进行精确表征的分析手段，它以比紫外光和可见光波长更短的电子束为光源，投射至待测物表面，高速电子束与待测样品原子发生碰撞，引起立体角散射现象，成像器件进一步以影像形式呈现出来。本实验我们取少量干燥msn固体粉末固定于铜网上，透射电镜观察该纳米粒子的尺寸、形貌及孔径等情况。如图2(b)所示，可观察到介孔结构，具有典型的六方排列的介孔通道。bet法测得msn的比表面积是985±187m²/g，msn的孔径是3.3±0.7nm，符合iupac对介孔材料的要求(2-50nm)。优良的比表面积和三维孔道结构有助于理想的药物负载与释放。

四、ph敏感双网络水凝胶

ph敏感双网络水凝胶合成过程：将gelma和osa配制含0.5％光引发剂omnirad2959的混合溶液，加入gs和负载phenamil药物小分子的msn，在365nm波长紫外光下进行光交联得到ph敏感双网络水凝胶。

1.gelma和osa的成胶比例的优化

分别按两者质量比为2:1、1:1、1:2的投料比来研究水凝胶的成胶情况。

如图3(a)所示，gelma和osa质量比为1:2时，成胶时间需要30min，成胶时间长，且水凝胶稀散不定形，稳定性差。随着gelma用量的增加，水凝胶成胶时间明显缩短(短至5min)，且形状固定，可从模具完整取下，触之较柔韧，有一定弹性。

如图3(b)所示，随着osa质量比例的增加，复合水凝胶的细胞毒性明显上升，可能由于osa的醛基所导致。osa中醛基的作用：一方面，需要足够的醛基去结合gelma的残余氨基，另一方面，反应完成后多余的醛基，由于其氧化作用，会引起细胞毒性，因此需要去除反应体系多余的醛基，随着培养时间延长，血清中的氨基酸等营养物质可中和多余醛基，材料的细胞毒性迅速降低。

2.msn浓度对成胶的影响

依次向gelma-osa混合溶胶体系中加入msn的浓度为0、1、3、5、10mg/ml，成胶情况如图4所示。结果表明，随着msn浓度的增加，水凝胶的紫外光交联效率逐渐降低。药物phenamil具有一定的细胞毒性，在确保具有成骨分化功能的同时，应降低phenamil的浓度，在前期研究中发现当phenamil浓度为20μm时可诱导成骨分化。药物phenamil不仅本身具有一定的促进c2c12细胞成骨分化的功能，同时还能增强骨形态发生蛋白(bmp2)的成骨分化功能，两者协同作用，有效促进alp的高表达，有望促进新生骨的形成。结合phenamil促成骨分化的浓度需求，水凝胶体系msn的浓度优选为1mg/ml。

3.gelma-osa双网络水凝胶的理化表征

3.1.ftir表征

对gelma、osa及gelma-osa固体样品进行了ftir检测，将冻干后的样品置于液氮中处理5min，取出迅速研磨成粉末状，加入kbr压片，制备样品，进行ftir检测。如图5所示，gelma-osa的特征性红外吸收光谱：3500cm^-1对应n-h伸缩振动，1640cm^-1对应c＝o伸缩振动，均归属于酰胺ⅱ键。同时，1730cm^-1处的醛基峰消失，证实gelma上的氨基和osa上的醛基发生了席夫氏碱反应生成了酰胺键。

3.2.sem表征

用sem对三种不同成分的水凝胶冻干后进行形貌观察，结果如图6所示，可以看到单纯的gelma水凝胶成多孔网络状结构，内壁光滑整齐，孔隙率高。随着osa的引入和反应，水凝胶网络状结构较前变得不规则，局部塌陷。随着msn的加入水凝胶网络状结构表面局部变得粗糙。

3.3.流变学测试

采用tadhr-2旋转流变仪来对水凝胶进行流变学检测，如图7所示，当剪切频率从0.1-100rad/s范围变化时，三种水凝胶的储能模量均大于损耗模量，且g’达到g”的10倍左右，为类固体行为，证明三种材料均为水凝胶，且制备获得的水凝胶具有良好的弹性。其中，未修饰gelma水凝胶的g’、g”均低于gelma-osa水凝胶和gelma-osa/msn水凝胶，说明经过改性交联的双网络结构水凝胶具有更加优异的机械性能。同时，应力扫描可以看到，三组水凝胶的g’、g”均可在一定范围内接近直线稳定趋势，表明水凝胶具有较为稳定的结构和适当的伸展性，能够承受一定范围内的剪切应力而不断裂。

3.4.溶胀率测试

对gelma、gelma-osa和gelma-osa/msn三种水凝胶在不同ph环境下的溶胀行为进行研究，结果发现，如图8(a)所示，当ph＝7.4时，gelma水凝胶在10h达到溶胀平衡，而gelma-osa和gelma-osa/msn水凝胶分别在6h、4h达到溶胀平衡，后两者达到溶胀平衡的时间明显短于前者，且gelma-osa水凝胶溶胀比最大，约为单纯gelma水凝胶的1.2倍。图8(b)中，ph＝4.5时三种水凝胶具有类似的溶胀行为，但gelma-osa和gelma-osa/msn水凝胶达到溶胀平衡的时间更快，平衡溶胀比更高，约为gelma水凝胶的1.4倍。结果表明，环境ph值改变对gelma水凝胶的溶胀率影响较小，而对gelma-osa基水凝胶的溶胀率有显著影响，进一步证实了该复合水凝胶的ph敏感特性。gelma-osa基水凝胶在不同ph条件下溶胀率的改变，是由于gelma与osa之间发生的席夫氏碱反应，易受ph的变化的影响，发生可逆反应。

表1不同水凝胶的的溶胀情况

3.5.降解率测试

理想的生物医用材料需要一定的降解性能，且降解速率既应满足移植物初期的支撑粘附作用，也应随新生细胞或组织的长入而适时降解。将三种不同组分的水凝胶分别静置于37℃的pbs缓冲液里(ph＝7.4)和mes缓冲液里(ph＝4.5)，研究其28d内的降解行为。如图9(a)所示，当ph＝7.4时，三种水凝胶的剩余重量比均随着时间的延长而降低。降解分为四个阶段，第一阶段：前24h，三种水凝胶的降解行为相似，重量的减少可能是由于未反应的明胶在37℃条件下溶解所致。第二阶段：14d内，三种水凝胶缓慢降解后，gelma基水凝胶的降解速率要稍高于gelma水凝胶，但从形态上观察，gelma水凝胶变得无固定形态，失去支撑作用，其整体支架结构发生破坏。水凝胶的降解可能是由于不稳定的酰胺键断裂所致。第三阶段：14-21d之间，gelma水凝胶降解速率急速增快，失重率达90％左右。而gelma-osa基水凝胶在此阶段降解速率虽然也增快，但其速率显著低于gelma水凝胶，到21d时，失重率约为30％左右。第四阶段：21-28d期间，gelma水凝胶继续缓慢降解，28d时失重率高于95％，gelma-osa基水凝胶降解速率高于第三阶段，到28d时，失重率约为65％。上述研究结果表明，在gelma与osa发生的席夫氏碱反应可延缓gelma的降解，结合新生骨的生长周期，长时间的材料支撑有助于新生骨的形成，因此gelma-osa基水凝胶更适合应用于体内骨缺损的研究。如图9(b)所示，当ph＝4.5时，gelma水凝胶降解趋势与ph7.4时类似，表明其降解性能受ph变化较小。而gelma-osa基水凝胶在72h内发生急速降解，失重率达到60％以上，接下来降解缓慢，到28d时降解失重率在85％左右。表明gelma-osa基水凝胶在酸性条件下，初始由席夫氏碱反应形成的酰胺键快速断裂，降解速率快，而后期osa本身降解速率低于gelma，因此gelma-osa基水凝胶28d的失重率低于gelma水凝胶。

4.体外药物释放实验

4.1.庆大霉素体外释放实验

如图10(a)所示，当ph＝7.4时，两种水凝胶在14d中gs的释放行为无明显差异，最高的药物累积释放量约为77.83％。然而当ph＝4.5时，如图10(b)所示，gelma与gelma-osa水凝胶中gs的释放趋势类似，但gelma-osa中gs的累积释放量明显高于gelma水凝胶，达到93.04％，证明gelma-osa水凝胶的ph敏感特性有利于gs的有效释放。在本实验中，双网络水凝胶作为药物gs的载体，而ph值则是药物释放的“开关”，酸性条件下，部分网络结构断裂，水凝胶迅速溶胀，gs迅速、高效地释放出来。同时，可以看到，gs在24h时内呈现爆发性释放，持续释放作用时间长达14d，可有效预防移植物早、中期感染。

4.2.phenamil体外释放实验

如图11所示。在中性的pbs缓冲溶液中，以物理共混形式添加到水凝胶中的phenamil呈缓慢持续释放，最大累积释放量为28.83％，而以msn形式负载再添加到水凝胶中的phenamil具有类似的释放方式，最大累积释放量约为36.92％，略高于物理共混形式。在酸性的mes缓冲液中，两种形式负载的phenamil累积释放量均高于中性溶液中，且以msn形式负载再添加到水凝胶中的phenamil具有更理想的药物释放行为：48h内快速爆发性释放，之后持续性高水平释放，最大累积释放量可达61.96％，时间长达28d。

结果表明msn能有效负载phenamil药物小分子，既可以保护药物小分子、防止降解过快，又具有优异的缓释作用，有效控制药物保持较高水平释放长达一个月，保证了phenamil与干细胞间的相互作用，进而诱导干细胞成骨分化，促进新生骨的形成。

5.体外药物抗菌实验

5.1.gelma-osa-gs水凝胶对金黄色葡萄球菌的杀菌性能评价

将材料放置于均匀涂布细菌的营养琼脂平板中间，由于材料中药物的扩散，对材料周围的细菌产生抑制和杀灭作用，造成材料周围形成一个肉眼可见的透明环状区域，用刻度尺测量材料边缘到透明环之间的距离，得到抑菌环大小，便可定性评估材料的抗菌性能。抑菌环越大，说明材料中释放的药物浓度越高，对细菌的抑制和杀灭作用越强。如表2所示，单纯水凝胶对金黄色葡萄球菌无杀灭作用，而随着载药体系的gs浓度的升高(从100μg/ml到1000μg/ml)，抑菌圈明显增大，抗菌作用越强。

表2水凝胶对金黄色葡萄球菌的的抑菌环大小

5.2.金黄色葡萄球菌平板菌落计数结果

将细菌与材料37℃共培养，于不同时间点取培养液涂板、隔夜菌落计数，得到如下结果，图12(a-d)为细菌涂板结果，共培养时间4h以内，空白对照组和材料对照组的培养液均可孵育出大量金黄色葡萄球菌菌落。加入gs浓度为100μg/ml水凝胶组的第2h培养液未孵育出明显的细菌菌落，加入gs浓度为1000μg/ml水凝胶组的第1h培养液未孵育出明显的细菌菌落。

对三组金黄色葡萄球菌的菌落进行计数和统计分析，得到如图12(e)所示的菌落数定量分析结果。空白对照组显示了细菌在pbs缓冲液、37℃培养箱中随着培养时间延长的自然死亡情况，单纯材料组与之类似，gs浓度为1000μg/ml水凝胶组1h内完全杀灭细菌。

6.gelma-osa-gs水凝胶对大肠杆菌的杀菌性能评价

6.1.大肠杆菌的抑菌环结果

对于大肠杆菌，图13(a)中肉眼可见单纯材料周围形成一个并非绝对透明的抑菌环，而进一步在显微镜下观察发现环状区域内仍有大量细菌存在，由此推测gelma-osa复合水凝胶本身对大肠杆菌具有一定的抑制作用，而非直接杀灭。图13(b)中的抑菌环在显微镜下的观察结果和图13(a)类似，推测水凝胶中添加的gs量(100μg/ml)并不足够杀死全部大肠杆菌。而当gs量增加到1000μg/ml时，如图13(c)，可以看到一个较大、边界清晰、透明的抑菌环，说明此浓度条件下的gs对大肠杆菌有一个良好的杀灭作用。

表3水凝胶对大肠杆菌的的抑菌环大小

6.2.大肠杆菌平板菌落计数结果

将不同成分的水凝胶与大肠杆菌共培养，于不同时间点取培养液涂板、隔夜菌落计数，得到如下结果，图14(a-d)为细菌涂板结果，图14(e)为对应的定量分析结果。结果表明，在前4h内，除空白对照组细菌的自然死亡外，材料对照组以及负载100μg/mlgs的水凝胶组均未表现出对大肠杆菌的明显杀灭作用，4h大肠杆菌存活率仍高达50％。当水凝胶中gs的加入量为1000μg/ml时，取第1h材料与细菌共培养液涂板，未孵育出明显的大肠杆菌菌落，第1h大肠杆菌存活率接近0％，可有效抑制大肠杆菌感染。

通过上述实验可得，gelma-osa-gs水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有杀灭作用，且对金黄色葡萄球菌的抗菌效果更好；当水凝胶中添加的gs浓度达到1000μg/ml时，对两种细菌的抗菌效果均较为理想，可有效避免常见的移植物感染致病菌的侵袭。

7.碱性磷酸酶(alp)表达

以gelma-osa/msn水凝胶为空白对照组，gelma-osa/msn水凝胶+bmp2为正对照组，空白对照组、phenamill组(40μm)和phenamilh组(100μm)均未见明显的alp表达，随着bmp2的加入，alp染色少量表达。当gelma-osa/msn-phenamilh组加入bmp2时，alp表达量显著上升。表明phenamil和bmp2具有协同作用，能有效促进alp的表达。图15(b)为alp的定量分析结果，和定性结果一致。含bmp2组alp表达量显著高于对照组，而含phenamil水凝胶组(l&h)均表现出对bmp2显著的增强作用，与之前单纯药物组结果一致。结果表明，将phenamil载入水凝胶后，并不影响phenamil促干细胞成骨分化的功能。

8.成骨相关基因表达

如图16所示为不同水凝胶对c2c12细胞成骨相关基因(coli,bsp)表达的影响。细胞培养7d后，与gelma水凝胶相比，gelma-bmp2、gelma-phe和gelma-phe-bmp2水凝胶均可促进coli(成骨分化的早期基因)的表达，且有显著性差异。表明bmp2与phenamil均可促进coli的表达，且gelma-phe-bmp2组coli的表达量是gelma-bmp2的5.5倍。对于干细胞成骨分化中后期表达的基因，gelma-bmp2、gelma-phe-bmp2组的表达量显著高于gelma组。上述结果表明，含bmp2组水凝胶可促进c2c12细胞的成骨分化，且phenamil可显著增强bmp2的成骨分化功能，与alp表达结果一致。

通过以上实施例及相关性能检测可以说明本发明所提供的水凝胶体系理化性能优、生物形容性好，能有效缓控释抗菌药物gs和促成骨分化药物phenamil，防止移植物早期感染，诱导c2c12细胞成骨分化，促进内源性骨再生。同时，基于材料在紫外光照射下迅速由溶胶到凝胶相转变的特点，可以通过微创注射的方式原位成胶，可满足复杂眶骨缺损修复的要求，在眼眶修复重建中具有重要的价值。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。